专利名称：产生具有二碱基b链末端的胰岛素类似物的方法
产生具有二威基B链末端的胰岛素类似物的方法
描述
本发明涉及制备具有二碱基链末端的胰岛素的方法，这是通过生物技 术制备其前体，以及随后在具有赖氨酸酰胺(lysinamide)或精氨酸酰胺 (argininamide)，或者由保护基修饰的赖氨酸或精氨酸的S^l催化连接反应 中转化，以及任选地随后水解，以给出该胰岛素。
世界上大约1亿7千7百万的人患有糖尿病。这包括大约1千7百万 的I型糖尿病，对于这些患者而言，替换缺陷的内分泌的胰岛素分泌是现 今唯一可能的治疗方法。这些受感染的患者终生依赖于一天通常几次的胰 岛素注射。II型糖尿病与I型糖尿病相反，不总是缺乏胰岛素，但是在很 多病例中，特别是在晚期，用胰岛素治疗(根据需要与口服抗糖尿病药组 合)被认为是最有利的治疗类型。
在健康人中，胰岛素释放严格匹配血糖浓度。血糖水平升高(例如饭 后发生的那些)由相应的胰岛素分泌升高来迅速补偿。在禁食状态中，血 浆胰岛素水平下降到基线值以足以确保葡萄糖持续供应给胰岛素敏感性器 官和组织以及在夜间保持低的肝葡萄糖产量。外源，通常皮下施用胰岛素 代替内源胰岛素分泌一般无法接近上^糖的生理调节质量。通常会过高 或过低地调节血糖水平，其最严重的形式会威胁生命。但是，此外，常年 的升高的血糖水平会产生(即使没有初始症状)相当大的健康风险。在美 国大规才莫的DCCT研究(The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329， 977-986 )明确证明了长期升 高的血糖水平充分作用于后期糖尿病并发症的t艮。后期的糖尿病并发症 以及在一些情形中的微血管和大血管损伤会表现为视网膜病变、肾病或神 经病并且导致失明、肾衰竭以及截肢，并且与心血管病症的增加的危险相 关。由此可以推断改进的糖尿病疗法的首要目的是将血糖尽可能接近地保持在生理范围内。强化胰岛素治疗策略希望通过一天几次注射速效和长效 胰岛素制品来实现这一目标。在用餐时间给予速效制剂以补偿血糖的餐后 升高。长效基础胰岛素希望确保胰岛素的基本供应，特别是在夜间，同时 避免导致低血糖。
胰岛素是包含51个氨基酸的多肽，所述氨基酸被分成2个氨基酸链 具有21个氨基酸的A链和具有30个氨基酸的B链。所述链由2个二硫桥 连接在一起。已经使用了很多年的胰岛素制品用于糖尿病治疗。此外，不 仅使用了天然存在的胰岛素，最近也使用了胰岛素衍生物和类似物。
胰岛素类似物是天然存在的胰岛素(即人胰岛素或动物胰岛素)的类 似物，其与相应(或者完全相同)的天然存在的胰岛素的不同之处在于由 其它氨l^酸残基替换了至少一个天然存在的氨基酸残基和/或添加/缺失了 至少一个氨基酸残基。例如US 5,656,722描述了 des-Phe^"-胰岛素衍生物。 已经添加的和/或替换的氨基酸残基也可以是天然不存在的氨基酸残基。
胰岛素衍生物是天然存在的胰岛素或胰岛素类似物的衍生物，其中已 经由官能团替换了 一个或多个氮基酸残基和/或A和/或B链的N或C末端。 官能团选自酰胺残基、胺残基、氣基残基、烷基残基、醇残基和烷氧基残 基。
有效的胰岛素疗法使用所谓的基本胰岛素。这意思是使得緩慢持续释 放外源施用的胰岛素成为可能的制剂。以这种方式，在漫长的时期内达到 体内的基线胰岛素浓度，其对于患有糖尿病的患者的生理病况有有利影响。
关于这一点，重组胰岛素类似物Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)人胰岛 素(甘精胰岛素)是著名的，因为仅需要每24小时供应给机#——即仅一 天一次——以实现基础作用。 一天一次施用改善了生活质量。改善的生理 状况导致例如Hbalc水平的减少并且可以预期由于该改善，使得即使有糖 尿病的后期后遗症，也会相当的靠后，从而使得可能延长相关的糖尿病患 者的预期寿命。
对于该胰岛素类似物的要求是相当高的。由于糖尿病患者的数量持续 增加，有更多的经济兴趣来减少制^^目应类似物的花费。US 5,656,722描
7述了通过前胰岛素原融合蛋白的可能的胰岛素类似物的制备，所述前胰岛 素原融合蛋白由融合部分("前部分")和猴的胰岛素原变体组成。描述的
类似物之一在第A (21)位包含甘氨酸而非天冬酰胺。相应的融合蛋白是 用于制备甘精胰岛素的肽前体变体。方法提供了通过与胰蛋白酶反应来从 该融合蛋白缺失前部分和C肽。EP-A 0 668 292描述了这样的融合蛋白， 其按照相同的原理，但是允许甘精胰岛素通过优于US 5,656,722的方法来 制备。就此而言，本领域技术人员很清楚特别是在胰岛素B链和C链的边 界处部分切割是可能的，所述边界是由二碱基结构Arg-Arg所定义的，并 且所述部分切割产生了 B31单-arg人胰岛素类似物。必需从实际的目的化 合物中移除这一错误的产物。这导致显著的产量损失。可以如下避免该问 题重组制备胰岛素原以及其与特异性内切蛋白酶(例如赖氨酰内肽酶) 的反应，以及将得到的des-B30人胰岛素(类似物)在半合成肽化学方法 中与三肽Thr-Arg-Arg反应。EP-A 0 132 769和WO 2003/044210描述了 在反应过程中保护三肽反应基团的需要。反应后消除保护基。伴随这一途 径的花销是由于化学合成制备三肽和引入保护基。因此，希望有这样的方 法，其允许待制备的Arg(B31)， Arg(B32)-胰岛素类似物来自Arg ( B31) 人胰岛素前体。
德国专利申请号No. 10 2005 046 113.1 (未7>开)描述了这样的方法， 其包括具有C-末端酰胺化的M酸被胰蛋白酶催化地连接到其C末端氨 基酸由赖氨酸或精氨酸组成的肽上。在该情形中观察到的产量令人惊讶地 4艮高并且此外可能不用带上保护基来实施该偶联反应。该反应在非水性介 质中发生。现在已经令人惊讶地发现精氨酸酰胺或赖氨酸酰胺与B31胰岛 素类似物的偶联可能具有高产量。还可能令人惊讶地控制反应因此优先形 成Arg(B31)， Arg(B32)-人胰岛素酰胺形式的胰岛素类似物或者Arg(B31)， Lys(B32)-人胰岛素酰胺形式的类似物。而且该产量大于60%。可以通过反 应结束时的酸性水解来消除酰胺基。同样令人惊讶地发现作为赖氨酸酰胺 或精氨酸酰胺的备选物在反应中使用可能具有保护基的精氨酸或赖氨酸是 可能的。可以作为实例提及的保护基为叔丁氧羰基(Boc)或二甲氧基苯
8基丙基氧基羰基(DZZ)。由于在文献中有描述，特别地，被保护的精氨 酸衍生物可以在多种溶剂中是不稳定的，本领域技术人员很清楚会继续发 展出在肽化学中具有改善的稳定性作用的新的保护基。通过根据保护基或 酰胺基团改变反应条件来对产量产生正面影响是可能的。这是本领域技术 人员熟知的并且本发明也涉及此。在从前胰岛素原前体中制备甘精胰岛素 或相当的Arg(B31)， Arg(B32)-胰岛素类似物中(US 5,656,722 )部分切割产 物B (31)人胰岛素因此有效用于制备有价值的产物。在该情形中，相应 的融合蛋白不需要细胞内制备。本领域技术人员很清楚也可以通过细菌表 达，然后分泌到周质和/或分泌到培养上清液中来制备胰岛素原类似物。欧 洲专利申请EP-A 1 364 029通过实施例描述了这一方法。本发明还涉及使 用Arg (B31)-人胰岛素前体，其在从此类细菌方法表达后直接产生。
此外，本发明同样涉及方法的另一技术方面。欧洲专利申请 EP-A 0 347 781 ，以及欧洲专利申请EP-A 1 364 030和EP-A 1 364 032描 述了用于制备高产量孩吏小胰岛素原(miniproinsulin )的基于酵母的方法。 扩展此类方法或类似的方法以制备微小胰岛素原允许这些^:小胰岛素原在 切割成二-链胰岛素后被立即转化成Arg(B31)， Arg(B32)-胰岛素类似物，所 述孩史小胰岛素原在第A21位具有在美国专利5,656,722中描述的氨基酸残 基，即Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Phe、 Trp、 Met、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asp或Glu。
如果如EP-A 1 364 032中所述的，通过融合蛋白发生表达，最好不用 胰蛋白酶或类似的内切蛋白酶消除前部分。相反，掺入为不切割胰岛素衍 生物的特异性内切蛋白酶所识别的切割位点，来适当地消除前或融合部分。 以实例方式提及了肠激酶(DDDDK)或Xa因子(IEGR)。本发明也涉 及此。而且技术人员清楚可以在一锅反应中进行这两个切割反应。另一可 能性是仅在随后的步骤中消除融合部分。在该情形中，可以将融合蛋白部 分选为大量有效分泌的蛋白质的衍生物。对于细菌可以提及的实例是 DHFR (二氢叶酸还原酶)、谷胱甘肽S-转移酶和蛭素。可以用于酵母分 泌的实例是清蛋白或其衍生物、超氧化物歧化酶或其衍生物、白细胞介素2或其衍生物，以及蛭素或其衍生物。在本申请中，例如，蛭素衍生物净皮 用作为融合部分用于细菌表达和用于酵母表达。关于这一点已经令人惊讶 地发现，可以进一步通过引入连续的組氨酸的肽序列和/或DDDDK肽序列
(代表肠激酶的识别位点)来修饰蛭素序列，而不会负面影响微小胰岛素 原部分的折叠。因此亲和层析的方法可以是有效的。本发明也涉及此。
本领域技术人员还熟知下述事实即举例描述的表达系统仅代表一小 部分的开发用于蛋白质的重组制备的宿主/载体系统。允许制备靶肽的宿主 /栽体系统因此也构成了本发明的部分。
本发明因此涉及制备胰岛素类似物，其特征在于存在氨基酸残基 Arg(B31)， Arg(B32)或Arg(B31)， Lys(B32),所述氨基酸残基来自与精氨酸 或赖氨酸经由胰蛋白酶催化连接的类似物的Arg (B31)-人胰岛素前体。 就此而言，本领域技术人员很清楚，由于反应的令人惊讶的选择性，也可 以在多个反应循环中重复连接反应，从而使得可获得在第B31位和B32位 之外具有另 一碱性氨基酸赖氨酸或精氨酸的胰岛素类似物。这通过以下来 实现进行偶联反应、脱酰胺化或脱保护末端氨基酸，并且在适当的后续 反应循环中再次使用该产物。此类产物同样可以通过使用已经具有 Arg(B31)， Arg(B32)或Arg(B31)， Lys(B32)的类似物作为前体来获得。同样 可能制备在B31位及其后包含任何遗传可编码的氮基酸的类似物，其在序 列上不必是精氨酸或赖氨酸，但是其C-末端的特征在于二碱基序列 Arg画Arg、 Arg-Lys、 Lys-Lys或Lys-Arg。而且该反应不卩艮于4吏用月夷蛋白 酶作为催化剂。本领域技术人员了解，除了已知的可商购大鼠、牛、猪或 人胰蛋白酶或其它同功酶或其衍生物或变体外，也可能使用下列酶组织 蛋白酶、来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum )和来自链霉菌属
(Streptomyces )(灰色链霉菌(S. griseus )、脱叶链霉菌(S. exfoliatus )、 红霉素链霉菌(S. erythraeus )、弗氏链霉菌(S. fradiae )和微白黄链霉 菌(S. albidoflavus))的胰蛋白酶、类胰蛋白酶、mastin、顶体蛋白、激 肽释放酶、hepsin、前列腺蛋白酶I (prostasinl)、赖氨酰内肽酶(溶素 -C)和内切蛋白酶Arg-C (梭菌蛋白酶)。
10本发明因此涉及制备胰岛素类似物或其衍生物的方法，其中，
被酰胺化或用保护基c-末端保护的天然存在的碱性氨基酸或包含天 然存在的碱性氨基酸或其类似物或衍生物并且c-末端被酰胺化或者用保 护基保护的肽，在具有胰蛋白酶的生物学活性的酶存在时被添加
到其a和/或B链的c-末端M酸选自天然存在的、碱性氨基酸或其 类似物或衍生物的初始胰岛素类似物或其衍生物上，到所述c-末端氨基酸
之一上，
基酸或所添加的肽的酰胺基团或c-末端保护基。
本发明还涉及上述方法，其中胰岛素类似物的特征在于通式I:
s
s
R1 -(A1 -A5)-Cys-Cys-(A8-A10)-Cys-(A12-A19)-Cys-A21 -R2 (A-链)
s
s
s — s
(I)
R3-B1-Val-B3-Gln誦His陽Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B26)曙B27-B28-B29-B30-R4-R5 (B-链)
其中含义是
(Al-A5)人胰岛素或动物胰岛素的A链第Al至A5位中的氨基酸残
基，
(AHA19)人胰岛素或动物胰岛素的A链第Al2至Al9位中的^J^ 酸残基，
A21 天然存在的氨基酸残基，
(B8-B18) 人胰岛素或动物胰岛素的B链的第B8至第B18位中的氨 基酸残基，
(B20-B26)人胰岛素或动物胰岛素的B链的第B20至第B26位中的氨基酸残基，
(A8-A10) 人胰岛素或动物胰岛素的A链第A8至A10位中的氣基酸 残基，
B30化学键或天然存在的氨基酸残基， Bl 化学键或天然存在的氨基酸残基， B3 天然存在的氨基酸残基， B27、 B28
和B29天然存在的氛基酸残基， Rl氨基或1至3个天然存在的氨基酸残基， R2氛基或1至3个天然存在的氨基酸残基， R3氨基或1至3个天然存在的氨基酸残基，
R4化学键或1至3个天然存在的氨基酸残基，其中C-末端存在的氨
基酸残基代表碱性氨基酸，
R5 l或2个碱性氨基酸残基，其C末端是自由的或酰胺化的， 其中其C末端与R5的N末端相连的氨基酸残基选自天然存在的碱性
氨基酸。
本发明还涉及上述方法，其中初始胰岛素类似物特征在于通式II S- S
R1 一(A1 -A5)-Cys-Cys-(A8-A10)-Cys-(A12-A19)-Cys-A21 -R2 (A-链) |
S- S S 一 S (II)
R3-B1-Val-B3-Gln-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30-R4 (B-链)
其中R1、 (A1画A5)、 (A8画A10)、 (A12-A19)、 A21、 R2、 R3、 Bl、 B3、 (B8-B18)、 (B20-B26)、 B27、 B28、 B29、 B30和R4如权利要求1所定义的，并且B链的C末端氨基酸残基选自天然存在的碱性氨基酸。
本发明还涉及上述方法，其中天然存在的碱性氨基酸(其被酰胺化或
者用保护基进行C末端保护)是C-末端酰胺化的精氨酸或用Boc保护基
C-末端保护的精氨酸。
本发明还涉及上述方法，其中经修饰的胰岛素类似物为Gly(A21),
Arg(B31)， Arg(B32)人胰岛素，其B链的C末端被酰胺化，初始胰岛素类
似物特别是Gly(A21)， Arg(B31)人胰岛素。
本发明还涉及上述方法，其中初始胰岛素类似物通过重组表达前体蛋
白质来制备，所述前体蛋白质包含初始胰岛素类似物的A链和B链，所述
方法特别是这一类型的方法，其中作为复制子一部分的基因被表达。 本发明还涉及上述方法，其中使用细菌或酵母作为宿主细胞。 本发明还涉及上述方法，其中前体蛋白质在表达后被分泌，特别是其
中前体蛋白质分离自细菌或酵母的细胞上清液。
本发明还涉及上述方法，其中前体蛋白质分离自细菌周质。 本发明还涉及上述方法，其中对如任何所述权利要求中所述获得的前
体蛋白质实施折叠过程和S^1切割。
本发明还涉及上述方法，其中初始胰岛素类似物通过重组定向表达制备。
本发明还涉及上述方法，其中具有胰蛋白酶生物学活性的酶选自人胰 蛋白酶、猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶以;^A胰蛋白酶、猪胰蛋白酶和牛胰蛋 白酶的变体。
本发明还涉及上述方法，其中经修饰胰岛素类似物的B链的C末端随 后在水解反应中被脱保护。
本发明还涉及上述方法，其中获得的胰岛素类似物是Gly(A21)， Arg(B31)， Arg(B32)人胰岛素。
本发明还涉及胰岛素类似物或其衍生物作为药物的用途，所述胰岛素 类似物或其衍生物的A和/或B链的C末端M酸被酰胺化。
本发明还涉及通过上述方法可获得的胰岛素类似物或其衍生物，所述
13胰岛素类似物或其衍生物的A和/或B链的C末端M酸被酰胺化。
下面通过一些方法实施例更详细地解释了本发明。这些方法实施例没 有限制作用。
实施例1:在体外折叠后从融合蛋白制备Arg(B31)，Gly(A21)胰岛素。 美国专利5,663,291在其中的实施例1中描述了获得下述结构的正确折 叠的胰岛素融合蛋白。
MATTSTGNSA RFVNQHLCGS HLVEALYLVC GERGFFYTPK TRREAEDPQV GQV'ELGGGPG AGSLQPLALE GSLQKRGIVE QCCTSICSLY QLENYCG (SEQ ID NO.: 1)
根据美国专利5,227,293的实施例V，通过与胰蛋白酶反应，将这一材 料转化成二-链胰岛素，并且分离Arg(B31), Arg(B31)， Gly(A21)胰岛素和 Arg(B31)， Gly(A21)胰岛素。
因此可能直接获得Arg(B31)， Arg(B31)， Gly(A21)-胰岛素类似物，尽管 在与经修饰的精氨酸或赖氨酸的胰蛋白,化的连接中可以使用 Arg(B31)， Gly(A21)副产品作为前体。
实施例2:从通过分泌获得并且包含正确折叠的胰岛素原的融合蛋白 制备Arg(B31)， Gly(A21)胰岛素。
作为实施例l的备选，也可以通过在细菌系统中分泌制备融合蛋白。在 这一情形中，作为融合蛋白部分的胰岛素原结构被正确折叠，并且可以省 却"体夕卜，，重折叠步骤。专利申请WO02/068660建议了这一类型的系统。例 如，如果在该国际专利申请的实施例1中描述的质粒pBpfuHirJns中将 Asn(A21)的密码子替换成Gly(A21)的密码子，结果是这样的融合蛋白，从 其中可以获得甘精胰岛素(作为举例)，而且可以分离Arg(B31),Gly(A21) 人胰岛素作为副产品，如实施例l中所述的。
为了制备该序列，需要具有下述结构的新引物insu一a21—gly_rev:
5'- IMIIIAAGCTTGTCGACTCATTAGCC GCAGTAG丌CTCCAGCTG-3' (SEQ ID NO.: 2)与专利申请WO 02/068660类似4吏用该引物，在PCR中在质粒 pBpfuHir—ins的DNA上用引物pful。可以从PCR产物分离能够根据专利申 请WO02/068660的实例克隆的BamHl/Hind3片段。在表达后，分离融合蛋 白并且根据本申请的实施例l进一步对其进行处理。
本领域的技术人员很清楚也可以通过融合蛋白的细菌分泌直接获得前 体Arg(B31)， Gly(A21)人胰岛素。本发明也涉及此。
实施例3:通过与精氨酸酰胺偶联从Arg(B31)， Gly(A21)-前体制备 Arg(B31)， Arg(B32)， Gly(A21)曙胰岛素。
将100mg的21A-Gly-30B ( L-Arg-胰岛素)溶解在0.95 ml的精氨酸酰 胺溶液中(446 g/L)，并且添加0.13 ml的M乙酸钠緩冲液(pH 5.8)和2 ml的 DMF 。将反应混合物冷却到12°C并且通过添加0.094 ml的胰蛋白酶 (0.075 mg,罗切诊断公司(Roche Diagnostics ))来起始。
在8小时后，通过添加TFA至pH2.5将反应终止，并且通过HPLC分析。 形成> 60%-Arg(B31)， Arg(B32)， Gly(A21)人胰岛素。添加胰蛋白酶抑制剂 溶液，然后与US5，656，722类似纯化酰胺化类似物。然后在存在酸时将酰胺 化胰岛素类似物水解几小时以给出Arg(B31)， Arg (B32)， -Gly(A21)人胰岛 素。
实施例4:通过与赖氨酸酰胺偶联从Arg(B31)， Gly(A21)人胰岛素前体 制备Arg(B31)， Lys(B32)， Gly(A21)人胰岛素。
将IOO mg的21A-Gly-30B (L-Arg-胰岛素)溶解在0.93 ml的赖氨酸酰 胺溶液(400 g/L)中，并且添加0.13 mL的M乙酸钠緩冲液(pH 5.8)和2 ml的 DMF 。将反应混合物冷却到12。C并且通过添加0.094 ml的胰蛋白酶 (0.075 mg，罗切it断7/^司(Roche Diagnostics ))来起始。
在8小时后，通过添加TFA至pH2.5将反应终止，并且通过HPLC分析。 形成Arg(B31)， Lys(B32)-NH2， Gly(A21)人胰岛素并且与US 5，656，722类似 在添加胰蛋白酶抑制剂溶液后将其纯化。然后在存在酸时将酰胺化胰岛素 类似物水解几小时以给出Arg(B31)， Lys (B32)， Gly(A21)人胰岛素。
实施例5:通过与H-Arg (Boc)2-OH偶联从Arg(B31)， Gly(A21)前体
15制备Arg(B31)， Arg(B32)， Gly(A21)-胰岛素
将0.25 mg的Arg(B31)， Gly(A21)人胰岛素在Eppendorf容器中与 11 jal的0.1M乙酸吡啶(pyridine acetate)緩冲液(pH 5.6)、 60 pl的130 g/L 的在0.1M乙酸吡咬緩冲液(pH 5.6 )中的H-Arg(Boc)2-OH x HC1的溶液 以及119 ]iil的DMF混合，并且在12。C与胰蛋白酶(罗切诊断公司(Roche Diagnostics))赙育数小时。
将反应通过添加25%的水、25%的乙腈和50%的三氟乙酸的混合物来 终止。将混合物冻干，消除保护基，溶解在lml的TFA中，并且在室温 下静置大约3小时。通过举例，与US 5，656，722类似进行Arg(B31)， Arg(B32)-NH2， Gly(A21)人胰岛素的纯化。
实施例6:通过与H - Lys (Boc)-OtBu偶联从Arg(B31)， Gly(A21)前体 制备Arg(B31)， Lys(B32)， Gly(A21)胰岛素
将50 mg的Arg(B31)， -Gly(A21)人胰岛素溶解在0.62 ml的 H-Lys (Boc)-OtBu溶液(0.5 g/mL， pH5)中，并且添加l ml的N，N-二甲基甲 酰胺(DMF)。将混合物冷却到12。C并且添加2mg的胰蛋白酶(罗切诊断 (Roche Diagnostics))。
在超过10个小时后，通过添加2ml的50。/。强度的乙腈/水混合物和lml 的TFA(100。/。)来终止反应。将混合物冻干，并且消除Boc保护基，溶解在 lml的TFA中，并且室温下静置约3小时。例如，与US 5，656，722类似地， 进行Arg(B31)， Lys(B32)， OH纯化。
实施例7:用于通过面包酵母分泌蛭素Arg(B31)， Gly(A21)胰岛素融合 蛋白的基因序列
专利申请EP-A 1 364 032提出了蛭素作为融合伙伴蛋白用于在酵母中 表达和分泌有价值的其它可药用目的蛋白的用途。
专利申请EP-A 1 364 032的实施例1描述了用于制备融合蛋白的宿主-载体系统，所述融合蛋白由蛭素衍生物和微小胰岛素原组成。该系统可以 用于例如通过US5，656，722中描述的氨基酸制备微小胰岛素原，其在第A21 位为氨基酸天冬酰胺。与专利申请EP-A 1 364 032的实例类似地，构建表达载体，如果引物 insncolrev被替换并且被设计使得第A21位密码子被改变。
为了制备编码Arg(B31)， Gly A(21)人胰岛素的序列，例如合成下列引
物
ins—gly—a2 l_rev
5'-TTTTTTCCATGGGTCGACTATCAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG-3' (SEQ ID NO.: 3)
在该情形中引物完全覆盖编码胰岛素类似物的氨基酸A15-A21的基因 区段。将本引物与来自所述申请实施例1的SEQ ID NO: 4的引物组合，并 且使用质粒pADH2Hir—ins作为模板，允许通过PCR生成DNA片段，所述 DNA片段在用限制酶KpnI和NcoI消化后，被插入到相应打开的表达载体中 并且包含想要的融合蛋白。
栽体被称作pADH2Hir—ins—glyA21。根据专利申请EP-A 1 364 032表达 并且处理融合蛋白，以给出Gly(A21)-微小胰岛素原，其根据实施例2被转 化为Arg(B31)， Lys(B32)， Gly(A21)人胰岛素。
实施例8:用于通过面包酵母直接分泌Arg(B31)， Gly(A21)前体的基因
序列
描述在实施例7中的质粒pADH2Hir—ins—glyA21的DNA被用于制备用 来直接分泌Arg(B31)， Gly A(21)人胰岛素的栽体构建体。 合成下列引物。 a一iiisfl
5'- TTTTTTGGATCCTTTGGAATAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3' (SEQ ID NO.: 4)
其覆盖a-因子的C末端(Lys-Arg的密码子)和微小胰岛素原序列的N-末端的序列。
ins—gly一rev25' - mill CCAT GGGTCGCTAT CAGCCACAGT AGTTTTCCAG CTGG -3' (SEQ ID NO.: 5)
引物与克隆到质粒pADH2Hir—ins—glyA21中的胰岛素类似物序列的3， 端杂交。PCR(标准条件)生成DNA片段，所述DNA片段在用限制酶KpnI 和NcoI消化后，被插入到对应打开的表达载体中并且包含想要的融合蛋白。 转化酵母菌林Y79的感受态细胞。随后按照实施例7所i^达转化体。通过 已知方法(EP-A 0 229 998)分离Arg(B31)， Gly(A21)-微小胰岛素原，并且将 其如实施例2所述转化为Arg(B31)， Lys(B32)， Gly(A21)人胰岛素。
实施例9:用于通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris )分泌蛭素-Arg(B31)， Gly(A21)人胰岛素融合蛋白的基因序列
与专利申请EP-A 1 364 032的实施例4类似进行表达栽体的克隆。在本 案中使用引物ins—gly—rev2而非序列引物pichia—H—Irev2,所述ins—gly—rev2 引物随后使得用PCR产物表达Gly(A21)人胰岛素成为可能
5'-丌TTTGGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCACAGTAGTnTCCAGCTGG — 3' (SEQ ID NO.:6)
得到的质粒被称作pPich—Hir—ins-GlyA21 。如所述纯化Arg(B31)， Gly(A21)-微小胰岛素原作为起始材料用于产生具有二碱基链末端的类似 物。
实施例10:用于通过巴斯德毕赤酵母直接分泌Arg(B31)， Gly(A21)前体 的基因序列
类似于实施例7构建适当的表达载体。需要质粒pPich—Hir_ins-GIyA21 和两条引物pich—insgly—dirf与pich—insgly—dirrev的DNA。
18pichjnsgly一dirf
5'-TTTTTTCTCGAGAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3' (SEQ ID NO.: 7) pich_insgly_dirrev
5'-TTTTTT GGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCAC-3' (SEQ ID NO.: 8)
实施例ll:从融合蛋白制备Arg(B31)， Gly(A21)-胰岛素，所述融合蛋
白通过酵母分泌获得，包含正确折叠的胰岛素原，并且其融合部分包含HiS6
絲餅列
质粒pADH2Hir—ins_glyA21的DNA作用为模板。合成两条引物 a—LT—H6—hirf和a—LTJH6—hirrev
a_LT_H6_hirfl:
5 - GCACCATCATCACCATCACTATACTGACTGCACTGAATC -3' (SEQ ID NO.: 9)
该引物包含6个串联的组氨酸以及Refluda,序列的^J^酸3-8和9(部 分)的密码子。
a—LT—H6—hirf2:
5- GAAGGGGTACCTTTGGATAAAAGACTTACGCACCATCATCACCATCAC -3' (SEQ ID NO.: 10)
该引物包含串联的6个组氨酸的密码子、来匹卢定序列的氨基酸1和 2和a-因子序列(包括Lys-Arg加工位点)的密码子，并且覆盖限制酶Kpnl 的识别位点。在标准PCR中，质粒pADH2Hir—ins—glyA21的DNA作用 为模板，引物为a—LT—H6—hirfl和来自本申请实施例7的ins—gly_a21—rev。 分离反应产物并且将等分试样用作模板用于第二次PCR，其中引物为 a—LT—H6_hirf2和ins—gly—a21—rev。如所述用KPN1和Ncol加工反应产 物，然后克隆。结果是质粒pADH2JLTJI6—Hir—ins—glyA21:然后用质粒 的DNA转化Y79，表达融合蛋白。通过离心将细胞从上清液分离，并且 通过膜滤器(例如来自萨图林^^司(Sartorius))，然后通过N产亲和层析，其后是Invitrogen ProBondTM纯化系统的步骤来浓缩上清液。在通 过透析和/或过滤或作为备选的凝胶过滤移除洗脱緩冲液后，以已知方式处 理融合蛋白以给出Arg (B31)， Gly (A21)人胰岛素，然后转化为甘精胰岛素。 实施例12: 从融合蛋白制备Arg (B31), Gly (A21)人胰岛素，所述融 合蛋白通过酵母分泌获得，并且包含正确折叠的胰岛素原，并且其融合蛋 白用肠激酶消除
质粒pADH2Hir—ins_glyA21的DNA用作为起始材料。使用来自本发 明实施例7的引物ins—gly—a21_rev和来自申请WO 02/070722 Al的实施 例l的hirfl。为jt匕目的，制备两^f的引物
Hir_entero—insf
5'- CTTCAG GACGATGACGATAAATTTGTTAACCAACACTTGTGTGG-3' (SEQ ID NO.: 11)
引物覆盖微小胰島素原序列的氨基酸Bl-B7和B8 (部分)，并且包含 氨基酸序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的密码子，其代表肠激酶的识别位点。
Hir—entero—insrev 5'- TTTATCGTCATCGTCCTGAAGGCTGAAGGTATTCCTCAGGG-3' (SEQ ID NO.:
12)
反向？l物覆盖来匹卢定序列的氨基酸60-65 ，并且包含M酸序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO.:13)的密码子，其代表肠激酶的识别位点。 首先用引物对hirfl/Hir一entero一insrev和Hir—entero—insf/ins—gly一a21—rev 进行两个PCR。分离反应产物。混合材料的等分试样并且在第三个PCR 中使用该混合物作为引物对hirfl/ ins—gly—a21—rev的模板。如所述克隆反 应产物。结果是载体pADH2Hir—ins—glyA21。如所述制备融合蛋白。
用肠激酶切割融合蛋白。该酶是可商购的。
20切割反应在肠激酶緩冲液(20mM Tris/HCl， 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 pH7.4)中，使用对应于特定厂商信息的一定量的酶进行。切割通 常在移除宿主细胞以及后续工作组(workup)步骤后发生。但是，在调整 了最优反应条件后，其也可以在发酵后在上清液中直接发生。
实施例13:从融合蛋白制备Arg(B31)，Gly (A21)人胰岛素，所述融合 蛋白已经通过酵母分泌获得，并且包含正确折叠的胰岛素原，并且其融合 部分被用肠激酶消除并且包含多聚组氨酸序列。
使用质粒
pADH2LT—H6—Hir—ins—glyA21的DNA和引物Hir—entero—insrev， Hir—entero—insf和ins—gly—a21—rev ，并且$ 1物hiril被具有下述序列的引 物a—lt一enterof所替换
5'- GAAGGGGTACCTTTGGATAAAAG — 3' (SEQ ID NO.: 13)
然后，与实施例12类似，构建载体 pADH2—LT—H6—Hir_etero—ins_glyA21，其编码融合蛋白，所述融合蛋白 的蛭素融合部分从N末端第3位开始被6个组氨酸所延伸，并且在C末端 从第72位^Uf列DDDDK (SEQ ID NO.: 14)所延伸。
然后通过组合实施例11和12中描述的方法制备Arg(B31)， Gly(A21) 人胰岛素。
实施例14:通过面包酵母分泌蛭素des-Phe (Bl)， Arg(B31)， Gly(A21) 胰岛素融合蛋白的基因序列
类似于实施例7进行转化和表达。
合成两条引物序列
Desphefl:
5'-CTTCAGGGAAATTCGGCACGAGTTAACCAACACTTGTGTGGTTC-3' (SEQ ID NO.: 15)
和Desphe_revl:5'-GAACCACACA AGTGTTGGTT AACTCGTGCC GAA丌TCCCT GAAG-3' (SEQ ID NO.: 16)
来自实施例7的质粒pADH2Hir_ins—glyA21的DNA作用为模板。彼 此独立进行两个聚合il^式反应。在反应1中，使用引物Desphe—revl和 来自申请EP-A 1 364 032的实施例1的引物SEQ ID NO: 4，在反应2中使 用来自本申请实施例7的ins—gly—a21—rev和引物Desphefl。分离两个.反应 的反应产物并且在第三个反应中组合产物的等分试样，将其用作引物对的 模板，所述引物对由来自申请EP-A 1 364 032的实施例1的引物SEQ ID NO: 4和ins_gly_a21—rev组成。如实施例7中所述，将第三个反应的反应
产物克隆、转化并且表达。将得到的融合蛋白用作为起始材料用于制备相 应的具有二碱基链末端的胰岛素类似物。
实施例15:通过面包酵母分泌蛭素Ala (B31)， Arg(B32), Gly(A21)胰岛 素融合蛋白的基因序列。 合成两条引物序列 Ala—b31fl:
5'-CTTC亍ACACTCCAAAGACGgctCGTGGTATCGTTGAACAATG丌G-3' (SEQ ID NO.: 17)
和Ala—b31 revl: NO.: 18)
来自实施例7的质粒pADH2Hir—ins_glyA21的DNA作用为模板。彼 此独立进行两个聚合Sl^式反应。在反应1中，使用引物Ala—b31revl和 来自申请EP-A 1 364 032的实施例1的引物SEQ ID NO: 4，在反应2中使 用来自本申请实施例7的引物ins_gly—a21—rev和引物Ala—b31fl。分离两 个反应的反应产物并且在第三个反应中组合产物的等分试样，将其用作引 物对的才莫板，所述引物对由来自申请EP-A 1 364 032的实施例1的引物 SEQ ID NO: 4和ins—gly_a21—rev组成。如实施例7中所述，将第三个反应的反应产物克隆、转化并且表达。将得到的融合蛋白用作为起始材料用 于制备相应的具有二碱基链末端的胰岛素类似物。
实施例16:通过面包酵母直接分泌Lys(B31)前体的基因序列
合成两条引物
Lys一b31f
5'-CTTCTACACTCCAAAGACGAAAGGTATCGTTGAACAATGTTG-3' (SEQ ID NO.:
19)
和Lys一b31rev
5'-CAACATTGTT CAACGATACC TTTCGTCTTT GGAGTGTAGA AG -3 (SEQ ID NO.:
20)
来自申请WO 02/070722A1的实施例1的质粒pADH2Hir—ins的DNA 用作模板用于两个聚合酶链式反应。在反应1中，使用引物Lys—b31fl和 insncolrev(SeqlDNO:6，来自WO 02/070722Al)，并且在反应2中，使 用引物Lys—b31rev和来自本申请实施例7的a—insfl。进行标准反应并且 分离得到的PCR片段。组合两次产物的等分试样并且将其用作模板用于第 三个反应，其引物为insncolrev和来自WO 02/070722A1的S叫IDNO:6。 如实施例8所述克隆并且表达获得的PCR片段。结果是Lys(B31)-微小胰 岛素原，用赖氨酰内肽酶将其转化成B(l-29) - A(l-21)分裂胰岛素(split insulin)并且作为制备B30-精氨酸酰胺胰岛素或B30赖氨酸酰胺-胰岛素的 中间体，所述B30-精氨酸酰胺胰岛素或B30赖氨酸酰胺-胰岛素可以随后 被转化为各自的二碱基类似物。
实施例17:用赖氨酰内肽酶切割
如DE3844211所述，将胰岛素前体与赖氨酰内肽酶(LEP)反应(实 施例1)。为此目的，将10 mg的Lys(B31)-微小胰岛素原溶解在Tris緩冲 液(pH 8.0)中，并且添加来自产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes )的LEP (0.01ml的浓度为lmg/ml的水中的溶液，默克生物科学公司 (Merckbiosdences ))。在室温温育2小时，并且通过RP-HPLC (Nucleosil 120-5柱)纯化。结果是B(l-29) — A(l-21)分裂胰岛素。实施例18:通过与精氨酸酰胺偶联从B(l-29)-A(l-21)分裂胰岛素前体 制备Arg(B30)-胰岛素。
将IOO mg的B(l-29) - A(l-21)分裂胰岛素溶解在0.95 ml的精氨酸酰胺 溶液(446 g/L)中，并且添加0.13 ml的M乙酸钠緩冲液(pH 5.8)和2 ml的 DMF 。将反应混合物冷却至12。C并且通过添加0.094 ml的胰蛋白酶 (0.075 mg，罗切诊断公司(Roche Diagnostics ))来起始。
在8小时后，通过添加TFA至pH2.5将反应终止，并且通过HPLC分析。 形成〉60。/。-Arg(B30)-胰岛素酰胺。添加胰蛋白酶抑制剂溶液，然后与US 5，656，722类似纯化酰胺化类似物。然后在存在酸时将酰胺化胰岛素类似物 水解几小时以给出Arg(B30)胰岛素，或者该酰胺可以直接用作为药物。
实施例19:通过与赖氨酸酰胺偶联从B(l-29)-A(l-21)分裂胰岛素前体 制备Lys(B30)-胰岛素。
将IOO mg的B(l-29) - A(l-21)分裂胰岛素溶解在0.93 ml的赖氨酸酰胺 溶液(400 g/L)中，并且添加0.13 mL的M乙酸钠緩冲液(pH 5.8)和2 ml的 DMF 。将反应混合物冷却到12。C并且通过添加0.094 ml的胰蛋白酶 (0.075mg,罗切诊断公司(Roche Diagnostics))来起始。在8小时后，通 过添加TFA至pH2.5将反应终止，并且通过HPLC分析。形成Lys(B30)-胰岛 素酰胺并且与US 5，656，722类似在添加胰蛋白酶抑制剂溶液后将其纯化。然 后在存在酸时将酰胺化胰岛素类似物水解几小时以给出Lys(B30)-胰岛素， 或者直接将其用作药物。
2权利要求
1. 制备胰岛素类似物或其衍生物的方法，其中，被酰胺化或用保护基C-末端保护的天然存在的碱性氨基酸或包含天然存在的碱性氨基酸或其类似物或衍生物并且C-末端被酰胺化或者用保护基保护的肽，在具有胰蛋白酶的生物学活性的酶存在时被添加到其A和/或B链的C-末端氨基酸选自天然存在的、碱性氨基酸或其类似物或衍生物的初始胰岛素类似物或其衍生物上，到所述C-末端氨基酸之一上，并且将得到的经修饰的胰岛素类似物纯化并且任选地消除所添加的氨基酸或所添加的肽的酰胺基团或C-末端保护基。
2. 权利要求l所述的方法，其中胰岛素类似物的特征在于通式IS- SR1 -(A1 -A5)-Cys-Cys-(A8-A10)陽Cys-(A12-A19)-Cys-A21-R2(A-链 )s-S S 一 S (I)R3-B1-Val-B3隱Gln-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30-R4-R5(B-链 )其中含义是(Al-A5) 人胰岛素或动物胰岛素的A链第Al至A5位中的氨基酸残基，(A12-A19)人胰岛素或动物胰岛素的A链第Al2至Al9位中的M酸残基，A21 天然存在的氨基酸残基，(B8-B18) 人胰岛素或动物胰岛素的B链的第B8至第B18位中的氨基酸残基，(B20-B26)人胰岛素或动物胰岛素的B链的第B20至第B26位中的氨基酸残基，(A8-A10) 人胰岛素或动物胰岛素的A链第A8至A10位中的氛基酸残基，B30化学键或天然存在的氨基酸残基，Bl 化学键或天然存在的氨基酸残基，B3 天然存在的氨基酸残基，B27、 B28和B29天然存在的氨基酸残基，Rl氨基或1至3个天然存在的氨基酸残基，R2氛基或1至3个天然存在的氨基酸残基，R3氨基或1至3个天然存在的氨基酸残基，R4化学键或1至3个天然存在的氮基酸残基，其中C-末端存在的氨基酸残基代表碱性氨基酸，R5 l或2个碱性氨基酸残基，其C末端是自由的或酰胺化的，其中其C末端与R5的N末端相连的氨基酸残基选自天然存在的碱性絲酸。
3.权利要求1或2中任一项所述的方法，其中初始胰岛素类似物特征在于通式II<formula>formula see original document page 3</formula>R1 -(A1 -A5)-Cys-Cys-(A8-A10)-Cys-(A12-A19)-Cys-A21 -R2(A-链)<formula>formula see original document page 3</formula>(II)R3-B1 -Val-B3-Gln-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30-R4(B-链)其中R1、 (Al-A5)、 (A8-A10)、 (A12画A19)、 A21、 R2、 R3、 Bl、 B3、(B8-B18)、 (B20-B26)、 B27、 B28、 B29、 B30和R4如权利要求1所定义的，并且B链的C末端氨基酸残基选自天然存在的碱性氨基酸。
4. 权利要求1至3中任一项所述的方法，其中被酰胺化或者用保护基进行C末端保护的天然存在的碱性氨基酸是C-末端酰胺化的精氨酸或用保护基C-末端保护的精氨酸。
5. 权利要求1至4中任一项所述的方法，其中经修饰的胰岛素类似物为Gly(A21)， Arg(B31)， Arg(B32)人胰岛素，其B链的C末端被酰胺化。
6. 权利要求5所述的方法，其中初始胰岛素类似物是Gly(A21)，Arg(B31)人胰岛素。
7. 权利要求1至6中任一项所述的方法，其中初始胰岛素类似物通过重組表达前体蛋白质来制备，所述前体蛋白质包含初始胰岛素类似物的A链和B链。
8. 权利要求7所述的方法，其中作为复制子一部分的基因,"达。
9. 权利要求7或8中任一项所述的方法，其中使用细菌或酵母作为宿主细胞。
10. 权利要求7至9中任一项所述的方法，其中前体蛋白质在表达后被分泌。
11. 权利要求10所述的方法，其中前体蛋白质分离自细菌或酵母的细胞上清液。
12，制备如权利要求9所述的经修饰的胰島素类似物的方法，其中前体蛋白质分离自细菌周质。
13. 权利要求7至10中任一项所述的方法，其中对如任何所述权利要求中所述获得的前体蛋白质实施折叠过程和酶促切割。
14. 权利要求1至6中任一项所述的方法，其中初始胰岛素类似物通过重组定向表达制备。
15，权利要求1至14中的一项或多项所述的方法，其中具有胰蛋白酶生物学活性的酶选自人胰蛋白酶、猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶以及人胰蛋白酶、猪胰蛋白酶和牛胰蛋白酶的变体。
16.权利要求l至14中的一项或多项所述的方法，其中酶具有赖氨酰内肽酶活性。
17. 权利要求1至15中的一项或多项所述的方法，其中经修饰胰岛素类似物的B链的C末端随后在水解反应中^JL保护。
18. 权利要求1至17中的一项或多项所述的方法，其中获得的胰烏素类似物是Gly(A21)， Arg(B31)， Arg(B32)人胰岛素。
19. 如权利要求1-16中所述制备的胰岛素类似物或其衍生物作为药物的用途，所述胰岛素类似物或其衍生物的A和/或B链的C末端M酸被酰胺化。
20. 如权利要求1至16中任一项所述可获得的胰岛素类似物或其衍生物，所述胰岛素类似物或其衍生物的A和/或B链的C末端M酸被酰胺化。
全文摘要
本发明涉及产生胰岛素类型的方法，所述方法通过遗传改造胰岛素类型的前体并且将所述前体在与赖氨酸酰胺或精氨酸酰胺的酶催化的连接反应或者用经保护基修饰的赖氨酸或精氨酸的酶催化的连接反应中转化为各自的胰岛素，以及任选地随后水解。
文档编号C07K14/62GK101490082SQ200780026138
公开日2009年7月22日 申请日期2007年7月5日 优先权日2006年7月11日
发明者F·措赫尔, P·哈伯曼 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司