专利名称：：具有抗肿瘤作用的重组灵芝免疫调节蛋白及其药物制剂的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医药工程领域，涉及使用巴斯德毕赤酵母(/^/'p"StoA7力表达的重组灵芝免疫调节蛋白的抗肿瘤用途及其抗肿瘤药物制剂。
背景技术：
：灵芝免疫调节蛋白(ImmunoregulatoryProteinofGWio^fe"附a/mczV/!'w附),由曰本Kino等人1989年从赤灵芝菌丝体提取物中分离和纯化的小分子蛋白质(KohsukeKinoefa;.,J.Boil.Chem.1989,1:472-478)，命名为LZ-8，并测定其氨基酸顺序和免疫生理活性。蛋白质测序表明LZ-8由110个氨基酸残基组成，氨基端乙酰化，分子量为12.4KD，等电点为4.4。灵芝免疫调节蛋白的主要功能在于它可以促进水梢淋巴细胞和脾脏细胞的增生，诱，动物和人体的巨噬细胞分泌多种细胞因子(如白细胞介素，肿瘤坏死因子和T扰素等)，进而防御及消除病原体的侵害，维护机体的健康，实现免疫调节功能。很多研究表明，LZ-8发挥抗肿瘤作用主要是通过免疫调节途径实现。但本发明的积极效果在于首次公开了重组灵芝免疫调节蛋白(RecombinantImmunoregulatoryProteinofG朋odem^L"cW/mw，rLZ-8)通过与肿瘤细胞膜特异结合诱导其凋亡来直接杀伤或杀死肿瘤细胞而发挥抗肿瘤的用途。在发挥作用的同时，不同于化疗药物会降低白细胞，rLZ-8会维持和升高白细胞，且不影响正常细胞的作用。恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，目前尚无特别有效的防治策略。近年来，随着分子肿瘤学、分子药理学的不断发展，以及对肿瘤本质的阐明，大规模、快速筛选组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物开发进程。用不同方法启动或激活肿瘤细胞凋亡机制，影响细胞不同基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡，减少对正常细胞的影响和放化疗带来的副作用，己成为目前肿瘤治疗的重要策略。本发明的重组灵芝免疫调节蛋白不仅在体外能快速高效诱导多种肿瘤细胞凋亡，而且在小鼠肿瘤模型体内也能有效杀死肿瘤细胞，且无明显毒副作用，并能保持或升高白细胞的水平，对应用重组灵芝免疫调节蛋白研制抗肿瘤药物有一定的积极作用。
发明内容1.公开了rLZ-8抗肿瘤作用及升高白细胞作用。2.杀伤白血病细胞的药效学和细胞凋亡实验，药效学实验表明rLZ-8对白血病细胞NB4、K562和HL-60具有很强杀伤作用，流式细胞仪进行的细胞凋亡检测进一步证明了rLZ-8诱导人白血病细胞发生凋亡。3.溶血实验、大鼠骨髓像实验和促红细胞凝聚实验证实其对正常细胞没有影响。4.荷瘤小鼠实验表明，rLZ-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤S180和移植性肝癌细胞H22在体内生长。5.蛋白荧光标记实验表明，rLZ-8可以通过与肿瘤细胞膜特异结合诱导其凋亡而杀伤或杀死肿瘤细胞。6.rLZ-8药物制剂的核心成分含有重组灵芝免疫调节蛋白和任选的药学可接受的辅剂。7.rLZ-8药物制剂可以通过口服和非肠道给药。说明书图1rLZ-8对NB4肿瘤细胞体外杀伤结果图2rLZ-8对K562肿瘤细胞体外杀伤结果图3rLZ-8诱导K562和NB4细胞凋亡PI单染检测结果图4rLZ-8诱导K562和HL60细胞凋亡AnnexinV/PI双染检测结果图5用流式细胞仪检测NB4细胞发生凋亡时线粒体膜电位的变化图6接种S180艾氏腹水瘤细胞小鼠体重变化(横轴为时间(d);纵轴为平均体重(g);曲线符号-令-代表S180组；-躍-代表S180+rLZ-8组；-矗-代表0<:组)图7接种H22移植性肿瘤细胞小鼠体重变化((横轴为时间(d);纵轴为平均体重(g);曲线符号-令-代表H22组；-國-代表H22+rLZ-8组；-矗-代表CK组))图8FTTC-rLZ-8(lOOng.ml-l)对大鼠心肌组织的标记(暗、明场)图9FTTC-rLZ"8(lOOng.ml-l)对兔软骨细胞的标记(暗、明场)图10FTTC-rLZ-8(100ng.ml-l)对HL60细胞的标记(暗、明场)注以上图l-图5，Cl代表NB4正常对照组；P代表AS203阳性药对照组；C2代表K562正常对照组；C3代表HL-60正常对照组；Rl-R6代表rLZ-8药物组(浓度由0.78yg*mr、100ug'ml");HI-H6代表rLZ-8药物组(浓度为3.125Hg'mT、100ug'mr1);11-13代表rLZ-8药物组(浓度分别为5ug'mr1、10ug'mr1和20ug'ml—1)具体实施例方式实施例1:重组灵芝免疫调节蛋白的获得1.rLZ"8基因人工合成、工程菌构建和筛选根据毕赤酵母遗传密码偏爱性，在原有的灵芝免疫调节蛋白基因序列的基础上，重新设计编码了rLZ-8基因进行全基因合成，并与酵母a-因子前导肽编码序列相连成为融合基因，克隆入pMD18-T载体中。将测序正确的载体线性化，转入酵母基因组中，在MM和MD平板上筛选甲醇利用高效型Mut+菌株。2.rLZ-8工程菌的表达对规模发酵表达的温度、转速、pH值、装液体积、甲醇添加量等条件进行检测，确立了酵母工程菌在80L发酵罐规模下表达rLZ-8的工艺条件优化方法。根据rLZ-8的理化特性，设计了发酵培养基的配方。目的蛋白产量约为800mg丄—、3.rLZ-8纯化工艺发酵液分离机离心—将上清用管式分离机—超滤—阳离子交换纯化柱—AKTA蛋白质纯化工作站制备目的蛋白—强阴离子交换作用层析—疏水作用纯化柱—凝胶过滤层析。44.rLZ"8纯度鉴定及分子量测定利用反相液相色谱对分离纯化的产物进行纯度分析，rLZ-8纯度为>99%。激光飞行质谱鉴定重组表达的rLZ-8分子量为12722。5.rLZ"8高级空间结构的确定利用悬滴气相扩散法获得了0.2cmx0.2cmx0.2cm的单晶。硒代晶体在MacChessF2beamline上收集了1.8埃分辨率的晶体衍射数据。非硒代母体晶体在MarResearch345dtd像板衍射数据收集系统收集了一套1.8埃分辨率的晶体衍射数据。重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8亚基的二级结构由2个ot-螺旋，7个P-折叠和一个无规则巻曲组成。实施例2:rLZ-8对人早幼粒白血病细胞NB4的杀伤作用1.试剂rLZ-8除菌后用IMDM培养液配制成8个浓度，分别为0.78吗'ml—1，1.56吗'ml—1,3.125吗mr1，6.25吗'mr1，12.5吗.ml1，25ng'mr1,50吗.ml1，100吗'mr1。2.实验方法96孔培养板中，试验孔加NB4肿瘤细胞0.1ml和rLZ-80.1ml，rLZ-8浓度由低到高；阴性对照组加NB4肿瘤细胞和培养液各O.lml;阳性药物对照组为三氧化二砷As203;每组作6个复孔。置37'C、5免C02培养箱中48h，在细胞培养终止前4h加入MTT15pl(5mgml"),细胞培养终止后加入lOOnlO.lmoli;1盐酸异丙醇，在酶联免疫检测仪上570nrn测OD值。3.实验结果表1和图1显示，rLZ-8药物组在OD5TOnm的光吸收值与NB4正常对照组比较，有明显差异，说明rLZ-8在体外对NB4肿瘤细胞有较强杀伤作用。表lrLZ-8对NB4细胞体外杀伤作用(《±s，n-6)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>各药物组与NB4正常对照组比较，*P<0.01实施例3:rLZ-8对人慢性髓性白血病细胞K562的杀伤作用1.试剂rLZ-8除菌后用IMDM培养液配制成6个浓度，分别为3.125吸ml—1，6.25fig'ml—1,12.5ng.ml1，25吗mr1，50吗.ml1，100吗.ml1。2.实验方法96孔培养板中，试验孔加K562肿瘤细胞0.1ml禾卩rLZ-80.1ml，rLZ-8浓度山低到高；阴性对照组加K562细胞和培养液各O.lml;阳性药物三氧化二砷；每组作6个复孔。置37°C、5%C02培养箱中48h，在细胞培养终止前4h加入MTT15pl(5mg'mr1)，细胞培养终止后加入100pl0.1mol七—1盐酸异丙醇,在酶联免疫检测仪上570nm测OD值。3.实验结果表2和图2所示，rLZ-8药物组在OD57。画的光吸收值与K562正常对照组比较，有明显差异，说明rLZ-8在体外对K562细胞同样具有杀伤作用。表2rLZ-8对K562肿瘤细胞体外杀伤作用(*±s，n=6)分组剂量(ng'mL-1)OD570nm生长抑制率(％)正常对照—1.01±0.01—阳性药对照组100.22±0.03*78.2rLZ-8组3.1250.66±0.03*34.76.250.58±0.03*42.612.50.52±0.05*48.5250.31±0.02*69.3500.25±0.04*75.21000.19±0.03*81.2各药物组与K562正常对照组比较，*P<0.01实施例4:rLZ-8对血液肿瘤细胞凋亡作用的影响1.PI单染流式细胞仪检测1.1仪器和细胞株荧光显微镜，型号LeicaASLMD、K562、NB4。1.2试剂rLZ-8分别设高、中、低三个剂量组，用含2WFCS的IMDM培养液配制成浓度为20吗.mr11，10ng/ml，5ng.ml1。碘化乙锭(PI)50ng.mr1。1.3实验分组K562设为正常对照组，rLZ-8低剂量组(5吗'm1—1)、rLZ-8屮剂量组(10昭'm1—1)、rLZ-8高剂量组(20吗'ml—";NB4设为正常对照组，rLZ-8低剂量组(5吗如1—])、rLZ-8中剂量组(10昭'mr1)、rLZ-8高剂量组(20吗.mr1)。1.4实验方法将K562细胞与NB4细胞分别加入24孔板，lml/孔，并加入不同浓度rLZ-8，lml/孔，每组设3个复孔。置37'C、5呢C02培养箱24h，将每个浓度组细胞收集，PBS洗涤2次并调整细胞浓度为lxl06/1111，70%冰乙醇固定，置一2(TC过夜。固定后细胞用PBS洗涤2次，加入PI(终浓度为50ngTnl")室温避光孵育10min，1000rmin"离心5min，弃卜.清液用40C^1PBS重悬沉淀。lh之内上机检测。61.5实验结果由表3和图3可见，与K562及NB4正常对照组比较，rLZ-8药物组细胞调亡率均有所提高，可以得出使细胞凋亡是rLZ-8杀死肿瘤细胞的途径之一。表3rLZ-8对K562及NB4细胞凋亡诱导率(％)凋亡率止常对照组rLZ-8rLZ-8rLZ-8(10ngml1)(20吗.mr1)K5628.8916.4317.9121.57NB44.069.2327,5138.602.AnnexinV-FITC试剂盒流式细胞仪检测细胞凋亡2.1仪器和细胞株FACSCalibur型流式细胞仪麵国Becton-Dickinson公司。NB4、HL-60。2.2试剂rLZ-8用含2XFCS的IMDM培养液配制成5吗'mr1、10吗'mr1、20吗'mr1，三氧化二砷(As203)5昭'mr1。AnnexinV-FITC试剂盒结合缓冲液4x;碘化丙锭溶液(PI)，20吗'ml—、0.2ml;重组人AnnexinV/FITC，O.lml。2.3实验分组NB4设正常对照组，阳性药物组(AS2035吗'mr1)，蛋白低剂量组(5昭'mr1),中剂量组(10吗'ml—1)、高剂量组(20吗'mr1》HL-60设正常对照组，蛋白低剂量组(5吗-mr1)、中剂量组(10吗.mr1)、高剂量组(20吗'm1—1)。2.4实验方法将NB4与HL-60细胞分别加入24孔板，lml/孔，并加入不同浓度rLZ-8，lml/孔，每组设3个复孔。置37。C、5%C02培养箱中24小时，将每个浓度组细胞收集，用4"C预冷的PBS洗细胞2次，用250nl结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为lxl06/ml。取100^1的细胞悬液于5ml流式管中'，加入5|JAnnexinV/FITC和lOpl20jig'mr1的PI溶液，混匀后于室温避光孵育15min，在反应管中加400plPBS，流式细胞仪分析。2.5实验结果由图4及表4可以看出，NB4-rLZ-8组和HL-60-rLZ-8组凋亡率明显高于其正常对照组，并且，HL-60-rLZ-8组，随着rLZ-8浓度的增加，凋亡率亦增加。表4rLZ-8对NB4及HL-60细胞凋亡诱导率(％)凋亡率正常对照组阳性药组rLZ-8rLZ-8rLZ-8(5吗-ml])(10,，)(20吗-ml1)NB46.123.421.022.334.0HL-600.439.730.550.757.7图5是用流式细胞仪检测NB4细胞发生凋亡时线粒体膜电位的变化，rLZ-8三个实验组7与正常组比较，线粒体膜电位均甜移。经透射电子显微镜观察rLZ-8诱导发生凋l^的NB4细胞发现，线粒体形态呈不规则变化，并有线粒体肿大现象。实施例5:rLZ-8的溶血实验1.试剂rLZ-8用5%葡萄糖溶液配制成lmg'ml—1;血细胞悬液配制人血4ml，1000r/min离心10min，去上清。将红细胞沉淀加入5%葡萄糖溶液约IO倍量，摇匀，H)OOr/min离心20min，去上清，重复洗涤2—3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用5%葡萄糖溶液配成2%的混悬液，供实验用。2.实验方法取洁净的试管28只，进行编号。l一5号为rLZ-8药物组，6号管为阴性对照组(5%葡萄糖溶液)，7号管为阳性对照管(蒸馏水)。共设4组平行对照管。依次加入2%红细胞悬液、5%葡萄糖或蒸馏水，混匀后，立即置37'C土0.5。C的恒温箱中温育。开始每隔15min观察1次，lh后每隔lh观察1次，共3小时。结束后将各管中的溶液置入干燥离心管中离心，1500r，25min。取上清，在分光光度计545nm处，以蒸馏水为空白读取各管OD值，计算溶血率。3.实验结果由表5可以看出，l一5组rLZ-8药物组溶血率均小于5X，可以说明未出现溶血反应。表5rLZ-8对人红细胞致溶作用的实验结果(*±s，n=4)试管编号12345溶血率(％)0.70±0.030.74±0.040.63±0.040.65±0.040.59±0.07实施例6:rLZ-8对大鼠骨髓像的影响1.实验材料Waster大鼠9只，100g左右。rLZ-8用无菌生理盐水配制。分为60mg'kg—1、30mg'kg—1、15mg'kg—1剂量组。2.实验方法正常对照组3只，蛋白低剂量组2只，蛋白中剂量组2只，蛋白高剂量组2只。rLZ-8药物组大鼠，分别给予不同剂量的rLZ-8尾静脉注射，1次/日；对照组给予等量生理盐水。给药第七天，取右侧大腿骨髓涂片。3.实验结果大鼠骨髓他涂片与正常对照组比较未见异常。实施例7:rLZ-8对人红细胞凝聚作用的影响1.试剂A型、B型、0型和AB型血各2ml分别来源于健康志愿者；绵羊红细胞(sheepredcell)2ml。将上述红细胞1200g'min—1离心10min，弃上清，用5mlPBS洗涤，重复上述操作3-5次，然后用O.Olmol/LPBS配制成1.5%悬液。rLZ-8用牛理盐水配置，使其终浓度分别为50吗'mr1，25ng.ml管1，12.5吸mr1，6.25吗-mr1，3.13lag.ml1，1.56叫.ml管1，0.78吗.mr1，0.39pg-ml1，0.20吗.mr1，O.lO吗.mr1，0.05吗.mr1，0.03吗'mr'。植物凝集素(PHA)配制同上。2.实验方法将实验对象分为rLZ-8各浓度组、阳性药对照组，正常对照组。96孔微量血凝板中加入A型1.5%红细胞25^11/孔，冉加入0.2%明胶，75^d/孔。药物组分别加不同浓度rLZ-8，其终浓度如上所述；阳性药对照组PHA25pl/L;正常对照组PBS25pl/孔。每组设6个平行对照。室温下振荡30s，37'C培养箱，l小时后开始观察。B型、AB型、0型及绵羊红细胞实验方法同上。3.试验结果由表6所示，阳性对照药PHA对人四种红细胞及绵羊红细胞均具有凝集作用；rLZ-8对人四种红细胞无凝集作用，而在12.5吗，ml—、5(Vg'mr1浓度时对绵羊红细胞表现出凝集活性。表6rLZ-8对人四种型别红细胞凝集作用实验结果正_rLZ-8药物组(ng'ml—1)__分组常^^加502512.56.253.131.560.7S0.390.200.100.050.03__^___A—————————————B—————————————0—————————————AB—————————————绵羊红细胞一++++++—————————实施例8:rLZ-8对大鼠白细胞的影响1.实验材料Waster大鼠18只，lOOg左右。试剂(1)rLZ-8用无菌生理盐水配制。分为60叫'kg—1、30吗'kg—1、15吗'kg—1剂量组。(2)金磊赛强[重组人粒细胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF)]，生产批号20060403;75吗/支。用无菌生理盐水配制成13.5^mr1，0.1ml/只。(3)注射用环磷酰胺(CP)，生产批号050216;200mg/支。用无菌生理盐水配制20mg'ml—1，9O.lml/只，即20mg'kg1。2.实验方法TH常对照组，蛋白低剂量组，蛋白高剂量组，蛋白高剂量组，阳性对照组(金磊赛强)。除正常对照组(给予等量生理盐水)夕卜，每组大鼠均给予环磷酰胺尾静脉注射，20mg，mr1，O.lml/只，连续3天。于第三天，大鼠尾静脉取血，送吉林大学第一医院检验科，细胞分析仪检测白细胞数。造模成功后按上述分组分别给予相应剂量rLZ-S及阳性药(金磊赛强)治疗，正常对照组和CP组给予等量生理盐水，于治疗第3天和第7天分别大鼠尾静脉取血，送吉大一院检测白细胞数。对比治疗前后白细胞数变化，分析药物疗效。3.实验结果由表7可以看出，与CP对照组比较，在给药第3天rLZ-8药物组已明显升高大鼠白细胞，差异及其显著，在给药第7天基本达到正常。表7rLZ-8对白细胞低下大鼠模型的影响(*±s，n=10)分组给药前白细胞数给药第3天给药第7天正常对照组14.57xl09丄—112.8xl09.L-19.13xl09.L-1CP对照组(20叱'kg—"4.9xl09.U15.23xl09.L"10.27xl09丄'1金磊赛强(13.5昭'kg—44.37x瓶i;110.83xl09丄—"10.17xl09.i;1rLZ-8(15吗'kg—"2.93xl09.i;18.8xl09.L-"10.2xl09.L—1rLZ-8pOng'kg-1)2.96x跳L-19.3xl09.L"*12.83xl09.L—1rLZ-8(60吗-kg—1)4.33xl09丄—18.6xl09.L—"15.5xl09丄—1与CP对照组比较，*PcO.OI实施例9:rLZ-8对小鼠S180艾氏腹水瘤的抑制实验1.实验材料小鼠，体重18—22g，雌雄各半，由吉林大学实验动物中心提供。小鼠艾氏腹水细胞株S180由本室提供。环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号06101921。S180腹水瘤及实体瘤实验组均分为正常对照组、阴性对照组、阳性对照组、rLZ-8低剂量治疗组(0.25mg.kg勺、rLZ-8中剂量治疗组(O.Smg.kg-1),rLZ-8高剂量治疗组(lmg.kg—1)。每组10只。2.实验方法S180皮下抑瘤实验方法取生长良好的S180细胞，以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液，细胞计数为1(^L—1，每鼠右腋窝皮下接种0.2ml(正常对照组除外)。接种24h后，给予治疗。正常对照组和阴性对照组给予生理盐水0.2ml，只—、d—1，腹腔注射；阳性对照组给予环磷酰胺20mg'kg—\0.2mlv口、—、d—、腹腔注射。rLZ-8治疗组分别给予相应剂量尾静脉注射，0.2ml.只—、d—1。连续10天。分别于给药前、给药10d后从小鼠眼眶静脉丛取血，送检于吉大一院检验科测白细胞数。并在停药次日，颈椎脱臼处死全部小鼠，解剖取出瘤块，称瘤重。按下式计算抑瘤率抑瘤率(％)=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重><100%S180腹水抑瘤实验方法取生长良好的S180细胞，以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液，细胞计数为1071—1，每鼠腹腔接种0.2ml(正常对照组除外)。接种24h后，给予治疗。正常对照组和阴性对照组给予生理盐水0.2mlv口、—、d—1，腹腔注射；阳性对照组给予环磷酰胺20mg'kg—1，0.2mh只—1j1，腹腔注射。rLZ-8治疗组分别给予相应剂量尾静脉注射，0.2mlv口、—'士。连续10天。每円称重，观察小鼠体重变化程度，作体重增长曲线。3.实验结果S180皮下抑瘤实验结果由表8可以看出，3个剂量的rLZ-8均能抑制S180的生长，抑瘤率分别为16.8%、25.7%禾口45.5%。rLZ-8治疗组瘤重与阴性对照组比较，均极有显著差异(P<0.01)。由表9可以看出，给药前，各组小鼠白细胞数均在同一水平上，与阴性对照组比较无差异(尸>0.05)。治疗10天后，阴性对照组白细胞数较正常对照组高，rLZ-8低剂量组和中剂量组白细胞数与阴性对照组比较无差异(尸>0.05)，高剂量组与正常对照组比较无差异CP>0.05),阳性对照组白细胞数明显降低，与正常对照组及阴性对照组比较均有显著差异(尸<0.01)。表8rLZ-8对小鼠移植性肿瘤S180的抑制作用(*±s，n:=10)分组剂量(mg'kg力瘤重(g)抑瘤率(％)阴性对照组—1.01±0.03—CTX组200.35±0.02*65.3rLZ-8低剂量组0.250.84±0.03*16.8rLZ-8中剂量组0.50.75±0.02*25.7rLZ-8高剂量组10.55±0.03*45.5S阴性对照组比较，*表9/><0.01rLZ-8对小鼠移植性肿瘤S180白细胞影响(*±s，n=10)分组齐U量(mg'kg-1)白细胞数给药前给药10d正常对照组—9.49±0.279.54±0.33阴性对照组9.54±0.2510.44±0.34CTX组2(19.56±0.314.41±0.25*rLZ-8低剂量组0.259.48±0.3010.44±0.18**rLZ-8中剂量组0.59.43±0.4410.34±0.31**rLZ-8高剂量组19.49±0.369.55±0.36**与阴性对照组比较，*尸<0.01;**P>0.05S180腹水抑瘤实验结果实验结果表明，各组小鼠腹水出现时间基本一致，阴性对照组11小鼠体重增长迅速，存活时间减少。由图6可见，rLZ-8组小鼠平均体重增K趋势比正常组大，但比阴性对照组比较小。说明rLZ-8能够在一定程度上抑制小鼠腹腔S180肿瘤细胞的增长。实施例10:rLZ-8对小鼠肝癌细胞H22的抑制实验1.实验材料小鼠，体重18—22g，雌雄各半，由吉林大学实验动物中心提供。小鼠肝癌细胞株H22，由本室提供。环磷酰胺(CTX),江苏恒瑞医药股份有限公司，批号06101921。2.实验方法H22肝癌细胞实验组均分为正常对照组、阴性对照组、阳性对照组、rLZ-8低剂量治疗组(0.25mg'kg—1)、rLZ-8中剂量治疗组(0.5mg'kg")、rLZ-8高剂量治疗组(lmg'kg—1)。每组10只。H22皮下抑瘤实验方法取生长良好的H22细胞，以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液，细胞计数为107，L—、每鼠右腋窝皮下接种0.2ml(正常对照组除外)。接种24h后，给予治疗。正常对照组和阴性对照组给予生理盐水0.2ml.只义d—1，腹腔注射；阳性对照组给予环磷酰胺20mg'kg、(^mlvTV1,腹腔注射。rLZ-8治疗组分别给予相应剂量尾静脉注射，0.2mb只-、d—1。连续10天。分别于给药前、给药10d后从小鼠眼眶静脉丛取血，送检于吉大一院检验科测白细胞数。并在第停药次日，颈椎脱臼处死全部小鼠，解剖取出瘤块，称瘤重。按下式计算抑瘤率抑瘤率(％)=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重xlOOXH22腹水抑瘤实验方法取生长良好的H22细胞，以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液，细胞计数为10入U1，每鼠腹腔接种0，2ml(正常对照组除外)。接种24h后，给予治疗。正常对照组和阴性对照组给予生理盐水0.2mr只+d—、腹腔注射；阳性对照组给予环磷酰胺20mg'kg'1，0.2mlv口、—、cT1,腹腔注射。rLZ-8治疗组分另ij给予相应剂量尾静脉注射，0.2mlv口、-"cT1。连续10天。每日称重，观察小鼠休重变化程度，作体重增长曲线。3.实验结果H22皮下抑瘤实验结果由表10可以看出，3个剂量的rLZ-8均能抑制S180的生长，抑瘤率分别为16.7%、30.0%、42.5%。rLZ-8治疗组瘤重与阴性对照组比较，均有极显著差异(P<0.01)。表IOrLZ-8对小鼠移植性肿瘤H22的抑制作用(*±s，n=10)分组剂量(mg.kg-4瘤重(g)抑瘤率(％)阴性对照组—1.20±0.02—CTX组200.45±0.02*62.5rLZ-8低剂量组0.251.00±0.03*16.7rLZ-8中剂量组0.50.84±0.02*30.0rLZ-8高剂量组10.69±0.03*42.512与阴性对照组比较，*/^0.01由表11看出，给药前，各组小鼠白细胞数均在同一水平上，与阴性对照组比较无差异(尸>0.05)。治疗10天后，阴性对照组白细胞数较正常对照组高，rLZ-8低剂量组和中剂量组白细胞数与阴性对照组比较无差异(尸>0.05)，高剂量组与正常对照组比较无差异(尸>0.05)，阳性对照组白细胞数明显降低，与正常对照组及阴性对照组比较均有显著差异(尸<0.01)。表llrLZ-8对小鼠移植性肿瘤H22白细胞影响(*±s,n=10)给药前给药10d正常对照组一9.65±0.289.69±0.26阴性对照组—9.76±0.3110.49±0.33CTX组209,67±0.434.49±0.21*rLZ-8低剂量组0.259.65±0.3310.53±0.24**rLZ-8中剂量组0.59.65±0.3810.43±0,27**rLZ-8高剂量组19.63±0.419.86±0.27**与阴性对照组比较，*尸<0.01;**尸>0.05H22腹水抑瘤实验结果实验结果显示rLZ-8组小鼠生存时间比阴性对照组延长，阴性对照组小鼠食欲减退，但体重增L(迅速，活动减少。由图7可见，rLZ-8组小鼠平均体重增长趋势比正常组大，但比阴性对照组比较小。说明rLZ-8能够在一定程度上抑制小鼠腹腔H22肿瘤细胞的增长。实施例11:rLz-8荧光标记及其对正常组织细胞和H1-60细胞的影响1.rLz-8的FITC荧光素标记(1)试剂与仪器荧光色素(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte，FITC)，吉尔生化(上海)；二甲基亚砜；碳酸盐缓冲液(pH89.5)(Na2C034.3g,NaHC038.6g力BddH20至500ml);磷酸盐缓冲液(PBS);DesaltingHipr印26/10脱盐柱；AKTApurifier;日立分光光度计等。(2)实验方法将纯化的rLZ-8(7.5mg.mr'^Oml对碳酸盐缓冲液(pH8.3)透析过夜，称取3.75mgFITC，加入二甲亚砜(DMSO)3.75ml配制成FITC-DMSO溶液。在50ml小烧杯中先放入rLZ-8按FITC-DMSO溶液逐滴加入rLZ-8溶液中，用PBS加至30ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌4h，用DesaltingHiprep26/10脱盐柱于AKTApurifier系统上除去游离荧光素，75mlPBS洗脱，280nm、495nm检测，峰收集。(3)实验结果将制备的FITC-rLZ-8(10倍稀释)于220nm520nm扫描，夂95=0,445，A28。=0.67，计算标记效率(F/P)为3.80。2.对大鼠心肌组织的标记作用(1)试剂与仪器LeicaCM1850冷冻切片机；wistar大鼠；荧光显微镜80i(Nikon);等渗PBS缓冲液(pH7.2);胎牛血清(FBS，Gibco);FITC-rLZ-8本室制备。(2)实验方法将大鼠脱颈处死，去心脏，置于冷冻切片机，待温度降至-2(TC进行切片，将心肌组织切片与PBS配制的FITC-rLZ-8溶液(100ng'mr1)37。C孵育lh后，荧光显微镜下观察，并设空白对照组。(3)实验结果荧光显微镜下观察心肌组织无可见荧光，与空白对照组无差异，见图8。3.对原代培养兔软骨细胞的标记作用(1)试剂与仪器H本大耳白兔(雄性，2.5kg)4只；手术器械；0.25免胰酶+0.02。"EDTA;0.2%II型胶原酶；D-Hanks;IMDM培养基(50mg'mr1维生素C、双抗)；0.025mg.mr1多聚赖胺酸；无菌水(WFI)。(2)实验方法固定实验动物，空气栓塞处死，腹正中剥皮暴露四肢，大剪刀剪开肌肉筋膜，由骨干断开长骨后，小心取下整个膝、髋和肩部骨，粗略修剪后浸入D-Hanks。将装有组织的烧杯移进入超净台，组织清洗修剪后移入第二杯无菌D-Hanks。组装手术刀，用刀片轻轻削下一薄层软骨，弯镊移植入6cm培养皿，然后D-Hanks洗三次，弃去大部分D-Hanks，眼科剪剪碎软骨片至lmm。弃i多余D-Hanks，小勺转移碎骨片至10cm2培养瓶，加胰酶-EDTA消化，37'C、30min;弃去胰酶更换为胶原酶，摇匀后置37。C孵箱，每lh取出振摇5min，经4-4,5h，结束消化。制细胞悬液并加入3ml含FBS15%的IMDM，以5xl04.mT1接种于培养瓶。细胞接种于24孔板，每孔0.5ml，设空白对照组，以终浓度为0.25吗'm1—1的FITC-rLZ-80.5ml，37。C孵育lh。将细胞移入1.5mlEP管离心(lOOOrmin-1，7min)，以等渗PBS洗3次，向EP管中加入O.lmlPBS，重悬细胞。取悬液于荧光显微镜观察。(3)实验结果荧光显微镜卜'观察，兔软骨细胞形态完好，无绿色荧光，与对照组相比无显著差异。各实验组照片如图9所示。4.对Hl-60细胞的标记作用(1)试剂与仪器荧光显微镜80i(Nikon)，IMDM细胞培养液(Hyclone)，胎牛血清(FBS,Gibco)，FITC-rLZ-8和等渗PBS缓冲液(pH7.2)本室制备。(2)实验方法将HL-60以2xl()6接种于24孔培养板中，每孔0.5ml，以IMDM(2%FBS)培养液配制FITC-rLZ-8为100ng'ml人每孔0.5ml孵育(37°C)，设空白对照组、lh实验组和6h实验组。分别于lh和6h取出细胞加入至1.5mlEP管中，1000r'min1离心，弃上清，以PBS清洗3次，洗净重悬。(3)实验结果如图10，荧光显微镜下观察，经FITC-rLZ-8孵育lh和6h的HL-60细胞绿色荧光强，其中6h组细胞出现凝集，空白对照组无绿色荧光，与前者具显著差异。实施例12:重组灵芝免疫调节蛋白抗肿瘤组合物制剂1.通过上述药理实验证明，重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8的抗肿瘤作用和提高白细胞水平的效果是显著的，而且无毒副作用，因此。可以认为重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8适于药物使用而且是安全的。2.本发明的重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8作为抗肿瘤药物的应用可以通过门服和非肠道给药。服用的剂量i症状、年龄、体重等因素决定。对成年人来说，口服，每人每剂10-1000mg，每闩数次；非肠道给药10-100mg，每日数次。3.本发明口服药包片剂、丸剂胶囊(包括硬胶囊和软胶囊)，这些剂型包括重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8和至少一种惰性稀释剂(例如乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮)也可以加入惰性稀释剂以外的药物学上可以接受的添加物如润滑剂、崩解剂、稳定齐U。如果需要，片剂或丸剂可用胃溶或肠溶材料涂敷上一层或一层以上的膜。非肠道用注射剂包括重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8和至少一种惰性水稀释剂(如注射用蒸馏水、生理盐水)，也可以将重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8制成冻干粉，使用前将其溶解于惰性水稀释剂供注射用。(1)制剂例l取重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-81000mg，溶于100ml无菌生理盐水中，混合均匀后，分装成rLZ-810mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中，密封，灭菌制成产品。其他项目应符合中华人民共和国药典2005年版注射液项下要求。(2)制剂例2取重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8100g，，药用淀粉0.5kg按公知的胶囊制备技术和设备制成胶囊，rlz810mg/粒.其他项目应符合中华人民共和国药典2005年版胶囊项下要求。(3)制剂例3取重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8100g，微晶纤维素560g，无水乳糖380g，硬脂酸镁200g，按公知的制片技术和设备制成片剂，rLZ-810mg/片.其他项目应符合中华人民共和国药典2005年版片剂项下要求。15(4)制剂例4取重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8适量，中华人民共和国药典2005年口服液项下要求，按公知的制片技术和设备制口服液。权利要求1、一种重组灵芝免疫调节蛋白，具有抗肿瘤和升高白细胞的作用。2、如权利要求l所述的重组灵芝免疫调节蛋白，具有和编码天然灵芝免疫调节蛋白基因不同的碱基序列但编码的氨基酸序列相同，由毕赤酵母重组表达，纯度为99%以上。3、如权利要求l所述抗肿瘤作用，其特征在于重组灵芝免疫调节蛋白不仅在体外能诱导肿瘤细胞凋亡，而且在小鼠肿瘤模型体内也能有效杀死肿瘤细胞，无明显毒副作用。4、如权利要求l所述升高白细胞作用，其特征在于重组灵芝免疫调节蛋白在直接杀死或杀伤肿瘤细胞的同时不破坏j下常细胞，并能保持或升高白细胞的水平。5、如权利要求3所述的肿瘤细胞可以是早幼粒白血病细胞NB4或人慢性髓性白血病细胞K562或人急性髓系白血病细胞HL-60或小鼠实体瘤S180或小鼠肝癌细胞H22。6、一种重组灵芝免疫调节蛋白药物制剂，其特征在于该药物制剂核心成分含有权利要求1的重组灵芝免疫调节蛋白和任选的药学可接受的辅剂。7、如权利6所述重组灵芝免疫调节蛋白药物制剂可以通过口服和非肠道给药，口服药包括口服液，片剂、丸剂和胶囊；非肠道用包括外用药和注射剂。全文摘要一种具有抗肿瘤作用的使用毕赤酵母(Pichiapastoris)所表达的重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)及其药物制剂。rLZ-8具有在对NB4或K562或HL-60或S180或H22细胞的直接杀死或杀伤而不影响正常细胞的作用；rLZ-8不仅在体外能快速高效诱导多种肿瘤细胞凋亡，而且在小鼠肿瘤模型体内也能有效杀死肿瘤细胞，无明显毒副作用，并能保持或升高白细胞的水平。此外还提供了以rLZ-8作为核心成分的抗肿瘤药物制剂类型。文档编号C07K14/37GK101475632SQ20081005020公开日2009年7月8日申请日期2008年1月3日优先权日2008年1月3日发明者刘立侠,非孙,梁重阳,许守民申请人:非孙