专利名称：：新型大分子转导域及其识别方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及^足进生物活性分子穿透细胞膜的新型大分子转导域(MTD)肽、编码该MTD肽的多核普酸、识别MTD肽的方法、利用MTD肽遗传工程i殳计具有细月包渗透性的生物活性分子的方法、利用MTD肽将生物活性分子输入到细胞中的方法，以及其用途。
背景技术：
：由于质膜的存在，如DNA、RNA、蛋白、寡核苷酸和肽之类的大分子的细胞内摄作用仍然是一项富有4兆战性的任务，因为质膜构成了这种分子不可渗透的屏障。在向所需的草巴标递送这样的分子时已经遇到了许多困难，包括向组织或细月包的;参透性差，系统递送时由于耙向于特定组织或细胞的特异性不足而产生毒性，为了在特定輩巴细力包或组织处获4寻足够的局部浓度而以高浓度递送时产生副作用，以及由于降解而递送到靶的剂量不足和/或由降解产生的副产物导致的不希望的副作用。为了避开这些问题，已经开发出了几种载体介导的递送系统。其中，人们近年来非常关注肽基递送系统的用途。具有细胞渗透性的肽的使用具有几个优点，这主要是由于能够对该肽序列作出各种修饰。这就容许设计出能够对不同细胞子域寻址和/或能够转运各种类型的受载分子(cargomolecule)的载体。许多细胞渗透性肽由膜相互作用蛋白的序列设计而成，如重组蛋白、信号肽、i夸膜域和抗樣i生物肽。在这些序列中，已经证实称之为蛋白转导域(PTD)的短序列不需要载体或受体就能够有效地穿过生物膜，而将肽或蛋白递送到胞内区室中。许多研究已经4是出PTD基肽的使用对于抗病毒疾病或癌症的治疗可能是至关重要的。在PTD基肽中，称为穿膜肽(penetrain)的控制触角的基因的同源结构域的第三螺旋结构(Joliot,A.andA.Prochiantz，Ce〃所o/.6(3):189-96(2004))、书f生自HIV-1反式激活蛋白Tat的Tat肽(Wadia，J.S.andS.P.Dowdy，Cwrr.Op/w.S/o&c/wo/.13(1):52-6(2002))、纟田月包穿透肽(transportan)(Poogaetal.,i^we6乂12(1):67_77(1998)),和VP22(Elliott,G.andP.O'Hare，CW/88(2):223-33(1997))已经表现出改进了肽、蛋白质和寡核苷酸的细胞才聂耳又。还已经描述了称之为两亲肽的第二类细胞-〉参透肽。两亲分子能够被简单地定义为具有两种结构域亲水(极性)结构域和疏水(非才及性)结构i或。对于肽而言，两亲特4正能够产生于一纟及结构或二纟及结构。一级两亲肽能够—皮定义为具有亲水残基结构域和疏水残基结构域的连序组装。二级两亲肽是通过4吏得疏水和亲水残基定位于分子相对侧的构象状态而产生的。如聚精氨酸基的肽、降钙素衍生的肽和寡聚体的其它肽也已经被提出作为细胞内递送疗法的工具。然而，目前已知的递送系统由于其缺乏效能和/或其具有毒性而表现出局限性，并且人们对于其细胞摄取的途径知之甚少，这对改进其效能构成了障碍。另外，许多递送系统受限于其穿过细胞膜和核膜的能力。即使这样的递送肽确实穿过了细胞膜，也经常会由于其内截留于内体中而限制了它们的效能。本发明涉及克月良本领域内的这些击夹点。
发明内容技术方案本发明涉及能够介导生物活性分子转运到细胞内的分离的大分子转导域(MTD)肽。本发明的另一方面涉及编码这样的MTD肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及识别具有细胞渗透性的MTD肽的方法。本发明的另一方面涉及通过将MTD月太连4妻到生物活性分子而对具有细胞渗透性的生物活性分子进4于遗传工程i殳计的方法。本发明的另一方面涉及含有具有细胞渗透性的MTD肽和生物活性分子的具有细胞渗透性的分离的重组蛋白。重纟且蛋白(acellpermeablerecombinantprotein)的药4勿纟且合4勿,其中MTD连4妻于生物活性分子。本发明另一方面涉及将生物活性分子转运到受治疗者细胞内的方法，包括向受治疗者纟会予含有连纟妻于生物活性分子的MTD肽的细胞渗透性重组蛋白。本发明的其它方面涉及MTD肽用于药物递送、疫苗给药、蛋白疗法和基因疗法的用途。T有益效果J本发明提供了具有细胞渗透性的MTD肽，其能够促进生物活性分子转运到细胞内，由此能够有效地用于药物递送、疫苗给药、肽疗法和基因疗法。图la至图lo示出了i兌明4艮据本发明方法识别的大分子转导域(MTD)肽的氨基酸序列和结构特性的表格。图2是说明具有细胞渗透性且才艮据本发明构建的His-MTD-EGFP重组蛋白的示意图。图3a至图3c是示出了^4居本发明的由PCR扩增的编码MTDs-EGFP的DNA片^:的琼脂糖凝胶电泳分析的照片。图4a是说明根据本发明将MTD-EGFP的DNA片段亚克隆到pGEM-Teasy载体中的示意图，而图4b至图4d是示出了根据本发明的,皮亚克隆到pGEM-Teasy载体中的编码MTDs-EGFP的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分析的照片。图5a是说明根据本发明将编码MTD-EGFP的DNA片段亚克隆到pET28(+)载体中的示意图，而图5b至图5d是示出了根据本发明克隆到pET28(+)载体中的编码MTDs-EGFP的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分析的照片。图6a和图6b是说明根据本发明的His-MTD-EGFP重组蛋白可i秀导表达的SDS-PAGE分才斤的照片。图7a和图7b是示出了根据本发明在变性条件下His-MTD-EGFP重组蛋白纯度的SDS-PAGE分析的照片。图8是示出了根据本发明在变性条件下His-MTD-EGFP重组蛋白纯4匕的SDS-PAGE分冲斤的照片。图9a至图9g是说明根据本发明通过流式细胞仪分析的His-MTD-EGFP重组蛋白的细胞渗透性的图片。图10a至图10i是4艮据本发明通过共焦激光扫描显孩i镜而^吏His-MTD-EGFP重组蛋白细月包渗透性可4见化的照片。图1la和图1lb是才艮才居本发明与阳寸生7于照相比的His-MTD-EGFP重组蛋白细胞渗透性的图片。图12a至图12i是根据本发明通过荧光显微镜而使His-MTD-EGFP重组蛋白体内分布可一见化的照片。图13a至图13k示出了总结根据本发明方法识别的MTD肽的特性的表格。具体实施例方式本发明涉及具有促进生物活性分子穿过细胞膜的细胞渗透性的新型大分子转导域(MTD)肽。本发明的MTD肽是能够介导生物活性分子，包括多肽、蛋白质域或全长蛋白质转运通过细胞膜的细胞渗透性多肽。本发明的MTD肽的特征在于其N端具有单个疏水区，形成螺旋结构，表现出柔性，并且具有相对较短的氨基酸(7至7个氨基酸)(参见图la至图lo)。本发明的一种实施方式涉及具有细胞渗透性的分离的MTD肽(其中MTD肽具有选自由SEQIDNO:1-193组成的组的氨基酸序歹'J)、类似物、衍生物、酰胺化变体以及它们的4呆守变体。本领域普通才支术人员能够作出相似的^K戈以获得具有更大细胞渗透性和更宽寄主范围的肽。例如，本发明提供对应于氨基酸序列SEQIDNO:1-193的肽，及其类似物、衍生物和酰胺化衍生物，只要能够保留该肽的细月包渗透性即可。与本文中描述的特定肽相比，对本发明的肽的原发性氨基酸序列进行较少的修饰可以获得具有基本上等同或增强的细胞渗透性的肽。这样的修饰可以是精心设计的，如通过定位诱变来实施，或可以是自发产生的。通过这些修-饰产生的所有肽都包含在本文内，只要仍保持初始肽的细胞渗透活性即可，或在肽酰胺化的情况下，初始肽的细胞渗透性被增强或改变而使酰胺化的肽具有治疗性应用。可以设想，这种修饰对于改变或增强特定的肽的细月包;参透性是有用的。另外，一个或多个氨基酸的缺失也能够对所得分子的结构产生修饰而不会使其细胞渗透性发生任何显著变化。这能够导致可以开发也具有实用性的更小的活性分子。例如，能够去除对于特定肽的细胞渗透性不是必需的氨基-或羧基-端氨基酸。本发明的肽包括本申请中公开的肽的任何类似物、同系物、突变体、异构体或衍生物，只要保持如本文中公开的细胞渗透性即可。所有的肽都是利用L-氨基酸合成的；然而，也能够合成生产所有肽的D构型。另夕卜，負fe够产生C-端衍生物，例如C-端曱基酯和C-端酰胺化物，从而增加本发明的肽的细胞渗透性。变体的氨基酸序列。本文中所使用的术语"保守变体"是指用另一种生物上类似的氨基酸残基替代另一种氨基酸残基。保守变体的实例包括用一种疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙胺酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸取代另一种残基，或者用一种才及性残基取4戈另一种残基，例如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天门冬氨酸，或谷氨酰胺取代天门冬酰胺等。能够相互取代的中度亲水的氨基酸包括天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。术语"保守变体"还包括使用耳又代的氨基酸代替未取代的母体氨基酸，条件是由取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫作用。这样的保守取代也在本发明的肽种类的定义范围内。本发明另一方面涉及编码本发明的上述MTD肽的分离的多核苷酸。典型多核苦酸编码具有选自由SEQIDNO:1-193组成的组的氨基酸序列的MTD肽，及它们的类似物、衍生物、酰胺化变体和保守变体。本发明的编码MTD肽的多核苦酸具有由SEQIDNO:194至SEQIDNO:386表示的核普酸序列。本发明的多核苦酸可以是RNA或DNA的形式，其中DNA包括cDNA和合成DNA。DNA可以是单《连或双《连。如果是单链，则其可以是编码《连或非编码(反义)《连。编石马序列可以与选自SEQIDNO:194-386的核普酸序列相同或可以是不同的编码序列，由于遗传密码的简并或冗余，其中的编码序列编码相同的多核香酸。本发明的多核苷酸也包4舌上述多核苷酸的变体，其编石马以推定的氨基酸序列SEQIDNO:1至193为特征的多核苷酸的片段、类似物，和衍生物。多核苷酸的变体可以是多核苷酸的天然存在的等位基因变体或多核苷酸的非天然存在的变体。本发明的多核苷酸可以一种编石马序列，其是以选自SEQIDNO:194至386的核香酸序列为特征的编码序列的天然存在的等位基因变体。等位基因变体是多核苷酸序列的替代形式，该多核苷酸序列可以具有一个或多个4亥苷酉臾的耳又4戈、在夬失或加入，这基本上不会文变编石马多肽的功能。类似于或同源于本文中/>开序列的序列(例如至少约70%序列同一性)也是本发明的一部分。在本发明其它实施方式中，氨基酸水平的序列同一'1"生可以是约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。在多核普酸7JC平，序列同一性可以是约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。可^lfU也，当多核香酸片段在选择性杂化条件(例如，非常高的严格杂化条件)下杂化时与链的补体基本上相同。多核苷酸可以存在于整个细胞中，存在于细胞溶胞产物中，或以部分纯化的或基本上纯化的形式存在。在本领域中公知，单个氨基酸可以由一个以上的核苷酸密码子编码，以及可以容易地修饰多核普酸从而产生编码相同肽的替代多核苦酸。因此，本发明的其它实施方式包括编码含前述氨基酸序列的肽的替代核苦酸序列。编码含要求保护的氨基酸序列的肽的核酸分子包括编码要求保护的序列和将N-端基或C-端基定位于要求保护的氨基酸序列的任何其它氨基酸的任何组合的核苷酸序列。应该理解，本发明的氨基酸和核酸序列可以包括其他的残基，尤其是N-或C-端基氨基酸或者5'或3'多核苷酸，基本上仍是本文中公开序列中所提出的，只要该序列能够为多核香酸或重组蛋白的蛋白部分赋予膜渗透性即可。本发明还涉及识别具有细J包渗透性的MTD肽的方法。本发明的方法涉及以下步骤1)从多个氨基酸序列数据库识别具有信号序列样结构域的分泌性蛋白；2)从所识别出的分泌性蛋白中选择在N端具有单个疏水区并形成螺4t结构的疏水爿太；以及3)在有效产生适合用作MTD肽的肽的条件下优化和最小化所述选一奪的疏水肽。'为了识别可能渗透质膜的某些候选肽，如在步骤l)中所描述的，从多个氨基酸序列数据库中识别具有信号序列样结构域的分泌性肽。在本发明一种特定实施方式中，通过4吏用几个关4建词如'M言号序列的疏水区"、"信号序列疏水区"、"分泌性蛋白的信号序列"、"疏水信号序列"和"分泌性蛋白的疏水区"将这些分泌性蛋白乂人PubMedEntrez蛋白质数据库中选出来。由此，识別出了超过1500种具有信号序列样结构^^的分泌性蛋白。如本文中所使用的，术语"信号序列样结构域"是指能够介导大分子易位穿过质膜的肽。本文中所使用的术语"信号肽，，是引导蛋白翻译后转运的短(长度为3至60个氨基酸)肽链。信号肽也可以是所谓的輩巴向信号、信号序列、转运肽或定位信号。信号肽的氨基酸序列将蛋白(其在细胞质中合成的引导至某些细胞器，如细胞核、线粒体基质、内质网、叶绿体、非原质体和过氧物酶体。蛋白转运后一些信号肽被信号肽酶从蛋白上切割下来。分泌性蛋白的N-端序列对于转运通过细胞膜是必需的。信号肽的实例可以包括，但不限于，向细胞核的转运(NLS:-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-)、向内质网的4争运(H2N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val國Gly-Ile隱Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gin-)、保留于内质网(-Lys-Asp-Gki-Leu-COOH)、向线粒体基质的转运15(H2N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-)、向过氧物酶体的转运(PTS1:-Ser-Lys-Leu-COOH)、向过氧物酶体的转运(PTS2:H2N—---Arg-Leu-X5-His-Leu-)(其中，HzN是蛋白的N-端，而COOH是蛋白的C-端)。信号序列样结构域的实例可以包括，但不限于，穿膜肽(Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys)、衍生自HIV-1反式激活蛋白Tat的Tat肽(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg画Pro)、纟田月包穿透肽(Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Lys陽Ile-Asn-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu)、BuforinII(#元菌月太BuforinII)(Thr-Arg-Ser-Ser-Arg-Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Arg-Val-Gly-Arg-Val-His-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys)、MAP(冲莫型两亲月大Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Ser-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala)、k-FGF(Ala-Ala-Val-Ala画Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro)、Ku70(Val-Pro-Met-Leu-Lys-Pro-Met-Leu-Lys-Glu)、脱病毒(Me卜Ala陽Asn-Leu—Gly—Tyr—Trp—Leu~Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Thr-Mct-Trp-Thr-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro)、pVEC(Lcu-Leu-Ile-Ile-Leu-Arg-Arg-Arg-lie-Arg-Lys-Gln-Ala-His-Ala-His-Ser-Lys)、pep-1(Lys-Glu-Thr-Trp-Trp-Glu-Thr-Trp-Trp-Thr-Glu-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val)、SynBl(Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Ser-Tyr-Ser-Arg-Arg-Arg-Phe-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Arg)、pep-7(Ser-Asp一Leu-Trp-Glu画Met画Met一Met-Val-Ser-Leu-Ala-Cys-Gln-Tyr)和HN-l(Thr-Ser-Pro-Leu-Leu画Ile-His-Asn國Gly-Gln-Lys-Leu)。接着，如步骤2)中所描述的，从步骤1)中所识別出的分泌性蛋白中选4奪在N-端具有单个疏水区并形成螺^走结构的疏水肽。<吏所有在步骤l)中识别出的具有单个信号序列样结构域的分泌性蛋白经过亲疏水性分析，从而确定它们在N-端是否含有单个疏水区(H-区)，接着进行计算机辅助的染色体组和蛋白质组信息分析以确定它们是否形成螺;旋结构。疏水区通常形成螺力走结构，其赋予了蛋白3争月莫易^[立;舌'I"生(membrane-translocatingactivity)。在本发明的一种实施方式中，SOSUI系统是一种膜蛋白分类和二级结构预测系统，能够用于进行计算机辅助的染色体组和蛋白质组信息分析。SOSUI系统是从蛋白质序列中进行膜蛋白二级结构预测的有用工具，可以免费地在线使用(参见http:〃bp.nuap.nagova-u.ac.ip/sosui)。因为SOSUI系统目前要求所分析的肽长度为具有至少约20个氨基酸，衍生自增强绿色荧光蛋白的N-端域的其它氨基酸被加到信号序列样结构域的末端。使用SOSUI系统时，选择出了220种N-端具有单个疏水区并形成^争月莫螺;旋结构的發u水月太。最后，如步骤3)所描述的，对在步骤2)中选出的疏水肽进行优化和最小化，以使其适合用作MTD肽。为了优化所选4奪的疏水肽，对它们进行如下的经验性修饰i)从所选择的疏水肽中除去疏水、非极性和带正电或负电的氨基酸；以及ii)经验性地产生5种疏水氨基酸的各种组合，5种疏水氨基酸即丙胺酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、脯氨酸(Pro或P)、亮氨酸(Leu或L)和异亮氨酸(Ile或I)。已知所述疏水氨基酸对H-区提供了柔性，这就使得信号序列的疏水区形成发夹样的环，从而导致磷酯双层不稳定的构象变化。这种通过与柔性H-区4妻触而诱导的非双层脂质结构的局部暂时性形成，引起拓朴转换。为了使如上文所述优化的疏水肽的长度最小化，可以采用以下原则来确定应该从其中消除哪些氨基酸i)消除疏水肽左侧或右侧的非疏水氨基酸而使长度最小化，同时保持其疏水区；ii)用疏水氨基酸，脯氨酸(Pro或P)，^f又代疏水肽中间或右侧的非疏水氨基酸从而提供柔性或弯曲的可能性；以及iii)使重复的疏水氨基酸的数目最小化从而减小疏水肽的尺寸。因此，MTD候选肽的特征是经过^f奮饰的肽表现出疏水性和柔性，具有相对4交短的氨基酸(717)长度并形成螺旋结构。才艮据以上描述的本发明的方法，能够识别出具有选自由SEQIDNO:1至193组成的组的氨基酸序列并能够促进生物活性分子穿过细胞膜的新型MTD肽。在本发明的另一种实施方式中，能够通过以下过禾呈来识别一种新型的MTD,JO-98(SEQIDNO:98):i)从PubMedEntrez蛋白质数据库中选出人类免疫^求蛋白结构^或蛋白4(immunoglobulindomaincontaining4，T'淋巴细月包负调节蛋白)作为具有信号序列样结构域的分泌性蛋白；ii)通过亲疏水性分析"i正实所述蛋白含有单个N-端水区；iii)从所述蛋白的全长信号序列中选出疏水区(H-区)，其具有由MGILLGI丄I丄GHLTVDTYGRPIL(长度为23个氨基酸)表示的氨基酸序列；iv)通过采用SOSUI系统进行结构分析，证实所选的疏水区形成螺旋结构；v)删除疏水区左侧的非疏水氨基酸(蛋氨酸M;甘氨酸G)以4吏疏水区的第一个氨基酸变成疏水氨基@臾，發u7K肽具有由ILLGLLLLGHLTVDTYGRPIL(长度为21个氨基酸)表示的氨基酸序列；vi)从疏水区去除碱性氨基酸(组氨酸H;精氨酸R)和亲水氨基酸(苏氨酸T;天门冬氨酸D;酪氨酸Y)以使肽的长度降至不超过15个氨基酸，所得的肽具有由ILLGLLLLGLVGPIL(长度为15个氨基酸)表示的氨基酸序列；vii)结构分析示出了如上所述的修饰的肽形成了螺旋结构；viii)为了给肽赋予柔性，分别用疏水氨基酸，脯氨酸(P)耳又代该的肽中部和右侧处的非极性氨基酸(甘氨酸G)，所得到的肽具有由ILLPLLLLGLVPPIL(长度为15个氨基酸)表示的氨基酸序列；和ix)将肽序列右侧远端处的一些重复疏水氨基酸删除以将肽的长度缩短到IO个或更少的氨基酸。因此，最终优选作为大分子转导域的肽具有由ILLPLLLLP(长度为9个氨基酸；SEQIDNO:98)表示的氨基酸序列并形成螺旋结构，其标示为"K)-98"。JO-98肽的最后一个氨基酸，脯氨酸，是用于与生物活性分子作用以形成重组蛋白的柔性位点。本发明的另一方面涉及利用MTD肽来基因工程i殳计具有细月包渗透性的生物活性分子的方法。生物活性分子的治疗应用经常受限于其细胞渗透性较低。尽管已经证明生物活性分子经由细胞内吞作用过程能够被细胞吸收，<旦中净皮降解。本发明的MTD提供了具有高分子量的生物活性分子穿过细胞膜的有效转运，而先前已经试验的其它膜转运肽均未表现出能够转运大小超过约25个氨基酸的分子。本发明的MTD能够利用本领域的常身见方法连4妻到肽或多肽乂人而增强肽或多肽的膜渗透性。能够以试剂盒的形式提供MTD，该试剂盒包含本领域技术人员已知的用于^足进肽连^姿到耙标多肽的必要成分。以这种方式连^妾到MTD的靶蛋白就能够在体内或体外递送到细胞用于胞内输入。根据本发明的方法，上述的多核苷酸能够插入到蛋白表达载体中以产生通过本文中所描述的MTD肽的作用而能够,人细胞外部进入到细胞内部的蛋白。表达载体经基因工程i殳计以便将在N-端和/或C-端的方向上编码MTD的核酸序列在正确的读码才匡中合并到编石马作为生物活性分子的感兴趣的肽、多肽、蛋白质结构域或全长蛋白的核S臾序列中以{更使由大分子转导域和靶生物活性分子构成的重组蛋白可以进4亍表达。表达载体可以选自那些易于在原核或真核表达系统中4吏用的载体。正如本文中所4吏用的，MTD是本发明的大分子转导域，其引导靶蛋白从细胞外向细胞内进行转运。在本发明另一实施方式中，MTD可以包含一种替代序列，其介导肽或多肽通过细胞膜进入细月包内部。靶蛋白是一种通常表现出跨细胞膜渗透性小于最佳渗透性的蛋白质，但是当其N-端和/或C-端连接到本发明的MTD时，就能够#皮/人细月包外转运到细月包内。在本发明的另一实施方式中，切割位点位于MTD和靶标多月太、蛋白质结构域或全长蛋白之间。该位点可以可选地是因子X位点或本领域^支术人员已知的有关重组蛋白切割乂人而,人目标肽(subjectpeptide)或多肽物理去除MTD的另一位点。本发明的方法提供了一种产生具有用于进入细胞内部的细胞渗透性的蛋白的方式，其中它们的作用有助于进一步说明细胞控制和生物合成机制。这种方法还提供了用于将胞内蛋白引入到细胞中以产生把细胞变化的方法，例如通过引入Bcl-2来抑制细胞凋亡。细胞循环控制，例如，能够通过向这些由于异常p53蛋白而致瘤的细月包中引入功能性p53蛋白产物而改变。如本文中所使用的，术语"生物活性分子"包括只要转运到细胞中就能够表现出生物效应的任4可分子。由于分子量为约100,000~约1百万的非常大的蛋白是通过细胞运出的(例如，抗体、纤维蛋白原和巨球蛋白)，因此非常大的蛋白能够通过本发明的方法进入到细胞内。因此，尺寸范围为几个氨基酸到约一千个氨基酸的蛋白质都能够使用。蛋白质的优选尺寸范围是从几个氨基酸到约250个氨基酸。对于任何分子，尺寸能够高达约1百万的分子量，特别是高达约25,000的分子量，更特别的是高达约3,000的分子量。另外，只有那些能够直接或间^妄地连接到作为信号肽的MTD肽的分子包括在本发明的范围内。生物活性分子的实例包括，但不限于，蛋白质、多肽和肽，其包括生物活性分子的功能结构域，生物活性分子如生长因子、酶、转录因子、毒素、抗原肽(对于疫苗而言)、抗体和抗体片4殳。生物活性分子的其它实例包括核酸，例如质粒、编码核酸序列、mRNA和反义RNA分子、碳水化合物、脂质和糖脂。生物活性分子的其他实例包括治疗剂，尤其是具有低细胞膜渗透性的治疗剂。这些治疗剂的一些实例包括抗癌药物(如道i若红菌素)和有毒化学物质，因为采用本方法给药时其剂量低，因此现在给予这些治疗剂更加安全。生物活性分子的另一实例是抗原肽。进入涉及免疫响应的细胞时可以给予抗原肽以一是供免疫保护。其它实例包括免疫抑制肽(例如，阻断自体反应性T细胞的肽，其是本领域是已知的)。许多其它实例对于本领域技术人员而言是显而易见的。转运蛋白、免疫球蛋白或抗体、结构蛋白、运动功能蛋白(motorfunctionprotein)、受体、信号蛋白和贮藏蛋白(4安照官能区分)，以及膜蛋白、跨膜蛋白、内部蛋白(internalprotein)、外部蛋白或分泌性蛋白、病毒蛋白、天然蛋白、#唐蛋白(glicoprotein)、+刀割蛋白(cleavedprotein)、含有二硫键的蛋白质、蛋白络合物、化学改性的蛋白质和朊病毒(根据它们的位置和作用)。标准重组核酸的方法能够用于表达基因工程设计的重组蛋白。在本发明的一种实施方式中，编码大分子转导域的核酸序列4皮克隆到例如具有用于转录和翻译的合适的信号和处理序列以及调控序列的核酸表达载体中。在另一实施方式中，能够利用自动的有机合成方法来合成该蛋白质。例如文献MethodsinEnzymology,Volume289:Solid-PhasePeptideSynthesisbyGreggB.Fields(Editor),SidneyP.Colowick,Melvin1.Simon(Editor),AcademicPress(1997)中描迷了生产蛋白的合成方法。为了获得克隆的基因或核酸(如编码MTD肽的cDNA)的高水平表达，MTI)序列典型地被亚克隆到含有用于引导转录的强启动子、转录/翻i奪终止子的表达载体中，并且在编石马蛋白质的斥亥酸实例中，被亚克隆到翻译开始的核糖体结合位点。适合的细菌启动子在本4页i或是乂〉杀口的，侈'H口，在Sambrook&Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3dEdition(第三版)，ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(2001)和Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.(1989)中所描述的。用于表达本发明MTD肽的细菌表达系统可以在例如大肠杆菌(Eco//J、芽孑包4干菌(5"c,'〃船sp.)和沙门氏菌"a/附騰〃a)中获得(Palvaetal"G匿22:229-235(1983);Mosbachetal.，A^fwre302:543-545(1983))。用于这种表达22系统的试剂盒可以商购获得。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域/^知的，也能够商购获得。在本发明的另一实施方式中，真核表达载体是腺病毒载体、腺病毒相关载体或逆转录病毒载体。用于表达细胞渗透性重组蛋白的表达载体可包括调控序列，包括例如，启动子，其可^喿作地连4妻到编码大分子转导域的序列。能够4吏用的可诱导的启动子的非限制性实例包括类固醇激素响应性启动子(例如，蜕皮激素响应性的、J难激素响应性的和并唐皮质激素(glutacorticoid)响应性的启动子)、四环素"Tet-On，，和"Tet-Off，系统，以及金属响应性启动子。该结构能够引入到合适的宿主细胞中，例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或组织培养细胞。该结构也能够引入到胚胎干细胞中以产生作为模型对象的转基因生物体。大量适合的载体和启动子对于本领域中技术人员而言是公知的，并且可以商购获4f以用于产生本发明的重纟且体结构。已知的方法能够用于构建含有本发明多核苷酸和合适的转录/翻译控制信号的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术禾口体内重纟且/—遗4专重纟且。参见4列^口，Sambrook&Russell，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3dEdition(第三版)，ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(200l)和Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.(1989)中描述的才支术。适用于产生可渗透重组蛋白的宿主细胞包括细菌细胞和真核细胞(例如，真菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞)。能够通过任何i更利的方法来^皮^争宿主细力包，包4舌冻-融循环法、声解法、积4成-皮石卒-;去，或4吏用纟田月包〉容角竿i式剂。Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,NewYork:Springer-Verlag(1994)描述了i午多用于纯4匕重纟且(和非重组)蛋白的一4殳方法。这些方法可包4舌，例如，离子交换:色谱、尺寸排阻色i普法、亲合色镨法、选择性沉淀法、透析法和疏水作用色语法。这些方法能够适用于设计细胞渗透性重组蛋白的純化策略。如果细胞渗透性重组蛋白包含纯化处理(purificationhandle),例如附加表位(epitopetag)或金属螯合序列，则能够《吏用亲合色谱来很好地进行纯化。可以通过直4妄(例如采用Western分析)或间^接(例如通过分析来自细胞的物质的特异性DNA结合活性，如通过电泳迁移率变动分析)；险测大分子转导域来评价所产生的蛋白的量。可以在纯化之前、纯化任何阶段期间或纯化之后检测蛋白。在一些实施方式中，纯化或完全纯化可以不是必需的。在本发明的具体实施方式中，表达载体是pEGFP-Cl(Clontech,MountainView，CA)，其包含编码包括增强绿色荧光蛋白(EGFP)的重组蛋白的多核苷酸。编码根据本发明的MTD的多核苷酸插入到载体pEGFP-Cl、载体的EGFP基因的5'和/或3'中使得能够表达将MTD和EGFP相结合的重组蛋白。MTD的N-端和/或C-端连接到EGFP,以^!寻EGFP蛋白运载到细月包的内部。通过本发明的方法制备的基因工程设计的重组蛋白是细胞渗透性蛋白并且能够被用作蛋白基的疫苗，而杀灭或削弱整个有才几体的疫苗是不能实施的。通过本发明方法制备的细胞渗透性蛋白还能够用于疾病的治疗，尤其是癌症的治疗。可将细胞渗透性蛋白递送到细月包内部，从而不需要采用重组载体来转染或转化细胞。本发明的细胞渗透性蛋白能够在体外用于研究蛋白质功能或能够用于将细胞维4寺在所需状态。本发明的MTD能够用于在体外或体内将肽、多肽、蛋白质结构域或蛋白递送到靶细胞内部。MTD能够通过由来自重组DNA或RNA分子的重组蛋白的表达形成的肽键而连接到靶蛋白，或者能够通过共价连接到MTD的连接子连接到耙蛋白。共价4建能够用于将本发明的MTD连接于进入细胞内的非蛋白质分子，例如多核香酸。本发明另一方面涉及含有本发明细胞渗透性重组蛋白的药物组合物，其中MTD肽可才栗作;也连4妄于生物活性分子。由本发明方法生产的细胞渗透性重组蛋白可以通过本领域技术人员已知的任何标准方法进行体外给药，例如将重组蛋白加到培养基中。而且，本领域的冲支术人员应该理解，通过本方法生产的重组蛋白可以通过用于蛋白/药物递送的标准方法进行体内递送，包括肠胃外给药、静脉注射给药、局部给药、气雾剂给药或吸入剂给药、口服给药(尤其是以胶嚢剂形式提供时)，或者通过直肠或阴道给药(尤其是以栓剂形式提供时)。给药的实例包括，但不限于，肠胃外给药，例如通过包括区域性灌';主的静脉注射、气雾剂的吸入、皮下或肌肉注射；局部给药，例如向皮肤伤口或病变处局部给药、直接转染到例如制备并随后移植到受治疗者体内的用于移才直的骨髓细胞中，以及直接转染到随后移植到受治疗者体内的器官中。非肠道乡会药，例如区域性灌注，如果4吏用的话，通常的特4正在于注射。可注射的制剂可以4皮制成常夫见剂型，例如液体溶液、混悬液或乳液。也可以使用缓释或持续释放系统以维-持恒定的剂量水平。其它给药方法包括口服给药，特别是当该复合物采用胶嚢包封时，或者直肠给药，特别是该复合物采用栓剂形式时。药用载体包括任何不是生物学上不希望或其它不希望的物质，即，这些物质可以随着所选4奪的复合物一起纟会药到个体体内，而不会导致任何不希望的生物学效应或以有害的方式与所纟合予的药物组合物的其它组分发生相互作用。根据给药的所需方式(例如包括但不限于，静脉内、肠胃外、经皮月夫、皮下、月几肉内、颅内、目艮眶内、目艮内、心室内、嚢内、脊^主内、；也内(intracistemal)、腹月莫内、鼻内、直肠内、阴道内，以气雾剂或口服给药)，药物组合物可以是固体、半固体或液体剂量形式，例如片剂、^r剂、丸剂、力交嚢剂、4分剂、液体、混悬剂、洗剂、霜剂、凝胶剂等，优选以适用于单次给予精确剂量的单位剂量形式。如上文所述，本发明的药物组合物将包4舌与药用载体组合的有效量的细胞渗透性重组蛋白，另夕卜，还可以含有其它医用制剂、药用制剂、载体、佐剂、稀释剂等。对于固体组合物，常规的无毒固体载体包括例如，药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、-友酸镁等。液体药物可给药的组合物能够例如通过将本文中所述的活性化合物和可选的药物佐剂溶解或分散于例如水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等的赋形剂中，并由此形成溶液或混悬液来制备。如果需要的话，所给予的药物组合物也可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH緩沖剂等。制备这种剂量形式的实际方法对于本领i或坤支术人员而言是已知的或者是显而易见的。通过本发明的方法生产的细胞渗透性重组蛋白的给药可以在10分钟至72小时的时间周期范围内进行，特别是通过将重组蛋白加入到i咅养基中来进4亍乡会药用于体外应用时。对于体内或体外应用，相关4支术4贞i或内的寺支术人员可以^艮容易;也确定本发明的方法生产的细胞渗透性重组蛋白的有效给药时间。对于体外或体内应用，细胞渗透性重组蛋白能够以任何有效浓度给予。有效浓度是能够使生物活性分子进入到细胞中的用量。这样的浓度一培养基浓度(体外)或血清浓度(体内)一典型地为约0.1nM至约500iliM。对于特定的重组蛋白和/或特定的靶细胞的最佳浓度能够很容易根据本文中的教导确定。因此，重组蛋白的体内剂量是会使重组蛋白血清浓度为约0.1nM至约500)uM的浓度，更特别的是约0.5nM至约lOOjaM的浓度。所给予的重组蛋白的用量当然会取决于接受治疗的受治疗者、受治疗者的年龄和体重、#会药方式和熟练的给药人员的判断。复合物的精确用量进一步取决于受治疗者的一i&病况、通过给药治疗的病症/病况的严重程度和所选择的具体复合物。然而，本领普通技术人员可利用常规的优化方法，本文中所提供的教导来确定合适的用量。另外，通过本发明方法生产的细胞渗透性重组蛋白能够用于疫苗给药(Linqnanetal.，尺ev.racc/腦6:741-746，2007;0'Haqanetal"M^Ws40:10-19,2009)。利用细胞渗透性重组蛋白的疫苗4是供了一种优于典型肽疫苗的优点。抗原的免疫系统识别耳又决于合适的抗原加工。以前，整个蛋白或蛋白结构域不能被递送到细胞内部而进行加工。因此，代表抗原表位的肽不得不在递送到表示这些表位的小肽的细胞之前进行识别。本发明的方法使得能够将整个蛋白或蛋白质结构域转运到能够发生抗原加工的细胞中。这就在一次,合药中提供了多个抗原表位，并且不需实-验识别用于疫苗开发的特定表位。典型;也，制备这冲羊的疫苗以用于只于人或哺乳动物受治疗者进4亍注射。可注射的疫苗可制备成液体溶液或混悬剂。也可以制备适用于在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。也可以将制剂进ft乳化。活性免疫原的成分经常与能够与活性成分相容的药用栽体混合。合适的载体包括但不限于，水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇，及它们的纟且合。疫苗可以含有其它药剂，如润湿剂或乳化剂、pH緩沖剂或增强疫苗效能的佐剂。疫苗可以常^L地进行肠胃外给药。皮下或力几肉注射是合适的。其它给药方式可以包括口服给药、鼻内给药、直肠给药和阴道给药，这可能涉及将肽免疫原与药用载体如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其它载体组合。口服给药的组合物可以形成溶液、混悬剂、片剂、丸剂、胶嚢剂、緩释制剂或粉剂。本发明的蛋白基疫苗可通过用于将肽释放到肠内腔的肠溶胶嚢来给药。本发明的细胞渗透性重组蛋白可以;故配制成中性形式或盐形式的疫苗。药用盐包括(与多肽的游离氨基基团形成的)酸加成盐以及与无机酸例如盐酸或磷酸，或者与如乙酸、扁桃酸、草酸和酒石酸之类的有才几酸形成的酸加成盐。与多肽的游离羧基形成的盐也可以书f生自无片几石咸，例如钠、钾、铵、4丐或氢氧4匕4失，以及例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇和组氨酸之类的有机石成。疫苗以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效和产生免疫的用量给药。给予的量取决于所治疗的受治疗者，需要考虑，例如，个体免疫系统合成抗体的能力和所需的保护程度。给予的活性成分(肽免疫原)的精确用量取决于医师的判断。合适的剂量范围一般需要每次接种几百毫克的活性成分。对于初次给药和增强性接种，可以改变给药方案，这应该才艮据医师的判断来确定。疫苗的剂量将取决于给药途径并随宿主的大小(size)而变化。而且，本发明的细胞渗透性重组蛋白能够有效用于药物递送系统(SpencerandV画a，尸roc.淑/.Jc"d"&4104:7594-7599，2007;Choietal.,淑.她d12:574-579,2006;Vivesetal"/肠/.C/;缀272:16010-16017,1997;Kumaretal"淑訓448:39-43,2007;Joetal.，淑.她d11:892-898,2005)。28冲艮据本发明的基因工程i殳计具有细胞渗透性的蛋白的方法才是供了一种向细胞递送治疗蛋白产品的方法。本发明与先前描述的细胞外蛋白递送方法的组合提供了一种将蛋白以稳定的功能性形式和控寿奪才莫式递送到细月包内的方法。多肽是采用合适的表达载体和表达系统生产的。通过MTD将N-端和/或C-端定位到待表达的多肽的重组蛋白的表达，为蛋白或多肽赋予了细胞渗透性。通过本领域普通^支术人员已知的和先前描述的方法将稳定性较差的蛋白稳定化。向胞外环境递送是通过提供在合适载体(如微球载体)中的稳定化重组蛋白而完成的。蛋白选择将决定合适的载体和表达系统，以及合适的稳定化技术和递送技术。药物递送系统领域的普通冲支术人员能够/人所4笛述的才支术中选冲奪合适的技术。本发明的方法提供了一种生产用于治疗癌症的细胞;参透性蛋白的方法。人们已经发现细胞凋亡和细胞循环控制的调节剂在肿瘤形成中起到关键作用，同时采用编码p53基因的腺病毒表达载体的瘤内注射的基因疗法净支术(Balagganetal,,7T7erapy13(15):1153-1165,2006;Kuoetal.,尸rac.淑/.10;98(8):4605-4610,2001)已经显示出控制某些肿瘤的前景。然而，已经证实特异性蛋白产品通过采用病毒载体递送存在^艮多问题。本发明的MTD和方法提供了一种从细胞循环调节剂和凋亡调节剂中生产细胞渗透性蛋白，以及识别的在癌症状态发展中起作用的其它蛋白的方法。例如，在本发明的一种实施方式中，编石马p53基因的多核苷酸能够被插入到合适的载体中，本发明MTD序列的5'或3'。在本领域技术人员已知的适合于所选择载体的表达条件下，包含MTD和p53蛋白的重组蛋白就能够被表达。MTD与p53蛋白的连接为p53蛋白赋予了细胞渗透性，可将蛋白给予到肿瘤细胞以抑制肿瘤发展。细胞渗透性蛋白的给予可以各种方式来实施，包括但不限于，肿瘤内注射、浸渍(infusion)和,争月永内乡合药。Bax和BclxL是已经确定影响细胞循环控制和细胞凋亡的众多蛋白中的蛋白的其它实例，因此其对于癌症疗法也是有效的。本发明的方法才是供了一种用于向胂瘤细胞递送抗致瘤蛋白的更有效、劳动强度较d、且成本较低的方法。本文中所使用的术语"细胞膜"是指将细胞或细胞组从胞外空间分离的含脂质屏障。细胞膜包括4旦不限于，质膜、细胞壁、胞内细胞器膜，如线粒体膜、细胞核膜等。本文中所使用的术语"生物活性分子"是指能够诱发或修饰系统内生物应答的化合物或分子。生物活性分子的非限制性实例包括抗体(例如，单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体等)、胆固醇、激素、抗病毒素(antiviral)、肽、蛋白、化疗药物、小分子、维生素、辅助因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反义核酸、形成寡核苷酸的三倍体、2,5-A嵌合体、siNA、siRNA、miRNA、RNAi抑制剂、dsRNA、同种异型酶、核酸适体、诱捕分子(decoy)及它们的类似物。本发明的生物活性分子还包括能够介导其它生物活性分子例如脂质和聚合物(如多胺、聚酰胺、聚乙二醇和其它聚醚)的药物代谢动力学和/或药效动力学的分子。在某些实施方式中，术语"生物活性分子"可以与术语"大分子"互换使用。本文中使用的术语"大分子"是指大的分子(分子量超过1000道尔顿)，典型的大分子为，^旦不限于肽、蛋白、以及生物或合成来源的寡核苷酸和多核苷商吏。本文中使用的术语"肽"是指由D-或L-氨基酸或D-和L-氨基酸的混合物通过肽考建连4妻的单链构成的化合物。优选地，肽的长度为含有至少2个氨基酸残基且少于约50个氨基酸。本文中使用的术语"蛋白"是指由通过肽4建连接的线形排列的氨基酸构成的化合物，与肽相对的是，蛋白具有明确的构象。与肽相对的是，蛋白优选含有50个或更多个氨基酸的《连。本文中使用的术语"多肽"是指至少两个氨基酸残基的聚合物，并且其含有一个或多个肽4建。多肽包括肽和蛋白，无i仑多肽是否具有明确的构象。本文中使用的术语"核酸"是指寡核苷酸或多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，以及RNA或DNA的类似物，其例如由核芬酸类似物构成，其中的任何核苷酸类似物都是单《连或双链形式。在本文中，氨基酸残基是指以标准单字母或三字母符号或以其全名表示的氨基酸A，Ala,丙胺酸；C，Cys，半月光氨酸；D，Asp,天门冬氨酸；E，Glu，谷氨酸；F，Phe，苯丙氨酸；G，Gly，甘氨酸；H，His,组氨酸；I，Ile，异亮氨酸；K，Lys,赖氨酸；L，Leu,亮氨酸；M，Met，蛋氨酸；N,Asn,天门冬酰胺；P,Pro,月甫氨酸；Q，Gin,谷氨酰胺；R，Arg，4青氨商史；S，Ser,丝氨酉夂；T,Thr,苏氨酸；V，Val,缬氨酸；W，Trp,色氨酸；X，Hyp，轻基脯氨酸；和Y，Tyr，酪氨酸。本文中使用的术语"大分子转导域(MTD)"是指促进大分子向细月包内转运的肽。本文中4吏用的术语"分离的"多核普酸是指基本上脱离(free)于自然界中与其相结合的序列的多核苷酸。基本上脱离是指至少50%,优选至少70%,更优选至少80%,以及甚至更优选至少90%脱离于在自然界中与其相结合的物质。如本文中所使用的，"分离的"多核苷酸也指重组多核苷酸，由于来源或才喿作(l)它与自然界中与其相结合的多核苷酸的全部或部分不结合(associate),(2)它一皮连接到除了自然界中与其连接的多核苷酸之外的其他多核苦酸，或(3)它在自然界中不存在。本文中所用的术语"可操作地连接"是指启动子的DNA片段、MTD肽或其它基因充分连接/人而引导和调节基因的表达。本文中使用的术语"同源性"或"相似性"是指两个序列(例如，多核苷酸或多肽序列)之间的相似程度或同一性百分数。通常，序列中相似性越高意味着在物理或化学性质或生物活性方面更具相似性。除非另外明确指出，本文中所4吏用的所有^支术和^j"学术^"都与本发明所属领域普通一支术人员所通常理解的意义相同。尽管类似或等同本文中所描述的^壬^可方法和材冲+也可以用于本发明的实施或试一验中，现在还是要描述具体的方法和材冲牛。本文中才是及的所有出版物都以其全文结合于此作为参考以公开并描述与引用的出版物有关的方法和/或材^K必须注意，除非上下文明确另外指出，本文中和所附权利要求中所使用的单数形式"一个"、"一种"和"所述(或该)"都包括复数对象。本文中所讨i仑的出版物仅4是供其在本申请的申请日前的>开内容。本文中的任何内容都不能被解释为承认由于先有发明而使本发明不是先于这些出版物。而且，所提供出版物的日期可能不同于需要独立确认的实际出版日期。实施例提出以下实施例以用于辅助本发明的实施者，为本发明提供实验支持，以及提供模型方案。不能以任何方式将这些实施例理解成对本发明的限制。实施例1-新型大分子转导域肽的识别为了识别能够潜在地渗透穿过活细胞质膜的新型大分子转导域(MTD)候选肽，利用几个关键词，包括"信号序列的疏水区"、"信号序列疏水区"、"分泌性蛋白的信号序列"、"疏水信号序列"和"分泌性蛋白的疏水区，，从PubMedEntrez蛋白数据库中选择出具有信号序列样结构域的分泌性蛋白。由此，选出了多于1，500种具有信号序列样结构域的分泌性蛋白。对所有选择出的具有信号序列样结构域的分泌性蛋白进行亲疏水性分析以确定它们在它们的N-端是否含有单个疏水区。随后，对其进行计算机辅助染色体组和蛋白质组信息分析，即SOSUI系统("V在http:〃bp.nuap.nagoyau.ac.jp/sosui上的4葛述),以确定它1"门是否形成了螺旋结构。由于SOSUI系统目前要求待分碎斤的肽的长度为至少具有约20个氨基酸，因此将书t生于增强绿色荧光蛋白的N-端结构域的其他氨基酸加到信号序列样结构域的末端。使用SOSUI系统时，选出了220种在N-端具有单个發u7K区并形成3争J莫螺》走结构的肽序列。饰如下首先，从所选择的肽序列中去除疏水、非极性和带正电或负电的氨基酸；然后，经验性地产生5种疏水氨基酸(即丙胺酸A,缬氨酸V，脯氨酸P,亮氨酸L,异亮氨酸I)的各种组合。之后，去除肽序列的左侧或右侧的非疏水性氨基酸以使尺寸最小化，同时保持其疏水区，接着通过添加脯氨酸或用脯氨酸取代肽序列中部或右侧的非疏水氨基酸而为肽提供柔性。最后，4吏重复的疏水氨基酸数目最小化从而减小肽序列的长度。所得的作为表现出疏水性和柔性的MTD候选肽的肽具有相对短的氨基酸(长度为7至17个氨基酸)，并形成螺旋结构。根据以上描述的方法，识別出193种新型MTD肽，其具有分别由SEQIDNO:1至193表示的氨基酸序列，并且能够l煮助生物活性分子穿过细胞膜。这193种MTD分别标示为JO-001至JO-193，其结构特4正和序列如图la至图lo所示。实施例2-融合到MTD的重纟且蛋白的表达在证实上述实施例1识別的MTD进入细胞的可4亍性后，采用增强(型)绿色荧光蛋白(EGFP)作为全长蛋白受载分子。绿色荧光蛋白(GFP)是从水母(维多利亚多管水母，Wctonh)中克隆的蛋白。GFP是最广泛使用的报告子蛋白之一，当用蓝光或UV光照射时会产生纟录光(Inouyeetal.，F五SS丄e"e"351(2):211-14(1994))。在本发明的一种实施方式中，使用可商购获得的GFP表达载体pEGFP-Cl(Clontech)。由pEGFP-Cl编码的EGFP蛋白是野生型GFP的突变体，其被修饰以产生更强的绿光。另夕卜，当外来基因插入到pEGFP-Cl载体的多个克隆位点时，所插入的外来基因以与EGFP—起的重组蛋白的形。为了构建融合到每一新型MTD(His-MTD-EGFP:HME)(图2)的EGFP蛋白的表达载体，通过使用以下表1和表2中描述的寡核苦酸作为引物组(正向引物SEQIDNO:393至585用于MTDJO-1至JO-193;反向引物SEQIDNO:586用于MTDJO-1至JO-193)并使用pEGFP-CI质粒为模板来实施聚合酶链反应(PCR)。PCR的条件是初始在95°C下变性5分4f后，在95。C下45秒、在68。C下45秒以及在72。C下1分钟进4亍30次循环，并在72。C下进4亍5分钟的最后延伸。用限制性内切酶iV&I消化扩增的PCR产物，并进行琼脂糖凝胶电泳。衍生自kFGF-416mer的MTD(FGF誦V，AAVALLPAVI丄AI丄AP,Linetal.,乂C7^r",275:16774-16778,2000;Veachetal"J.肠/.C7z匿279:11425-11431,2004)、书t生自kFGF-412mer的MTD(FGP-J,AAVIXPVKLAAP,Joetal"淑肠fec/z.19:929-933，2001;Joetal";Vaf.MeJ.11:892-898,2005(SEQIDNO:389))、书亍生自HIV-Tat的蛋白质4争导》或(H1V-Tat,YGRKKRRQRRR,Schwarzeetal.,Sc,e"ce285:1569-1572,1999)，和HIVTat同源物(Hph画1,YARVRRRGPRR)用作阳性对照，错义肽(scramblep印tide)(SEQIDNO:387)用作阴性对照。如图3a至图3c所示，证实了编码MTD-EGFP的DNA片段被成功扩增。<表1>每一MTD-EGFP蛋白的PCR正向引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表<2>每一MTD-EGFP蛋白的PCR反向引物序列MTDSequenceSEQIDNOJO-1933'-TTATCTAGATCCGGTGGATCCCGGGCC-5'586参照图4a,根据TA克隆方法，采用T4DNA连接酶将每一PCR扩增产物亚克隆到pGEM-Teasy载体(Promega,MadisonWI，USA)中，然后转化大肠杆菌DH5a，在含有50)Lig/mL氨千西林、IPTG和X-gal的LB平板培养基上选才奪转化体。在插入到pGEM-Teasy载体中的重组片段通过用限制性内切酶7V^el处理而分离后，对其实施0.8%琼脂斗唐凝月交电泳。由此，4全测到约lkb的DNA片,殳和约3kb的载体片段，这证实了MTD-EGFP的插入DNA—皮适当地亚克隆到pGEM-Teasy载体中(图4b至图4d)。如图5a所述，每一编码MTD-EGFP的分离的插入DNA片段4皮克隆到大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)(,人Novagen,Madison,WI商购获得)中。pi-:T-28a(+)质粒被设计用于促进N-端或C-端的His-标记融合，并从T7噬菌体启动子开始在大肠杆菌中^是供基因的强表达。在每一MTD-EGFP编码基因的3'端，编码序列在A^fe/4立点处被框内融合至His-标记序列，接着是翻译终止密码子，其结果是产生具有6个组氨酸残基的MTD-EGFP重组蛋白，该组氨酸残基是为了易于在镍柱上纯化而加到C-端的。如图5b至图5c所示，用限制性内切酶虽fe/处理克隆并进行琼脂#唐;疑月交电>永之后，i正实才全测到约lkb的DNA片^史和约5kb的载体片,殳，这i正实了MTD-EGFP的插入DNA被克隆到pET-28a(+)载体中。而且，除了这193种新型MTD外，还发王见148个MTD被成功克隆以用于His-MTD-EGFP重组蛋白的表达。实施例3-融合到MTD的重组蛋白的可i秀导表达和纯化为了表达如以上实施例2的描述而制备的融合到MTD的细月包渗透性重组蛋白，分别在BL21(DE3)、BL21-Gold(DE3)、BL21-CodonPlus(DE3)和BL21-GoldpLysS(DE3)菌才朱中專争染包含His-MTD-EGFP重组蛋白的表达载体。包含kFGF4书亍生的MTD(SEQIDNO:387)的EGFP表达载体用作阳性对照，而融合到不具功能的错义肽(SEQIDNO:389)的EGFP表达载体用作阴性对照。转染之后，使细胞在含有卡那霉素(30pg/mL)的LB培养基中于37。C剧烈振荡下生长，直至光密度600(OD600)达到0.4至0.6之间。然后向其中加入IPTG(异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷)至最终浓度为0.6mM,以诱导His-MTD-EGFP重组蛋白的表达。蛋白i秀导在37°C下延续3小时。将在大肠杆菌中用IPTG表达的His-MTD-EGFP重组蛋白上样到SDS-PAGE凝胶，用考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)染色，然后脱色。如图6a和图6b所示，除了一些在BL21-GoldpLysS(DE3)菌林中表达的His-MTD-EGFP重组蛋白之外，大多数His-MTD-EGFP重组蛋白在BL21-CodonPus(DE3)中高水平地表达。几种His-MTD-EGFP重组蛋白没有表达。His-MTD-EGFP重组蛋白在大肠冲干菌系乡充中的可i秀导表达导致形成不可溶的聚集体，这就是已知的包含体。为了完全溶解这些包含体，通过将所有以上表达的蛋白溶解于8M脲中而使其变性。变性的His-MTD-EGFP重组蛋白通过组氨酸标记亲合色谱法用次氮基三乙酸镍树脂(Qiagen，Hilden,德国)进行纯化。由于强变性剂(如8M脲)完全溶解了包含体，因此在pH依赖性的变性条件下实施纯4匕方法。45通过在4000xg下离心20分钟收获大肠杆菌培养液，将其再悬浮于溶胞緩冲液(IOOmMNaH2P04，10mMTris'Cl，8M脲，pH8.0)产物在7000xg下离心20分钟，以便将上清液与细胞碎片沉淀分离。取出上清液，然后用溶胞緩冲液平衡的Ni-NTA树脂在轻微振荡(釆用^走转纟展荡器)下温育2小时至过夜。用清洗纟l冲液(100mMNaH2P04，10mMTris'Cl，8M脲，pH6.3)冲洗5次后，用洗脱纟爰冲液(100mMNaH2P04，10mMTris.Cl，8M脲，pH4.5)洗脱结合于树脂的蛋白。在以上描述的变性条件下在SDS-PAGE凝胶上分析纯化的His-MTD-EGFP重组蛋白，并用考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)染色，在此，其结果如图7a和图7b所示。为了使以上经纯化的His-MTD-EGFP重组蛋白复性，通过除去变性剂而使变性蛋白再折叠(refold)。通过对折叠緩冲液(0.55M盐酸胍，0.44ML-4青氨酸，50mMTris-HCl,150mMNaCl,1mMEDTA，100mMNI)SB,2mM氧化型谷胱甘肽和0.2mM还原型谷胱甘肽)渗析蛋白而从蛋白中除去脲。所有的再折叠重组蛋白对生理緩冲液如细胞培养基(例如，达尔伯克改良伊格尔(氏)培养基:DMEM)渗析9小时。在用DMEM取代折叠纟爰沖液之后，就为体内和体外测定所有纯化重组蛋白的细胞渗透性做好了准备。根据如图8中所示的SDS-PAGE分析结果，除了148个如以上实施例2中的描述构建的转化体之外，在112个转化体中可视化检测His-MTD-EGFP重組蛋白的可诱导表达，而4个His-MTD-EGFP重组蛋白的表达不足以被可^见化纟全测，但对于细胞渗透性分析充分纯化了。以可溶的形式制备116个His-MTD-EGFP重组蛋白。实施例4-融合到MTD的重组蛋白的定量细胞渗透性测定为了定量4全测His-MTD-EGFP重组蛋白的细胞渗透性，如以上实施例3描述的以可溶形式纯化的116个重组蛋白与0.7pg/|al的焚光素异硫氰酸酯(FITC)混合，边搅拌边在室温下反应1小时。反应;容液对达尔伯克改良伊"格尔(氏)培养基(DMEM;WeiGENEInc.,韩国)透析2天直至FITC完全^皮除去并由此荻得结合FITC的重组蛋白。用10|uM的FITC-标记蛋白处理衍生自小鼠巨嗟细胞的RAW264.7细月包。将RAW264.7细月包j呆持于用10%胎牛血清和1%青霉素(500mg/mL，WelGENEInc.)4卜充的DMEM中，在37°C于空气中5。/。C02潮湿气氛下培养。J咅养之后，该细力包用10iuM以上制备的每一结合FITC的重组蛋白在37。C下温育1小时，接着用Trypsin/EDTA(T/E,Invitrogen，CarlsbadCA,USA)对其进4亍处理，以除去细胞表面结合蛋白并用冷PBS冲洗3次。对结合FITC的His-MTD-EGFP重组蛋白实施荧光激活细月包分选(FACS)分析(FACSCalibur,Beckton-Dicki励n，SanDiegoC4，USA)。对于每一样品，通过4吏用CellQuestPro细月包计ft分析软件(cytometricanalysissoftware)只于纟田月包(1><104)进4亍分碎斤。每一实验至少进行两次。将融合到新型MTD(JO-1至JO-193)的每一His-MTD-EGFP重组蛋白的细胞渗透潜能与融合到kFGF4衍生的MTD的阳性对照蛋白的细月包渗透潜能进4亍可一见化比專交。图9a至图9g示出了流式细胞术分析的结果，其中灰色填充曲线仅表示细胞，黑色曲线仅表示FITC,蓝色曲线表示阴性对照(4晉义肽)的细胞渗透性，红色曲线表示阳性对照(kFGF4书亍生的MTD)的细胞渗透性，绿色曲线表示每一重组蛋白的细胞渗透性。为了评<介哺乳动物细月包体内的每一种MTD的细月包〉参透性，通过评价在用每一种结合FITC的His-MTD-EGFP重组蛋白培养后的中值荧光(medianflurescence)的变化，将His-MTD-EGFP重组蛋白的细月包才聂耳又^:率与融合到kFGF4书亍生的(或"彩r生自kFGF4的，，)MTD的阳性对照蛋白和融合到错义肽的阴性对照蛋白进行比较。参照图9a至图9g所示的结果，用10nM结合FITC的His-MTD-EGFP蛋白在37°C下处理1小时的细胞都没有发生中值荧光变化，以至于处理后的中值焚光显著地低于用阴性对照处理的细胞的中值荧光。相反，除了111个测试的蛋白之外，80个His-MTD-EGFP重组蛋白表现出比阳性对照的中值焚光高0.5倍(50%)或更高的荧光信号。这些结果表明，一些与受载分子EGFP融合的新开发的新型MTD表现出显著高水平的质膜渗透能力，其足以向活细胞内递送例如蛋白质的大分子。实施例5-融合到MTD的重组蛋白的细胞渗透性和胞内定位的测定除通过流式细胞4义测试的111种结合FITC的His-MTD-EGFP重组蛋白夕卜，选4奪60种His-MTD-EGFP重组蛋白以用于其细月包;参透性和胞内定位的可—见化。在它们之中，50种His-MTD-EGFP重组蛋白表现出比(与融合到kFGF4衍生的MTD的阳性对照蛋白相比的)0.5#"更高的细胞渗透性。NIH3T3细月包不用d叉纟田月包)FITC处理或用FITC(^f又FITC)处理，或者用结合FITC的重组蛋白如阴性对照(His-4晉义肽-EGFP)、阳性对照(His-kFGF4书亍生的MTD-EGFP)或融合到新型MTD的重组蛋白(His-MTD-EGFP)来处理，并通过共焦激光扫描显微镜可视化观察。NIH3T3纟田月包在8-孔腔室玻片(LabTek,NalgenNunc,RochesterNY,USA)中培养24小时。细胞在37。C在5%C02中保持于用10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素补充的DMEM中。用PBS冲洗细胞3次，然后用DMEM、DMEM+游离F1TC、或含10juM结合FITC的重纟且蛋白的DMEM在37°C在5%48C02中处理1小时。处理1小时之后，在室温下在4%多聚甲醛(PFA)中将细胞固定20分钟以用于观察。为了内在化的结合FITC的重组蛋白的直4妄4企测，用PBS沖洗细胞3次，并用浓度为ljag/ml的石舆化吡卩定(PI，Sigma-Aldrich，StLouisMO,USA)核焚光染色溶液复染。PI染色5分钟后，用PBS沖洗细胞3次，并用具有DABCO(Fluca，StLouisMO，USA)的聚乙烯醇封固剂(mountainmedium)固定。通过共焦激光扫描显孩吏镜在所分析的单个细胞中部测定荧光的胞内分布，结果如图10a至图10i所示。对于FITC特定于每一荧光染料的参数如下在488nm光下激发，用530nm带通滤波器检测。出人意料的是，如图10a至图10i、图11a和图llb所示，结合FITC的His-MTD-EGFP重组蛋白与融合到错义肽的阴性对照蛋白相比，主要在细胞质中或主要在细胞核中分布良好(JO-13,-18,-49,-58,-68,-101,-108,-116,-118,-122,-123,-127,-132,-133,-136,-138,-140，-148,-162，-169,-170和-172)或者在二者中都分布良好。10个MTDs(JO-17,-18,-21,-31，-41，-49，-88，-107,-116和-169)，其展示出比0.5倍(与阳性对照(1.0-倍)相比)更低的细胞渗透性，在lh处理后表现出较弱的胞内定位能力。这些结果完全与流式细胞术分析的结果一致。实施例6一融合到MTD的重组蛋白的体内组织分布的测定从由流式细胞仪检测的111个结合FITC的重组蛋白(或称"FITC结合的重组蛋白")中选择43个重组蛋白，用于体内组织分布能力分析。仅仅FITC(DMEM+游离FITC)、阴性对照(融合到4昔义肽的结合FITC的重组蛋白)、卩曰性，寸照(融合到kFGF4书亍生的MTD的结合FITC的重组蛋白)或His-MTD-EGFP重组蛋白(融合到所选新型MTD的结合FITC的重组蛋白)以300jag/500pl/只小鼠的剂量分别腹膜内注射到Balb/c小鼠(6周龄、雌性，CentralLab.AnimalInc.,韩国)体内。2小时后，^是取每只小鼠的6个器官(即，肝、肾、脾、肺、心脏和脑)，用PBS冲洗，并用O.C.T.化合物(Sakura,日本)在干冰上快速冷冻。利用冷冻切片才几(amicrotomecryostat)(Sakura)制备每个纟且织的4氐;显+刀片(20ium厚)，》丈置于载玻片上，然后封固于Vectashield封固剂(Vectalab,BurlingameCA,USA)中。通过荧光显孩H竟(Nikon，日本)分析所选的新型MTD的体内组织分布，其结果如图12a至图12i所示。在阴性对照中，没有显著水平的荧光。相反，融合到kFGF4衍生的MTD的阳性对照蛋白在所有器官中都显示出良好分布的荧光活性。对于用融合到所选的新型MTD的重《且蛋白注射的小鼠，通过流式细胞仪检测的、比阳性对照高0.5倍或更高的细胞渗透性的大多数MTD在所有器官中都显示出相对较强的体内组织分布能力，l旦是在这些器官中还存在一些细孩史的差异。具体而言，JO-13(1.3-倍)和JO-133(1.5倍)MTD在除了脑之外的所有器官中都分布專交好。这些结果表明，通过流式细月包4义和共焦〗敫光扫描显孩"竟i正明新型MTD具有强细胞渗透性和/或胞内定位能力，能够有效介导体内和体外大分子胞内转导。总之，根据本发明方法识别的大分子转导域(MTD)肽具有如图13a至图13k所示的可诱导蛋白表达、纯化和细胞渗透性的特征。已经参照具体实施方式对本发明进行了详细描述。然而，本领域技术人员应该理解，在不偏离本发明的原则和精神的前提下，可以对这些实施方式进行改变，本发明的范围由所附权利要求和其等价物限定。权利要求1.一种能够介导生物活性分子向细胞内转运的分离的大分子转导域(MTD)肽，其中，所述肽具有选自由SEQIDNO1-193组成的组中的氨基酸序列。2.—种编码4艮据斥又利要求1所述的大分子转导i或(MTD)肽的分离的多核苷酸。3.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸具有选自由SEQIDNO:194-386纟且成的纟且中的冲亥苦酸序列。域(MTD)肽的方法，包括从多个氨基酸序列数据库识别具有信号序列样结构域的分泌性蛋白；乂人所述识别出的分泌性蛋白中选冲奪在N端具有单个逸乾水区并形成螺旋结构的疏水肽；以及在有效产生适合用作MTD肽的肽的条件下优化和最小化所选择的疏水肽。4.5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述信号序列样结构域选自由穿月莫肽(Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn画Arg-Arg國Met-Lys-Trp-Lys-Lys)、书亍生自HIV-1反式激活蛋白Tat的Tat肽(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Pro)、纟田月包穿透月太(Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Lys-lie-Asn-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu)、BuforinII(Thr-Arg-Scr-Ser-Arg-Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Arg-Val-Gly-Arg-Val-His-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys)、MAP(才莫型两亲月太Lys-Leu—Ala-Leu-Lys-Ala-Ser画Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala画Leu-Lys-Leu-Ala)、k-FGF(Ala-Ala-Val國Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro)、Ku70(Val-Pro-Met-Leu-Lys-Pro-Met-Leu-Lys-Glu)、朊病毒(Met國Ala-Asn-Leu-Gly画Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Thr-Met-Trp-Thr-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro)、pVEC(Leu-Leu-Ile-Ile-Leu-Arg-Arg-Arg-Ile-Arg-Lys-Gln-Ala-His-Ala-His-Ser-Lys)、pep-1(Lys-Glu-Thr-Trp-Trp-Glu-Thr-Trp-Trp-Thr-Glu-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys画Lys-Arg-Lys-Val)、SynB1(Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Ser-Tyr-Ser-Arg-Arg-Arg-Phe-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Arg)、pep—7(Ser—Asp-Leu—Trp-Glu國Met画Met-Met-Val一Ser-Leu陽Ala-Cys-Gln-Tyr)和腦-l(Thr-Ser國Pro画Leu-Leu-Ile-His-Asn-Gly-Gln-Lys-Leu)组成的组。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述氨基酸序列数据库选自由PubMedEntrez蛋白彰:据库组成的组。7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述优化和最小化步骤通过以下步-骤实施除去所述选4奪的疏水肽的左侧或右侧的非疏K氨基酸以使所述肽的长度最小化，同时保持其疏水区；用疏水氨基酸、脯氨酸替换所述选4奪的疏水肽中部或右侧的非疏水氨基酸，从而提供柔性；以及使重复的疏水氨基酸的#t目最小化以减小所述肽的长度。8.根据权利要求4所述的方法，其中，由所述优化和最小化产生的所述MTD肽表现出细胞渗透性、疏水性和柔性，其具有的长度为约7至约17个氨基酸，并形成螺;旋结构。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述MTD肽具有选自由SEQIDNO:1-193組成的组中的氨基酸序列。10.—种具有细胞渗透性的分离的重组蛋白，包含具有选自由SEQIDNO:1-193组成的组中的氨基酸序列的大分子转导域(MTD)肽；以及生物活性分子。11.才艮据斥又利要求IO所述的分离的重组蛋白，其中，所述生物活性分子选自由蛋白、多肽和肽组成的组。12.才艮据权利要求10所述的分离的重组蛋白，其中，所述生物活性分子选自由生长因子、酶、转录因子、毒素、抗原肽、抗体和抗体片^殳组成的纟且。13.根据权利要求12所述的分离的重组蛋白，其中，所述生物活性分子选自由酶、激素、转运蛋白、免疫^求蛋白、抗体、结构蛋白、运动功能蛋白、受体、信号蛋白、贮藏蛋白、膜蛋白、跨膜蛋白、内蛋白、外蛋白、分泌性蛋白、病毒蛋白、天然蛋白、糖蛋白、切割蛋白、含有二硫键的蛋白、蛋白络合物、化学4奮饰蛋白和朊病毒组成的组。14.4艮据^又利要求10所述的分离的重组蛋白，其中，所述生物活性分子选自由核S交、编码核酸序列、mRNA、反义RNA分子、碳水化合物、脂质和糖脂组成的组。15.根据权利要求10所述的分离的重组蛋白，其中，所述生物活性分子是治疗剂。16.根据权利要求15所述的分离的重组蛋白，其中，所述生物活性分子选自由治疗药物和有毒化学品组成的组。17.—种基因工程i殳计具有细胞渗透性的生物活性分子的方法，包括在有效产生具有细胞渗透性的生物活性分子的条件下将大分子转导域(MTD)肽连接至生物活性分子，其中，所述MTD肽具有选自由SEQIDNO:1-193组成的组中的氨基酸序列。18.才艮据权利要求17所述的方法，其中，所述连冲妾包括将MTD肽连一妻至所述生物活性分子的N-端、C-端、N-端和C-端两端或中部。19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述连接包括将MTD肽通过肽键连接至所述生物活性分子。20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述连接包括将MTD肽通过共价键连一妻至所述生物活性分子。21.—种将生物活性分子转运到受治疗者的细胞内的方法，包括向受治疗者给予含有连接至生物活性分子的大分子转导域(MTD)肽的细胞渗透性重组蛋白，其中，所述MTD肽具有选自由SEQII)NO:1-193组成的组中的氨基酸序列。22.大分子转导域(MTD)肽在药物递送中的应用，其中，所述MTD肽具有选自由SEQIDNO:1-193组成的组中的氨基酸序列。23.大分子转导域(MTD)肽在疫苗给药中的应用，其中，所述MTD肽具有选自由SEQIDNO:1-193组成的组中的氨基酸序列。24.大分子转导域(MTD)肽在蛋白疗法中的应用，其中，所述MTD肽具有选自由SEQIDNO:1-193组成的组中的氨基酸序列。25.大分子转导域(MTD)肽在基因疗法中的应用，其中，所述MTD肽具有选自由SEQIDNO:1-193组成的组中的氨基酸序列。全文摘要本发明公开了促进生物活性分子穿透细胞膜的新型大分子转导域(MTD)肽。本文还公开了编码MTD肽的多核苷酸，识别MTD肽的方法；通过采用MTD肽遗传工程设计具有细胞渗透性的生物活性分子的方法，通过采用MTD肽将生物活性分子输入到细胞中的方法，及其用途。文档编号C07K7/04GK101616928SQ200880003468公开日2009年12月30日申请日期2008年1月29日优先权日2007年1月29日发明者宋珍京,朴警湄,杜兰凤,杜翠娥,杨铭三,林贞姬,赵大雄,金珍淑,高在仙申请人:株式会社普罗赛尔制药