结合人树突和上皮细胞205(dec-205)的抗体的制作方法

专利名称：结合人树突和上皮细胞205(dec-205)的抗体的制作方法
结合人树突和上皮细胞205(DEC-205)的抗体相关申请本申请要求2007年11月7日提交的美国临时申请61/002253和2008年9月10 日提交的美国临时申请61/191551的优先权，这些申请的内容通过参考并入本文。
背景技术：
树突细胞(DC)是免疫系统的特化细胞。DC具有通过以结合到细胞表面主要组织 相容性复合物(MHC)分子上的肽的形式呈递抗原以启动初级和次级T和B淋巴细胞应答的 独特能力。树突细胞的抗原呈递功能已经与人树突和上皮细胞205受体(DEC-205)的高水 平表达相关联(Jiang 等(1995) Nature 375(11) 151)。DEC-205是主要在树突细胞上发现的内吞受体，但是也在B细胞、脑毛细血管、骨 髓间质、肠绒毛和肺气道的上皮以及胸腺的外质上皮和周围淋巴器官的T细胞区域中的树 突细胞上发现。DEC-205在淋巴器官的T细胞区域中的DC上高水平表达(Kraal等(1986) J. Exp. Med. 163 981 ；Witmer-Pack 等(1995) Cell. Immunol. 163 :157)。DEC-205 具有 10 个 膜外部的、相邻的C型凝集素结构域(同上；Mahnke等(2000) J. Cell Biol. 151 :673)，这些 结构域介导体内抗原的有效加工和在MHC II类产物上的呈递(Hawiger等(2001) J.Exp. Med. 194 769)。已经证明，通过DEC-205吸收途径靶向至DC的少量的注射抗原能够诱导实 体周围 CD8+T 细胞耐受性(Bonifaz 等(2002) J. Exp. Med. 196(12) 1627)。尽管最近在树突细胞的表征方面取得了进展，但是关于树突细胞特异性受体如 DEC-205所知甚少，并且很少能够获得树突细胞特异性的试剂。与树突细胞特异性或优先反 应(例如通过DEC-205)的试剂，特别是抗体，具有作为靶向试剂诱导对肿瘤或传染病抗原 的强免疫应答的巨大潜力。这些细胞特异性靶向剂可以被工程化，以递送毒素，从而消除骨 髓和器官移植或其它自身免疫病中的强抗原呈递细胞(例如，树突细胞)。因此，这些树突 细胞特异性结合试剂具有巨大的治疗和诊断价值。

发明内容
本发明提供结合人DEC-205并且显示特定性质的分离的抗体，例如人抗体。本发 明也提供含有这种抗体的疫苗偶联物、双特异性分子和治疗组合物。因此，本发明的抗体和 组合物可以在多种树突细胞靶向的治疗中使用，例如，用以增强抗原呈递和/或诱导针对 多种靶细胞或病原体的T细胞应答，如细胞毒性T细胞(CTL)应答，或治疗抗原呈递细胞 (APC)介导的疾病。在一个实施方案中，本发明的抗体显示一种或多种以下性质(1)根据表面等离 子体共振测定，以至少IO8M-1的亲和常数结合人DEC-205 ； (2)在结合表达DEC-205的人树 突细胞后内化；(3)产生或增强对抗原(可能与抗体连接)的人T细胞应答，例如CD4+和 ⑶8+(CTL)T细胞应答，适当地由MHC I类和/或II类途径介导；和(4)诱导周围⑶8+T细 胞耐受性。此外，抗体可以与非人灵长类动物或其它物种的树突细胞上的DEC-205交叉反 应。再另外，抗体可以适当地显示一种或多种另外的性质，包括，例如(1)选择性结合位于人DEC-205胞外域上的表位，该胞外域例如是一个或组合的富含半胱氨酸的结构域、FnII 结构域，或10个C-型凝集素样结构域中的一个或多个；和(2)定位于细胞中的抗原加工区室。本发明的抗体的具体实例包含重链和轻链可变区，该可变区利用特定人种系，即 被种系基因编码，但是包括在抗体成熟过程中发生的基因重排和突变，例如体细胞突变。在 一个实施方案中，本发明的抗体的重链可变区利用人种系Vh 3-33基因并且包含SEQ ID N0:4、16、28、40、52、76和88的任一个中相比SEQ ID NO :95的至少一个氨基酸置换。或者， 重链可变区利用人种系Orph-C 16基因并且包含SEQ ID NO :64和70任一个中相比SEQ ID NO 96的至少一个氨基酸置换。在另一个实施方案中，抗体的轻链可变区选自一个区域，该区域(a)利用人种系 VK1-L15基因并且包含SEQ ID NO 10中相比SEQ IDNO 94的至少一个氨基酸置换；(b)利 用人种系VK1-L4基因并且包含SEQ ID NO :22或82的任一个中相比SEQ ID NO :93的至少 一个氨基酸置换；或(c)利用人种系VK3-L6基因并且包含SEQ ID NO :34、46、58的任一个 中相比SEQ ID NO 92的至少一个氨基酸置换。在另一个实施方案中，重链可变区CDR3序列选自SEQ ID NO :7、19、31、43、55、67、 73、79、91及其保守序列修饰(例如，保守氨基酸置换)。该抗体可以进一步包括选自SEQ ID而13、25、37、49、61、85及其保守序列修饰的轻链可变区0 3序列。在另一个实施方 案中，重链 CDR2 和 CDRl 序列分别选自 SEQ ID NO :6、18、30、42、54、66、72、78、90 和 SEQ ID NO :5、17、29、41、53、65、71、77、89，及其保守序列修饰。轻链CDR2和CDRl序列分别选自SEQ ID NO :12、24、36、48、60、84 和 SEQ ID NO :11、23、35、47、59、83，及其保守序列修饰。 在又另一个实施方案中，本发明提供结合DEC-205并且包括选自下组的重链和轻 链可变区⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的分离的抗体(i)包含SEQ ID NO 5的重链可变区CDRl ；包含SEQ ID NO 6的重链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 7的重链可变区CDR3 ；包含SEQ ID NO 11的轻链可变区CDRl ；包含SEQ ID NO 12的轻链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 13的轻链可变区CDR3 ；或其保守序列修饰；(ii)包含 SEQ ID NO 17 的重链可变区 CDRl ；包含SEQ ID NO 18的重链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 19的重链可变区CDR3 ；包含SEQ ID NO 23的轻链可变区CDRl ；包含SEQ ID NO 24的轻链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 25的轻链可变区CDR3 ；或其保守序列修饰；(iii)包含 SEQ ID NO 29 的重链可变区 CDRl ；包含SEQ ID NO 30的重链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 31的重链可变区CDR3 ；
包含SEQ ID NO 35的轻链可变区CDRl ；包含SEQ ID NO 36的轻链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 37的轻链可变区CDR3 ；或其保守序列修饰；(iv)包含 SEQ ID NO 41 的重链可变区 CDRl ；包含SEQ ID NO 42的重链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 43的重链可变区CDR3 ；包含SEQ ID NO 47的轻链可变区CDRl ；包含SEQ ID NO 48的轻链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 49的轻链可变区CDR3 ；或其保守序列修饰；(ν)包含SEQ ID NO 53的重链可变区CDRl ；包含SEQ ID NO 54的重链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 55的重链可变区CDR3 ；包含SEQ ID NO 59的轻链可变区CDRl ；包含SEQ ID NO 60的轻链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 61的轻链可变区CDR3 ；或其保守序列修饰；(vi)包含 SEQ ID NO 77 的重链可变区 CDRl ；包含SEQ ID NO 78的重链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 79的重链可变区CDR3 ；包含SEQ ID NO 83的轻链可变区CDRl ；包含SEQ ID NO 84的轻链可变区CDR2 ；包含SEQ ID NO 85的轻链可变区CDR3 ；或其保守序列修饰.例如，分离的抗体结合人DEC-205并且包含包含SEQ ID NO 29的重链可变区CDRl包含SEQ ID NO 30的重链可变区CDR2包含SEQ ID NO 31的重链可变区CDR3包含SEQ ID NO 35的轻链可变区CDRl ；包含SEQ ID NO 36的轻链可变区CDR2 ；禾口包含SEQ ID NO 37的轻链可变区CDR3。在另一个实施方案中，重链可变区⑶R3序列包含选自共有序列(A，G，Y，S，P，-) (P，W，S，R) (Y, A, H) F D(Y，L，V) (SEQ ID NO 99)的氨基酸序列，其中“_ “表示在该共有位 点不存在氨基酸残基的选项。该抗体可以进一步包括轻链可变区CDR3序列，该序列包含选 自共有序列 Q Q(R，Y，F) (R，N) (Τ, S，N) (Y，W, -) (P，-) (Y，L，H，-) (Τ, -) (SEQ ID NO 102) 的氨基酸序列，其中“_ “表示在该共有位点不存在氨基酸残基的选项。在另一个实施方案 中，重链可变区CDR2序列包含选自共有序列(V，I，F，T，A)I(W，G) (Y，Τ) (D，G) G (S，G，Y) (N， Τ) (K，P)Y(Y, A, V) (A, G，-)DSVKG(SEQ ID NO 98)的氨基酸序列，其中 “_ “表示在该共有位点不存在氨基酸残基的选项，并且轻链可变区CDR2序列包含选自共有序列(D，A)A S(N, S) (R，L) (A, Q，Ε) (Τ, S) (SEQ ID NO 101)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，重链可变 区CDRl序列包含选自共有序列(I, N, T，S)Y(G，N, A)M(H，Y) (SEQ ID NO 97)的氨基酸序 列；且轻链可变区CDRl序列包含选自共有序列RASQ(SjG) (I，V) SS (Y，W，A) LA (SEQ ID NO 100)的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，本发明提供结合DEC-205并且包括重链和轻链可变区 ⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的分离的抗体，其包含⑴包含选自共有序列(I，N，T，S)Y(G，N，A)M(H，Y) (SEQ IDNO 97)的氨基酸序列 的重链可变区⑶Rl ；(ii)包含选自共有序列(V, I，F，T，A) I (W, G) (Y，T) (D，G)G(S，G，Y) (N，Τ) (K，P) Y (Y，A, V) (A, G，-) DSVKG (SEQ ID NO 98)的氨基酸序列的重链可变区 CDR2 ；(iii)包含选自共有序列(A，G，Y，S，P，_) (P，W，S，R) (Y，A，H)FD(Y，L，V) (SEQ ID NO 99)的氨基酸序列的重链可变区⑶R3 ；(iv)包含选自共有序列 RASQ(S, G) (I, V) SS (Y, W, A) LA(SEQ ID NO 100)的氨基 酸序列的轻链可变区CDRl ；(ν)包含选自共有序列(DjA)AS (N, S) (R，L) (A，Q，Ε) (Τ，S) (SEQ ID NO 101)的氨 基酸序列的轻链可变区CDR2 ；和(vi)包含选自共有序列 Q Q(R，Y，F) (R，N) (Τ, S,N) (Y,W,-) (P,-) (Y，L，H，_) (T，_) (SEQ ID NO 102)的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中“-“表示在该共有位点不存在氨
基酸残基的选项。在另一个实施方案中，本发明的分离的抗体结合人DEC-205并且包括重链可变 区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO :4、16、28、40、52、64、70、76、88及其保守序列修饰的 氨基酸序列。该抗体可以进一步包括轻链可变区，该轻链可变区包括选自SEQ ID NO 10, 22、34、46、58、82及其保守序列修饰的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，本发明的分离的抗体结合人DEC-205并且包括含有选自 下组的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区(a)分别为SEQ ID NO 4和10，及其保守序列修饰；(b)分别为SEQ ID NO 16和22，及其保守序列修饰；(c)分别为SEQ ID NO 28和34，及其保守序列修饰；(d)分别为SEQ ID NO 40和46，及其保守序列修饰；(e)分别为SEQ ID NO 52和58，及其保守序列修饰；和(f)分别为SEQ ID NO 76和82，及其保守序列修饰·包括与上述任何序列具有至少80 %、或至少85 %、或至少90 %、或至少95 %、或至 少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%或更高序列同一性的重链和轻链可变区的 分离的抗体也包括在本发明中。以上引用的数值中间的范围，例如，与上述任何序列具有至 少80-85%、85-90%、90-95%或95-100%序列同一性的重链和轻链可变区，也旨在包括在 本发明中。在另一个实施方案中，分离的抗体结合人DEC-205并且包括重链可变区，该重链 可变区包含选自SEQ ID NO :4、16、28、40、52、64、70、76、88的氨基酸序列，或其中重链可变
12区构架区内的至少一个氨基酸残基被相应的种系残基置换的序列。该抗体可以进一步包括 轻链可变区，该轻链可变区包含选自SEQ ID N0:10、22、34、46、58、82的氨基酸序列，或其中 轻链可变区构架区内的至少一个氨基酸残基被相应的种系残基置换的序列。置换的氨基酸 残基可以包括直接非共价结合抗原的残基；与CDR相邻的残基；CDR-相互作用残基；参与 VL-VH 界面的残基；规范残基(canonical residue)、游标区残基(vernier zone residue) 或链 1、司堆禾只残基(interchain packingresidue)。本发明也包括与本发明的抗体竞争结合DEC-205的分离的抗体。本发明的抗体可以是全长的，例如，以下任何同种型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、 IgA l、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。或者，该抗体可以是片段，如抗原结合部分或单链抗体(例 如，Fab、F(ab' )2、Fv、单链Fv片段、分离的互补决定区(OTR)或两个或多个分离的⑶R的 组合)。本发明也提供一种分子偶联物，其包含连接到抗原(包括片段、表位和抗原决定 簇)如病原体、肿瘤抗原或自身抗原的成分上的本发明的抗体。例如，所述抗原可以包括 肿瘤抗原，如 β hCG、gplOO 或 Pmel 17、CEA、gplOO、TRP-2、NY-BR-1、NY-C0-58、MN(gp250)、 独特型、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2、MUC-I、MAGE-A3和高分子量-黑素瘤相关抗原(HMW-MAA) MARTl、melan-A, NY-ES0-1、MAGE-I、MAGE-3、WTl、Her2、间皮蛋白或高分子量-黑素瘤相关 抗原(HMW-MAA)。本文使用的术语“肿瘤抗原“优选地是指存在于(或结合于)肿瘤细胞上而一般 不存在于正常细胞上的任何抗原或抗原决定簇，或以比正常(非肿瘤)细胞上更大的量存 在于或结合于肿瘤细胞上的抗原或抗原决定簇，或以不同于在正常(非肿瘤)细胞上发现 的形式存在于肿瘤细胞上的抗原或抗原决定簇。该术语因此包括肿瘤特异性抗原，包括肿 瘤特异性膜抗原、肿瘤相关抗原，包括肿瘤相关膜抗原、肿瘤上的胚胎抗原、生长因子受体、 生长因子配体和与癌症有关的任何其它类型的抗原。肿瘤抗原可以是，例如，上皮癌抗原 (例如，乳癌、胃肠癌、肺癌)、前列腺特异性癌抗原(PSA)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)、膀 胱癌抗原、肺(例如，小细胞肺)癌抗原、结肠癌抗原、卵巢癌抗原、脑癌抗原、胃癌抗原、肾 细胞癌抗原、胰腺癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、头颈癌抗原或结肠直肠癌抗原。术语“片段”是指作为全长蛋白质或多肽的一部分的氨基酸序列，例如，大约8个 至大约1500个氨基酸长度，适当地为大约8个至大约745个氨基酸长度，适当地为大约8 个至大约300个，例如大约8个至大约200个氨基酸，或大约10个至大约50或100个氨基 酸长度。在另一个实施方案中，分子复合物进一步包括治疗剂，如细胞毒性剂、免疫抑制剂 或化疗剂。本发明还提供一种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的本发明的抗体， 该第二功能部分具有与所述抗体不同的结合特异性。还提供了包含此处所述的抗体、分子偶联物或双特异性分子和药学上可接受的载 体的组合物。该组合物进一步包含治疗剂(例如，免疫抑制剂或与本发明的抗体不同的抗 体)。本发明也包括编码本发明的抗体的核酸分子以及包含这些核酸的表达载体和包 含这些表达载体的宿主细胞。而且，本发明提供包含人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达本发明的抗体，以及由这种小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产 生本发明的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供将抗原靶向至受试者中的细胞(例如能够呈递 抗原的细胞(如外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞(如THP-1)、B类淋巴母细胞(如ClR. A2、1518 B-LCL)和单核细胞衍生的DC)的方法，包括施用与抗原连接的结合细胞上的受体 的分子(例如，以前所述的DEC-205抗体)。在一个实施方案中，被靶向的细胞(可为B细 胞)刺激MHC I类限制的T细胞。本发明的抗体和其它组合物也可以用来在受试者中诱导或增强针对抗原的免疫 应答(例如，T细胞介导的免疫应答)。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种诱 导或增强针对抗原的CTL应答的方法，包括使抗原与结合抗原呈递细胞上的受体例如人 DEC-205的抗体形成偶联物。然后使该偶联物在体内或离体接触表达人DEC-205的细胞， 使得所述抗原以诱导或增强针对抗原的CTL应答(例如，由CD8+细胞毒性T细胞介导的应 答)的方式被内化、加工和呈递给T细胞。在另一个实施方案中，这也用来诱导针对抗原的 辅助T细胞应答(例如，由⑶4+辅助T细胞介导的应答)。因此，免疫应答可以通过MHC I 类和MHC II类途径诱导。表达DEC-205的细胞也可以接触佐剂、刺激树突细胞增殖的细胞 因子和/或免疫刺激剂，以进一步增强免疫应答。在另一个实施方案中，提供了检测样品中是否存在DEC-205或表达DEC-205的细 胞的方法，包括(a)在允许在抗体和DEC-205之间形成复合物的条件下使样品接触本发明 的抗体；和(b)检测样品中抗体和DEC-205之间复合物的形成。本发明的范围内也包括试剂盒，该试剂盒包括本发明的组合物(例如，抗体、分子 偶联物、多特异性和双特异性分子)和任选的使用说明。该试剂盒可以进一步包括至少一 种额外的试剂，如细胞因子或补体，或一种或多种额外的本发明的人抗体(例如，与第一人 抗体结合树突细胞上不同表位的具有补体活性的人抗体)。本发明的其他特征和优点通过下面的详述和权利要求书将是明显的。


图1A-1I包括通过使用LSR 仪器(BD Biosciences, NJ, USA)的荧光分析，显示人 抗-DEC-205 抗体(3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、 1G6-1G6和3A4-1C10)与表达人DEC-205的CHO-S细胞结合的图。图2A-2I包括通过流式细胞分析，显示人抗-DEC-205抗体(3D6_2F4、3D6_4C8、 3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10)与人树突细胞 上的DEC-205的结合的图。图 3 是显示使用 ELISA 检测的人抗-DEC-205 抗体(3D6-2F4、3D6-4C8、3G9_2D2、 5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10)与 DEC-205 的结合的图。图4A-4C显示使用共聚焦显微镜检查，与对照(FITC-人IgGl)相比，FITC-标记 的HuMab (FITC-3G9-2D2)向树突细胞的内化。图 5 是人 VH 和 VK 种系序列与抗-DEC-205 抗体(3D6-2F4、3D6-4C8、3G9_2D2、 5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5C3-2_3F6、1E6-3D10)的 VH 禾口 VK 序列的比对。该图以出 现的顺序分别披露了 SEQ ID NO 92、34、46、58、93、82、22、94、10、95、4、16、103-105、76、88、96、106 和 70。图 6 显示人抗 DEC-205 抗体(3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、3C7_3A3、 2D3-1F5-2A9、1E6-3D10、5C3-2_3F6、5D12-5G1)的 VH CDR1、CDR2 和 CDR3 序列的比对。图 7 显示人抗-DEC-205 抗体(3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、3C7_3A3、 5C3-2-3F6)的人抗 DEC-205HuMab VK CDR1、CDR2 和 CDR3 序列的比对。图8显示抗DEC-205/抗原融合APC靶向疫苗构建体的实例的示意图。图9A和B包括显示在外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞(THP-I)、B类淋巴母 细胞(C1R. A2，1518 B-LCL)和单核细胞衍生的DC中使用3G9_i3 hCG APC-靶向疫苗偶联物 的抗原特异性活性的图。发明详述本发明提供结合人DEC-205的抗体(例如，人抗体)。在特定实施方案中，该抗体 表现出多种功能特性，例如，通过表面等离子体共振测定，以至少为IO8M-1的亲和常数结合 人DEC-205 ；在结合表达DEC-205的人树突细胞后内化；产生或增强针对可与该抗体连接的 抗原的人T细胞应答，例如⑶4+或⑶8+(CTL)或NKT细胞应答，例如，通过MHC I类和II 类途径介导的CTL应答；定位于树突细胞中的抗原加工区室；诱导周围CD8+T细胞耐受性； 或与非人灵长类动物或其它物种的树突细胞上的DEC-205交叉反应。在其它实施方案中， 该抗体包括利用了特定人种系基因并且包括特定结构特征如特定⑶R序列的重链和轻链 可变区。本发明进一步提供制备这种抗体、包括这种抗体的分子偶联物和双特异性分子的 方法，以及含有这种抗体的组合物。本发明也提供了在体外或体内将抗原靶向抗原呈递细 胞(例如，外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞(如THP-1)、B类淋巴母细胞(如ClR. A2、 1518 B-LCL)和单核细胞衍生的DC)的方法，例如，通过使用本发明的抗DEC-205抗体。本 发明的方法也包括在受试者中诱导或增强针对抗原的免疫应答(例如，T细胞介导的免疫 应答)的方法。这些方法包括抗原通过抗原呈递细胞上的受体(例如，DEC-205)的呈递， 作为MHC-I和/或MHC-II偶联物的成分(例如，T细胞应答由⑶4+和⑶8+T细胞两者介 导，或由细胞毒性T细胞或辅助T细胞介导)。在一个实施方案中，被靶向的细胞(可以是 B细胞)刺激MHC I类限制性的T细胞。为了可以更容易地理解本发明，首先定义了一些术语。另外的定义在整个详述中 说明。术语“人树突和上皮细胞205受体”(DEC-205)包括由细胞天然表达的DEC-205的 任何变体或同工型(例如，以登录号AAC17636登记于GENBANK 的人DEC-205，和以 登录号AAL81722登记于GENBANK 的小鼠DEC-205)。因此，本发明的人抗体可以与 来自人以外的物种的DEC-205交叉反应。或者，该抗体可以是人DEC-205特异性的，并且可 能不表现出任何与其它物种的交叉反应性。DEC-205或其任何变体或同工型可以从天然表 达它们的细胞或组织(例如人、小鼠和猕猴细胞)中分离，也可以利用本领域公知的技术和 /或本文描述的技术重组产生。Genbank (登录号aac17636a)报告了如下的人dec-205的氨基酸序列(seq id no 1)1 mrtgwatprr pagllmllfw ffdlaepsgr aandpftivh gntgkcikpv ygwivaddcd61 etedklwkwv sqhrlfhlhs qkclglditk svnelrmfsc dssamlwwkc ehhslygaar0109]121 yrlalkdghg taisnasdvw kkggseeslc dqpyheiytr dgnsygrpce fpflidgtwh
0110]181 hdcildedhs gpwcattlny eydrkwgicl kpengcednw ekneqfgscy qfntqtalsw
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0112]301 nwdpdrpsap tiggsscarm daesglwqsf sceaqlpyvc rkplnntvel tdvwtysdtr
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0118]661 haerivrkrn weeaerfcqa lgahlssfsh vdeikefIhf ltdqfsgqhw lwiglnkrsp
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0125]1081 serhfvslcq kysevksrqt lqnasetvky lnnlykiipk tltwhsakre clksnmqlvs
0126]1141 itdpyqqaf1 svqallhnss lwiglfsqdd elnfgwsdgk rlhfsrwaet ngqledcvvl
0127]1201 dtdgfwktvd cndnqpgaic yysgneteke vkpvdsvkcp spvlntpwip fqnccynfii
0128]1261 tknrhmattq devhtkcqkl npkshilsir dekennfvle qllyfnymas wvmlgityrn
0129]1321 nslmwfdktp lsythwragr ptiknekfla glstdgfwdi qtfkvieeav yfhqhsilac
0130]1381 kiemvdykee hnttlpqfmp yedgiysviq kkvtwyealn mcsqsgghla svhnqngqlf
0131]1441 ledivkrdgf plwvglsshd gsessfewsd gstfdyipwk gqtspgncvl ldpkgtwkhe
0132]1501 kcnsvkdgai cykptkskkl srltyssrcp aakengsrwi qykghcyksd qalhsfseak
0133]1561 klcskhdhsa tivsikdede nkfvsrlmre nnnitmrvwl glsqhsvdqs wswldgsevt
0134]1621 fvkwenksks gvgrcsmlia snetwkkvec ehgfgrvvck vplgpdytai aiivatlsil
0135]1681 vlmggliwf1 fqrhrlhlag fssvryaqgv nedeimlpsf hd
0136]人DEC-205的主要结构域可以表示如下
0137]N-CR-FNII-CTLD1-CTLD2-CTLD3-CTLD4-CTLD5-CTLD6-CTLD7-CTLD8-CTLD9-CTLD1 丨-TMC
0138]其中N是N-末端，CR表示“富含Cys的”结构域，FNII表示〃 II型纤连蛋白〃结 构域，CTLDl至CTLDlO表示10个“C-型凝集素样”结构域，TMC表示跨膜和细胞质结构域。
0139]本文使用的术语“树突细胞”包括未成熟和成熟的树突细胞和能够分化为树突细 胞的相关的骨髓袓细胞，或相关抗原呈递细胞(例如，单核细胞和巨噬细胞)，因为它们与 树突细胞表达相同的抗原。本文使用的术语“相关的”包括来源于共同袓细胞或细胞谱系 的细胞。在一个实施方案中，本发明的抗体与树突细胞的结合，通过将具有确定的功能的分 子或细胞(例如，肿瘤细胞、效应细胞、微生物病原体)靶向至树突细胞，介导了对树突细胞 生长和/或功能的效应。在另一实施方案中，本发明的抗体与树突细胞的结合导致抗体向 树突细胞的内化。
16
"MHC分子”包括两类分子MHC I类和MHC II类。MHC I类分子将抗原呈递给特 定的⑶8+T细胞，MHC II类分子将抗原呈递给特定的⑶4+T细胞。外源地递送给APC的抗 原主要为了与MHC II类结合而加工。相反，内源地递送给APC的抗原主要为了与MHC I类 结合而加工。但是，在特定条件下，DC具有使外源抗原进入内部区室用于除结合MHC II类 分子以外还结合MHC I类分子的独特能力。该过程被称为“交叉引发”或“交叉呈递”。
本文使用的术语“免疫刺激剂”是指能够刺激APC如DC和巨噬细胞的化合物。例 如，用于本发明的合适的免疫刺激剂能够刺激APC，使得APC的成熟过程得到加速，APC的 增殖得到加强，和/或共刺激分子(例如，⑶80、⑶86、ICAM-U MHC分子和CCR7)和促炎 细胞因子(例如，IL-I β、IL-6、IL-12、IL-15和IFN-γ )的补充或释放得到上调。合适 的免疫刺激剂也能够增强T细胞增殖。这些免疫刺激剂包括但不限于CD40配体；细胞因 子，如IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-2 ；集落刺激因子，如G-CSF (粒细胞集落刺激因子) 和GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)；抗CTLA-4抗体；LPS(内毒素)；ssRNA ； dsRNA;卡介苗(BCG)；盐酸左旋咪唑；和静脉内免疫球蛋白。在一个实施方案中，免疫刺 激剂可以是Toll-样受体(TLR)激动剂。例如，免疫刺激剂可以是TLR3激动剂，如双链 肌苷胞嘧啶多核苷酸(Poly I :C，例如可以作为AmpligenTM获自HemispherxBipharma, PA, US)，或Poly A =U ；TLR4激动剂，如单磷酰脂质A (MPL)或RC-529 (例如，获自GSK, UK)； TLR5激动剂，如鞭毛蛋白；TLR7或TLR8激动剂，如咪唑喹啉TLR7或TLR 8激动剂，例如咪 喹莫特(例如AldaraTM)或雷西莫特(resiquimod)和相关的咪唑喹啉剂(例如，获自3M Corporation)；或TLR 9激动剂，如具有非甲基化CpG基序的脱氧核苷酸(所谓的“CpGs”， 例如获自ColeyPharmaceutical)。这些免疫刺激剂可以与本发明的抗体和构建体同时、分 开或顺序施用，也可以物理连接到该抗体和构建体上。本文使用的术语“连接的”是指两个或多个分子的结合。该连接可以是共价的或 非共价的。该连接也可以是遗传的(即重组融合)。这样的连接可以使用多种本领域公认 的技术来实现，如化学偶联和重组蛋白质产生。本文使用的术语抗原“交叉呈递”是指外源蛋白质抗原通过APC上的MHC I类和 II类分子向T细胞的呈递。本文使用的术语“T细胞介导的应答”是指由包括效应T细胞(例如，⑶8+细胞) 和辅助T细胞(例如，CD4+细胞)在内的T细胞介导的任何应答。T细胞介导的应答包括， 例如，T细胞细胞毒性和增殖。本文使用的术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导 的免疫应答。CTL应答主要由⑶8+T细胞介导。这里提到的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部 分”)或单链。在一个优选实施方案中，“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少 两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在 此缩写为Vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻 链由轻链可变区(在此缩写为VJ和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域Q组成。 Vh和&区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为构架区(FR) 的更加保守的区域中。每个Vh和\均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端 以如下顺序排列=FRl，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合， 该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分 (Clq)。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留特异性 地结合抗原(如人DEC-205)的能力的抗体的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合 功能可通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”所包括的结合片段的例子 包括(i)Fab片段，这是由Vl、Vh、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，这 是包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由Vh和CHl结构域组成 的Fd片段；(iv)由抗体单臂的\和Vh结构域组成的Fv片段；(ν)由Vh结构域组成的dAb 片段(Ward 等，(1989)Nature 341 :544_546)；禾口 (vi)分离的互补决定区(CDR)；或(vii) 任选地可通过合成接头连接的两个或多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结 构域\和Vh由不同基因编码，但可使用重组方法通过合成接头将它们连接在一起，该接头 使它们能够形成其中区配对形成单价分子的单条蛋白链(称为单链Fv(SCFV)；参 见如 Bird 等(1988) Science 242 :423_426 ；和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也有意包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体 片段可采用本领域技术人员公知的常规技术获得，且可采用与完整抗体一样的方式筛选这 些片段的效用。抗原结合部分可以通过重组DNA技术产生，或者通过对完整免疫球蛋白进 行酶或化学切割而产生。“双特异性”或“双功能性抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结 合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤融合或Fab'片 段的连接。参见，例如，Songsivilai& Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79 315-321 (1990)； Kostelny 等，J. Immunol. 148，1547-1553 (1992)。本文所用的术语“单克隆抗体”是指表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和 性的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性并且具有来源于人种系 免疫球蛋白序列的可变区和任选的恒定区的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由包 括从转基因非人动物如转基因小鼠获得的B细胞与无限增殖化细胞融合的杂交瘤产生，所 述转基因动物具有包括人重链转基因和轻链转基因的基因组。如此处所用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所 有人抗体，例如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制 备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从经转化表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体，(C) 从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪切为 其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体包含可变 区和恒定区，所述可变区和恒定区利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列， 但是包括随后例如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。如本领域公知的(参见，例如， Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9) 1117-1125)，可变区含有抗原结合域，该抗原结合 域由重排的各种基因编码，以形成对外源抗原具有特异性的抗体。除了重排以外，可变区可 以进一步通过多个单氨基酸改变而修饰(被称为体细胞突变或超突变)，以提高抗体对外 源抗原的亲和力。恒定区在对抗原的进一步应答方面发生改变(即，同种型转换)。因此， 编码响应于抗原的轻链和重链免疫球蛋白多肽的重排和体细胞突变的核酸分子可能不具有与原核酸分子的序列同一性，而是基本相同或相似(即，具有至少80%的同一性)。术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存 在的话)的抗体。本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸 残基(例如经体外随机诱变或位点特异性诱变或体内体细胞突变所引入的突变)(参 见，Lonberg, N.等(1994) Nature368 (6474) :856_859) ；Lonberg, N. (1994) Handbook of ExperimentalPharmacology 113 :49_101 ；Lonberg, N.禾口 Huszar, D. (1995)Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65_93，禾Π Harding, F.禾Π Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546)。但是，术语“人抗体”不包括其中来源于另一哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR 序列已被移植到人构架序列上的抗体(即，人源化抗体)。本文所用的“异源抗体”的定义关系到产生这种抗体的转基因非人生物体。该术 语是指这样的抗体，其具有的氨基酸序列或编码核酸序列与在转基因非人动物以外的生物 体中存在的序列相对应，而且通常所述序列来自转基因非人动物物种以外的物种。本文使用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体 (例如，特异性结合人DEC-205的分离的抗体基本不含与除DEC-205以外的抗原特异性结合 的抗体)。但是，特异性结合一个表位的分离的抗体与来自不同物种的其它DEC-205蛋白可 能具有交叉反应性。但是，该抗体优选地总是结合人DEC-205。而且，分离的抗体通常基本 不含其他细胞材料和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，具有不同DEC-205特异 性的“分离的”抗体组合在良好确定的组合物中组合。术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。 表位可以由相邻的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而靠近的不相邻的氨基酸形成。由相邻 的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变 性溶剂处理后丧失。表位通常在独特的空间构象中包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14或15个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术， 例如，χ-射线晶体分析法和二维核磁共振(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996))。在此情况下，表位优选 地位于人DEC-205的胞外域中，例如，在一个或组合的富含半胱氨酸的结构域、FnII结构域 或人DEC-205的10个C-型凝集素样结构域中的一个或多个中。本文所用的术语“特异性结合”或“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位 的结合。典型地，当使用重组人DEC-205作为分析物并使用抗体作为配体，在BIAC0RE 2000 仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10_7M，如大约低于10_8M、 10_9M或ΙΟ,Μ或甚至更低的平衡解离常数(Kd)结合预定的抗原，并且其与预定抗原结合的 亲和力比其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)结合的亲 和力至少高两倍。术语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在本文中可以与术语“特 异性结合抗原的抗体”互换使用。本发明也包括结合相同表位的抗体和/或与此处所述的抗体竞争结合人DEC-205 的抗体。识别相同表位或竞争结合的抗体可以使用常规技术来确认。这些技术包括，例 如，免疫测定，其显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原结合的能力，即竞争结合分析。在 一种分析中检测竞争结合，该分析中免疫球蛋白在检测条件下抑制参考抗体与共同抗原 如DEC-205的特异性结合。许多类型的竞争结合分析是已知的，例如固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli等， Methods in Enzymology 9 :242 (1983))；固相直接生物素-亲和素 EIA(参见 Kirkland 等，J. Immunol. 137 =3614(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见 Harlow 禾口 Lane, Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPress(1988))； 使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等，Mol. Immunol. 25(1) 7(1988))； 固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等，Virology 176:546(1990))；和直接标记的 RIA (Moldenhauer 等，Scand. J. Immunol. 32 :77(1990))。典型地，这种分析包括使用与固体 表面结合的纯化抗原或带有其中任一种的细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免 疫球蛋白。竞争性抑制通过在测试免疫球蛋白的存在下测定与固体表面和细胞结合的标记 的量来测定。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，它将抑制参 考抗体与共同抗原的特异性结合至少达50-55 %、55-60 %、60-65 %、65-70 %、70-75 %或更 尚ο其它技术包括，例如，表位作图法，如抗原抗体复合物晶体的χ-射线分析，其提 供对表位的原子解析。其它方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变异的结合，其中由于 抗原序列内氨基酸残基的修饰导致的结合的丧失通常被认为是表位成分的指示。另外，也 可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于目标抗体从组合噬菌体展示肽库 中亲和力分离特异性短肽的能力。然后这些肽被视为用于定义对应于用来筛查肽库的抗体 的表位的线索(leads)。对于表位作图，已经开发了证明可对构象不连续表位进行作图的计 算算法。本文使用的术语“K/是指特定抗体_抗原相互作用的解离平衡常数。典型地，当 使用重组人DEC-205作为分析物、使用抗体作为配体，在BIAC0RE 2000仪器中通过表面等 离子体共振(SPR)技术测定时，本发明的人抗体以大约10_8M或更低，如低于10_9M或ΙΟ,Μ 或甚至更低的解离平衡常数(Kd)结合DEC-205。本文使用的术语“kd”是指抗体从抗体/抗原复合物上解离的解离速率常数。本文使用的术语“ka”是指抗体与抗原缔合的结合速率常数。本文使用的术语“EC50”是指抗体或其抗原结合部分的浓度，该浓度在体外或体内 分析中诱导为最大应答50%的应答，S卩，最大应答与基线之间的中途。本文使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或 IgGl)。在一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体是IgG 1同种型的抗体。在另一个实施 方案中，本发明的人单克隆抗体是IgG2同种型的抗体。术语“结合固定的DEC-205”是指本发明的人抗体结合例如在细胞表面上表达或连 接于固体支持物上的DEC-205的能力。本文使用的术语“交叉反应，，是指本发明的抗体结合来自不同物种的DEC-205的 能力。例如，结合人DEC-205的本发明的抗体也可以结合猕猴DEC-205。本文使用的交叉 反应性的确定是通过在结合分析(例如，SPR，ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性， 或与生理表达DEC-205的细胞的结合或其它方式的功能性相互作用。确定交叉反应性的 方法包括如本文所述的标准结合分析，例如，使用BiaCOreTM2000 SI3R仪器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)的Biacore 表面等离子体共振(SPR)分析，或通过例如流式细胞分析技 术检测与来自相关物种的表达DEC-205的细胞(例如，树突细胞)的结合。
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本文所用的“同种型转换”是指抗体的类别或同种型从一种Ig类别变成另一种其 它的Ig类别的现象。本文所用的“非转换同种型”是指没有发生同种型转换时产生的重链的同种型类 别；编码非转换同种型的CH基因通常是紧接在功能性重排的VDJ基因下游的第一个CH基 因。同种型转换分为典型或非典型同种型转换。典型同种型转换通过重组事件进行，所述 重组事件涉及转基因中的至少一个转换序列区。非典型同种型转换可通过例如人σ μ和人 Σ μ (δ-相关性缺失)之间的同源重组进行。另外的非典型转换机制，尤其如转基因间和 /或染色体间重组，可以发生并实现同种型转换。本文所用的术语“转换序列，，是指负责转换重组的那些DNA序列。“转换供体”序 列，通常为μ转换区，位于转换重组过程中待缺失的构建体区的5'方向(即上游)。“转 换接纳体”区在待缺失的构建体区和置换恒定区(如Y、ε等)之间。由于没有其中经常 发生重组的特异性位点，最终基因序列通常不能从构建体预测到。本文所用的“糖基化模式”定义为共价连接到蛋白质、更具体而言连接到免疫球蛋 白的碳水化合物单位的模式。异源抗体的糖基化模式实际上可被表征为在非人转基因动物 物种产生的抗体上天然存在的糖基化模式类似，同时本领域一般技术人员知道，异源抗体 的糖基化模式与衍生转基因的CH基因的物种的糖基化模式相比，更类似于非人转基因动 物物种中的所述糖基化模式。本文所用的应用于某个对象的术语“天然存在的”是指这样的事实，即该对象可在 自然界中发现。例如，存在于可从自然界来源分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工 在实验室中有意修饰的多肤序列或多核苷酸序列即是天然存在的。本文所用的术语“重排的”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V区段 以基本上分别编码完整Vh或\结构域的构象直接位于D-J或J区段邻近。重排的免疫球 蛋白基因座可通过与种系DNA比较来鉴别；重排的基因座具有至少一种重组的七聚体/九 聚体同源性成分。本文所用的涉及V区段的术语“非重排的”或“种系构型”是指这样的构型，其中V 区段没有重组而直接部近D或J区段。本文所用的术语“核酸分子”意指包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单 链的也可以是双链的，但优选双链DNA。本文所用的涉及编码能结合DEC-205的抗体或抗体部分(如VH、\、CDR3)的核酸 的术语“分离的核酸分子”意指这样的核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不 含其它核苷酸序列，所述其它核苷酸序列编码能结合除DEC-205外的抗原的抗体或抗体部 分，且其它序列可天然位于人基因组DNA中核酸的旁侧。例如，SEQ ID N0:2，3(具有信号 肽)/4 (不含信号肽)和SEQ ID NO :8，9 (具有信号肽)/10 (不含信号肽)分别对应于包 含本发明的人抗DEC-205抗体3D6-2F4的重链(Vh)和轻链可变区的核苷酸和氨基酸 序列。具体地，SEQID NO 2和3/4分别对应于3D6-2F4抗体的Vh的核苷酸和氨基酸序列， SEQ ID NO 8和9/10分别对应于3D6-2F4抗体的\的核苷酸和氨基酸序列。本发明也包括SEQ ID NO :2_91所示序列的“保守序列修饰”，即不消除由该核苷 酸序列编码的或含有该氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。这样 的保守修饰包括保守的核苷酸和氨基酸置换，以及核苷酸和氨基酸添加和缺失。例如，可以通过本领域公知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，向SEQ ID N0:2-91中引入 修饰。保守氨基酸置换包括将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的置换。具 有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨 基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、 具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪 氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮 氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，预测的 人抗-DEC-205抗体中的非必需氨基酸残基优选地被替换为来自相同例链家族的另一氨基 酸残基。确定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守置换的方法在本领域中是公知的(参 见，例如，Brummell 等，Biochem. 32 :1180_1187 (1993) ；Kobayashi 等 ProteinEng. 12(10) 879-884 (1999)；和 Burks 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :412_417 (1997))。此外，在另一个实施方案中，可以沿抗DEC-205抗体编码序列的全部或部分随机 引入突变，例如通过饱和诱变引入，得到的修饰的抗DEC-205抗体可以筛选结合活性。对于核酸，术语“基本同源性”表示两种核酸或其指定序列当以最佳方式进行对比 和比较时，虽有适当的核苷酸插入或缺失，但至少有约80%的核苷酸是相同的，通常至少约 90 %至95 %，更优选至少约98 %至99. 5 %的核苷酸是相同的。另外，当区段在选择性杂交 条件下与该链的互补体杂交时，也存在基本同源性。两个序列之间的百分同一性是它们共有的相同位置的数目的函数(即％同源性 =相同位置的数目/总位置数目χ 100)，其中考虑了为达到两个序列的最佳对比而需要引 入的缺口的数目及各缺口的长度。两条序列之间的序列比较和百分同一性的确定可用数学 算法实现，这在以下非限制性实施例中有描述。两个核苷酸序列之间的百分同一性可以用GCG软件包(可从http://WWW. gcg. com 获得)中的GAP程序、使用NWSgapdna. CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、 4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分同一性也可以用已经整 合入 ALIGN 程序(2. O 版本)*&E.Meyers*W.Miller(CABI0S，4:ll-17(1988))的算法 来确定，其使用PAM 120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸 序列之间的百分同一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从http://WWW. gcg. com获得) 的 GAP 程序中的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48 444-453 (1970))的算法来确定，其 使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或 6的长度权重。本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来对公共数据库进行检 索，例如用来鉴定相关序列。这种检索可以用Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_10 的NBLAST和XBLAST程序(2. O版本)进行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行， 得分=100，字长=12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索 可以用XBLAST程序进行，得分=50，字长=3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸 序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res. 25(17) =3389-3402所述的空位BLAST。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用 各自程序(例如 XBLAST 和 NBLAST)的缺省参数。参见 http://www. ncbi. nlm. nih. gov。
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该核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存 在。当通过包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳在内的标准技术和本 领域公知的其他方法与其他细胞成分或其他掺杂物(例如其他细胞核酸或蛋白质)分离 纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见，F. Ausubel等编，Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, NewYork(1987)。本发明的核酸组合物，虽然经常为cDNA、基因组或其混合物的天然序列(修饰的 限制位点等除外)，但可按照标准技术进行突变，以提供基因序列。对于编码序列，这些突变 可按需影响氨基酸序列。尤其是，设想了基本上同源于或来源于本文所述的天然V、D、J、恒 定区、转换区和其它类似序列的DNA序列(其中“来源于”表示某序列与另一序列相同或从 后者修饰得到)。当使一核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，所述核酸即是“有效连接”的。例 如，启动子或增强子如果能影响序列的转录，即是与编码序列“有效连接的”。对于转录调 节序列，有效连接指被连接的DNA序列是相邻的，且当需要连接两个蛋白质编码区时，所述 DNA序列是相邻的并位于读框中。对于转换序列，有效连接表示序列能够实现转换重组。本文所用的术语“载体”意指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。载体 的一种类型是“质粒”，它指环状双链DNA环，其它DNA区段可连接到其中。另一种载体类型 是病毒载体，其中其它DNA区段可连接到病毒基团组内。某些载体能够在其引入的宿主细 胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载 体(如非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中，从而与 宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。这样的载体在 本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用 的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是 最常用的载体形式。但是，本发明有意包括能提供等同功能的其它类型的表达载体，如病毒 载体(如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞“)意指其中引入了重组 表达载体的细胞。应该理解，这样的术语不但意指特定细胞，也指这样的细胞的后代。因为 由于突变或环境影响在以后各代中可能发生某些修饰作用，这样的后代可能实际上与亲代 细胞不相同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面上展示与MHC复合的外来抗原的细胞。 T细胞利用T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC的例子包括但不限于树突细胞(DC)、外 周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞(如THP-1)、B类淋巴母细胞(如ClR. A2，1518 B-LCL) 和单核细胞衍生的树突细胞(DC)。某些APC通过吞噬作用或者受体介导的胞吞作用内化抗 原。APC受体的例子包括但不限于C型凝集素，如人树突和上皮细胞205受体(DEC-205)， 和人巨噬细胞甘露糖受体。术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原和使它们能够被T细胞识别的过程，例如，作 为MHC-I和/或MHC-II偶联物的成分。术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可以互换使用，是指刺激对特定抗原的 免疫应答(即，被动或适应性的)。本文使用的术语“治疗”是指此处所述的治疗性的或预防性的措施。“治疗”方法是对需要这种治疗的受试者，例如，需要增强针对特定抗原的免疫应答的受试者，或最终可 能患上这种疾病的受试者，施用本发明的人抗体，以预防、治愈、延迟疾病或复发疾病、减轻 其严重程度，或缓解其一个或多个症状，或使受试者的生存期延长超过不使用这处治疗时 预期的生存期。术语“有效剂量”被定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。术语“治疗有 效量”被定义为足以治愈或至少部分停滞已患有疾病的患者的疾病及其并发症的量。对于 此用途有效的量取决于所治疗的疾病的严重程度和患者自身免疫系统的总体状况。术语“患者”包括接受预防或治疗性处置的人和其它哺乳动物受试者。本文使用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物 可以用来治疗患有免疫疾病的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动 物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖类、爬行类动物等。本发明的各个方面在下面的部分中进一步详细说明。I.抗DEC-205抗体的产牛本发明包括结合DEC-205例如人DEC-205的抗体，例如，完全人抗体。示例性 的结合 DEC-205 的单克隆抗体包括 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、 3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6、5C3-2_3F6、1E6-3D10 和 3A4-1C10。本发明的单克隆抗体可以使用多种已知的技术产生，例如Kohler和Milstein， Nature 256 =495(1975)所述的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交方法是优选的，但是 原则上也可以使用其它生产单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌性转化、使 用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。因此，在一个实施方案中，使用杂交瘤方法产生结合人DEC-205的抗体。在该方 法中，小鼠或其它合适的宿主动物可以用合适的抗原免疫，以诱导出产生或能够产生特异 性结合免疫所用抗原的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外免疫。然后可以使用 合适的融合剂，如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding， Monoclonal Antibodies :Principles and Practice,pp. 59-103(Academic Press,1986))。 检测培养杂交瘤细胞的培养基中针对该抗原的单克隆抗体的产生。确认了产生具有所需 特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释程序对克隆进行 亚克隆，并且使用标准方法进行培养(Goding, Monoclonal Antibodies =Principlesand Practice, pp. 59-103 (Academic Press，1986))。用于该目的的合适的培养基包括，例如， D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤在动物体内生长。可以通 过常规免疫球蛋白纯化方法，例如，蛋白A-S印harose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或 亲和层析，从培养基、腹水或血清中分离由该亚克隆分泌的单克隆抗体。在另一个实施方案中，结合人DEC-205的抗体和抗体部分可以从利用如下所述的 技术产生的抗体噬菌体文库中分离例如，McCafferty等，Nature, 348 :552_554 (1990). Clackson 等，Nature, 352 :624_628 (1991)，Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991)和 Hoet 等(2005) Nature Biotechnology 23，344-348 ；Ladner 等的美国专利 No. 5，223，409 ； 5，403，484 ；和 5，571，698 ；Dower 等的美国专利 No. 5，427，908 和 5，580，717 ；McCafferty 等的美国专利 No. 5，969，108 和 6，172，197 ；和 Griffiths 等的美国专利 No. 5，885，793 ； 6，521，404 ；6，544，731 ；6，555，313 ；6，582，915 和 6，593，081。另外，也可以采用通过链改组产生高亲和力(nM 范围)的人抗体(Marks 等，Bio/Technology, 10 779-783 (1992)), 以及感染和体内重组的组合作为构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc. Acids. Res. ,21 :2265-2266(1993))。在特别的实施方案中，利用Hoet等(同上)所述的噬菌体展示技术产生结合人 DEC-205的抗体。该技术包括产生具有从人供体分离的免疫球蛋白序列的独特组合并且在 重链⑶R中具有合成多样性的人Fab文库。然后针对结合人DEC-205的Fab筛查该文库。优选的用于制备产生本发明抗体的杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂 交瘤是本领域中公知的，包括免疫方案和分离和融合被免疫的脾细胞的技术。在一个实施方案中，使用携带人免疫系统而不是小鼠系统的部分的转基因或转染 色体小鼠来产生抗DEC-205抗体。在一个实施方案中，本发明使用在本文中称为“HuMAb 小鼠”的转基因小鼠，该小鼠包含编码未重排的人重链(μ和Y)和κ轻链免疫球蛋白序 列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使内源μ和κ链基因座失活的定向突变(Lonberg， N.等(1994)Nature 368(6474) :856_859)。因此，该小鼠表现为小鼠IgM或κ表达降 低，并且响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，从而产生 高亲禾口力人 IgGK 单克隆抗体(Lonberg, N.等(1994)， supra ；reviewed in Lonberg, N. (1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113 49~101 ；Lonberg, N.禾口 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65_93，禾口 Harding，F.禾口 Lonberg，N. (1995) Ann. N.Y.Acad. Sci 764:536-546)。HuMAb小鼠的制备在下面的第II部分和以下文献中详细 描述Taylor，L.等(1992) NucleicAcids Research 20 6287-6295 ；Chen, J.等(1993) InternationalImmunology 5 :647_656 ；Tuaillon 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci USA90 3720-3724 ；Choi 等(1993)Nature Genetics 4 117-123 ；Chen, J.等(1993)EMBO J. 12 821-830 ；Tuaillon 等(1994)J. Immunol. 152 :2912_2920 ;Lonberg 等，(1994)Nature 368(6474) 856-859 ；Lonberg, N. (1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113 49-101 ；Taylor, L.等(1994)International Immunology 6 579-591 ；Lonberg, N.禾口 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65_93 ；Harding, F.禾口 Lonberg, N. (1995)Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546 ；Fishwild, D.等(1996)NatureBiotechnology 14 :845-851。进一步参见，Lonberg 和 Kay，和 GenPharm International 的美国专利 No. 5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，789，650 ；5，877，397 ；5，661，016 ； 5，814，318 ；5, 874, 299 ；和 5，770，429 ；Surani 等的美国专利 No. 5，545,807 ； 1998 年 6 月 11 日公布的国际公布WO 98/24884 ； 1994年11月10日公布的W094/25585 ； 1993年6月24日 公布的WO 93/1227 ;1992年12月23日公布的WO 92/22645 ;1992年3月19日公布的WO 92/03918。免疫为了产生抗DEC-205的完全人抗体，含有人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体 小鼠(例如，HCo 12、HCo7或KM小鼠)可用纯化的或富集的DEC-205抗原制品和/或表 达 DEC-205 的细胞进行免疫，如 Lonberg 等(1994)Nature 368(6474) 856-859 ；Fishwild 等(1996)Nature Biotechnology 14 :845_851 和 WO 98/24884 所述。如本文所述，用重 组DEC-205蛋白或表达DEC-205的细胞作为免疫原免疫HuMAb小鼠。或者，可以用编码人 DEC-205的DNA免疫小鼠。优选地，小鼠第一次输注时鼠龄在6_16周。例如，可以使用纯化的或富集的重组DEC-205抗原制品(5-50 μ g)经腹膜内免疫HuMab小鼠。如果用纯化的或 富集的重组DEC-205抗原制品免疫不能导致抗体产生，也可用表达DEC-205的细胞例如细 胞系免疫小鼠，以促进免疫应答。示例性的细胞系包括过量表达DEC-205的稳定的CHO和 Raji细胞系。应用各种抗原积累的经验证明，当最初使用完全弗氏佐剂 中的抗原腹膜内(IP) 或皮下(SC)免疫，接着每隔一周用弗氏不完全弗氏佐剂中的抗原IP/SC免疫(最多共10 次)时，HuMAb转基因小鼠产生最佳应答。在免疫方案进程中可以用眼眶后取血获得的血 浆样品监测免疫应答。可通过ELISA (如下所述)筛选血浆，具有足够抗DEC-205人免疫球 蛋白效价的小鼠可用于进行融合。用抗原对小鼠进行静脉内加强免疫，3天后处死并且取出 脾脏。产生抗DEC-205单克隆抗体的杂交瘤的产生为了制备产生抗DEC-205单克隆抗体的杂交瘤，从被免疫的小鼠中分离脾细胞和 /或淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。然后抗 原特异性抗体的产生筛选得到的杂交瘤。例如，使用50% PEG(w/v)，将来自被免疫小鼠的 脾淋巴细胞的单细胞悬液与SP2/0-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融 合。将细胞以大约Ix IO5的密度接种于平底微量滴定板中，接着在除常用试剂外含有10% 胎克隆血清、5-10% origen杂交瘤克隆因子(IGEN)和IX HAT(Sigma)的选择性培养基中 温育两周。大约两周之后，在用HT替换了 HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA人抗 DEC-205单克隆IgM和IgG抗体筛选各孔，或者通过FLISA (荧光连接的免疫吸附测定)根 据与表达DEC-205的细胞(例如表达DEC-205的CHO细胞系)表面的结合筛选各孔。一旦 发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天之后观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平 板接种，再次筛选，如果对于人IgG仍然是阳性，则可以通过有限稀释将抗DEC-205单克隆 抗体至少亚克隆两次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于 表征。产生抗DEC-205单克隆抗体的转染瘤的产生例如，利用的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如，Morrison, S. (1985) science 229 1202)，也能在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。例如，在一个实施方案中，感兴趣的基因，例如，人抗体基因，可以连接到表达载体 如真核表达质粒中，如WO 87/04462、W089/01036和EP 338 841公开的GS基因表达系统 或本领域公知的其它表达系统所使用的载体。具有克隆的抗体基因的纯化质粒可以被引 入真核宿主细胞如CHO细胞或NSO细胞或其它真核细胞如植物来源的细胞、真菌或酵母 细胞中。用来引入这些基因的方法可以是本领域中描述的方法，如电穿孔、lipofectine, lipofectamine或其它方法。在将这些抗体基因引入宿主细胞后，可以确认和选择表达该抗 体的细胞。这些细胞代表转染瘤，它们然后可以进行表达水平的扩增并扩大规模以产生抗 体。可以从这些培养上清液和/或细胞中分离和纯化重组抗体。或者，这些克隆的抗体基因可以在其它表达系统中如大肠杆菌中或在完整生物体 中表达，或者可以合成表达。应用部分抗体序列表达完整的抗体抗体主要是通过位于六个重链和轻链互补决定区(OTR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此原因，在各抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR之外的序列更加多样 性。因为⑶R序列负责大多数抗体-抗原相互作用，可以通过构建一种表达载体来表达模 拟天然存在的特异性抗体的性质的重组抗体，该构建体包含来自天然存在的特异性抗体的 CDR序列，这些序列已被移植到来自具有不同性质的不同抗体的构架序列上(参见，例如， Riechmann, L 等，1998，Nature332 :323_327 Jones, P.等，1986，Nature 321 :522_525 ；禾口 Queen, C.等，1989，Proc. Natl. Acad. See. U. S. Α. 86 10029-10033)。这些构架序列可以从 包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列将不同于成熟抗体基因序 列，因为它们将不包括完全装配的可变基因，后者是在B细胞成熟过程中通过V (D) J连接形 成的。种系基因序列在对应的单个可变区中也将不同于高亲和力次级全套抗体(secondary repertoire antibody)的序列。例如，构架区的氨基末端部分的体细胞突变是相对少见的。 例如，体细胞突变在构架区1的氨基末端部分和构架区4的羧基末端部分相对少见。此外， 许多体细胞突变不会显著改变抗体的结合性质。由于此原因，为了产生具有与原抗体类似 的结合性质的完整重组抗体，不一定要获得特定抗体的完整DNA序列(参见1999年3月12 日提交的PCT/US99/05535)。对于此目的，跨过CDR区的部分重链和轻链序列一般是足够 的。利用该部分序列确定哪些种系可变基因和连接基因区段贡献于重组抗体可变基因。然 后利用种系序列补平可变区中丢失的部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中被切 割，并且对最终抗体的性质没有贡献。为了添加丢失的序列，通过连接或PCR扩增，克隆的 cDNA序列可以与合成的寡核苷酸组合。此外，完整的可变区可以合成为一组短的、重叠的 寡核苷酸，并且通过PCR扩增组合，以产生完全合成的可变区克隆。这一方法具有一定的优 点，例如消除或包含特定的限制性位点，或者优化特定的密码子。利用来自杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列设计一组重叠的合成寡核苷 酸，以产生具有与天然序列相同的氨基酸编码能力的合成V序列。合成重链和κ链序列可 能在三个方面不同于天然序列打断了重复核苷酸碱基串，以利于寡核苷酸合成和PCR扩 增，根据 Kozak 原则(Kozak, 1991，J. Biol. Chem. 266 19867-19870)引入最佳翻译起始位 点；并且将HindIII位点构建在翻译起始位点的上游。对于重链和轻链可变区，将优化的编码链序列和相应的非编码链序列分解成接近 相应非编码寡核苷酸的中点的30-50个核苷酸。因此，对于每条链，寡核苷酸可以装配为重 叠的双链组，它们跨过150-400个核苷酸的区段。然后使用该集合作为模板，产生150-400 个核苷酸的PCR扩增产物。典型地，单可变区寡核苷酸组将分解为两个集合，它们分别扩增 以产生两个重叠的PCR产物。这些重叠的产物然后通过PCR扩增进行组合，以形成完整的可 变区。也可能希望在PCR扩增中包括重链或轻链恒定区的重叠片段(包括κ轻链的BbsI 位点，或、重链的AgeI位点)，以产生能够容易地克隆到表达载体构建体内的片段。重构的重链和轻链可变区然后与克隆的启动子、前导序列、翻译起点、前导序列、 恒定区、3’非翻译区、聚腺苷酸化和转录终止序列组合，以形成表达载体构建体。重链和轻 链表达构建体可以组合到一个载体中，共转染，系列转染，或分别转染宿主细胞，然后将该 宿主细胞融合，形成表达两条链的宿主细胞。构建用于构建表达载体的质粒，使得可以利用PCR扩增的V重链和V κ轻链cDNA 序列重新构建完整的重链和轻链小基因。这些质粒可以用来表达完全人IgG1K或IgG4K 抗体。本发明的完全人抗体和嵌合抗体也包括IgG2、IgG3、IgE、IgA、IgM和IgD抗体。为了表达其它重链同种型，或者为了表达包含λ轻链的抗体，可以构建类似的质粒。因此，在本发明的一个方面，利用本发明的抗DEC-205抗体的结构特征产生结构 上相关的抗DEC-205抗体，该抗体保留本发明的抗体的至少一种功能性质，例如，根据表面 等离子体共振测定，以至少IO8M4的亲和常数结合人DEC-205 ；在结合表达DEC-205的人树 突细胞后内化；定位于人树突细胞中的抗原加工区室；激活表达DEC-205的人树突细胞；与 非人灵长类动物或其它物种的树突细胞上的DEC-205交叉反应；和产生或增强针对抗原的 人T细胞应答，如CTL应答，优选由MHC I类和II类途径两者介导的CTL应答。在一个实施方案中，本发明的抗体的一个或多个CDR区可以与已知的构架区和 ⑶R重组组合，以产生另外的重组构建的本发明的抗DEC-205抗体。其重链和轻链可变构 架区可以来源于相同或不同的抗体序列。抗体序列可以是天然存在的抗体的序列，或者可 以是几种抗体的共有序列。参见 Kettleborough 等，Protein Engineering 4:773(1991)； Kolbinger 等，Protein Engineering 6 971 (1993)，和 Carter 等，WO 92/22653。因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种制备抗DEC-205抗体的方法，包括制备一种抗体，该抗体包括(1)重链构架区和重链⑶R，其中至少一个重链⑶R包 括选自 SEQ ID NO :5、6、7、17、18、19、29、30、31、41、42、43、53、54、55、65、66、67、71、72、73、 77、78、79、89、90或91所示的⑶R氨基酸序列的氨基酸序列；和(2)轻链构架区和轻链⑶R， 其中至少一个轻链 CDR 包括选自 SEQID NO :11、12、13、23、24、25、35、36、37、47、48、49、59、 60、61、83、84或85所示的⑶R氨基酸序列的氨基酸序列，其中该抗体保留结合DEC-205的 能力。抗体结合DEC-205的能力可以使用标准结合分析来检测，如实施例所述的分析(例 如，ELISA 或 FLISA)。本领域公知，抗体的重链和轻链CDR3结构域在抗体对于抗原的结合特异性/亲和 力中起特别重要的作用(参见，Hall 等，J. Imunol.，149 1605-1612 (1992) ；Polymenis 等， J. Immunol.，152 :5318_5329 (1994) Jahn 等，Immunobiol.，193 400-419 (1995) ；Klimka 等，Brit. J. Cancer, 83 252-260 (2000) ；Beiboer 等，J. Mol. Biol，296 :833_849 (2000)； Rader 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 8910-8915 (1998) ；Barbas 等，J. Am. Chem. Soc.， 116 2161-2162(1994) ；Ditzel 等，J. Immunol.，157 :739_749 (1996))。因此，如上所述制备 的本发明的重组抗体优选地包含抗体3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、 3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6和3A4-1C10的重链和/或轻链CDR3。该抗体可进一步包 含抗体 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、OT12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10 的 CDR2。该抗体可进一步包含抗体 3D6_2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8_1F1、 2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、OT12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10 的 CDR1。该抗体可进一步包含 CDR 的任何组合。因此，在另一个实施方案中，本发明进一步提供了抗DEC-205抗体，该抗体包含 (1)重链构架区、重链⑶Rl区、重链⑶R2区和重链⑶R3区，其中重链⑶R3区选自3D6-2F4、 3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10 的 ⑶R3，例如，如SEQ ID NO 7所示的3D6-2F4的重链⑶R3区；和(2)轻链构架区、轻链 CDRl区、轻链CDR2区和轻链CDR3区，其中轻链CDR3区选自3D6-2F4、3D6_4C8、3G9_2D2、 5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10 的 CDR3,例如，如 SEQ ID N0:13所示的3D6-2F4的轻链⑶R3区，其中该抗体结合DEC-205。该抗体可进一步包含抗体 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10的重链CDR2和/或轻链CDR2。该抗体可进一步包含3D6-2F4、3D6_4C8、3G9_2D2、 5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、OT12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10 的重链 CDRl 和 / 或轻链 CDRl。具有修饰序列的抗体的产生在另一个实施方案中，本发明的抗DEC-205抗体的可变区序列或其部分被修饰， 从而产生结构上相关的抗DEC-205抗体，该抗体保留了结合(即，与修饰抗体结合相同的 表位)能力，因此在功能上是等同的。确认可以被改变而不消除抗原结合的残基的方法是 本领域公知的(参见，例如，Marks等(Biotechnology (1992) 10 (7) :779_83 (通过用固定 的⑶R3序列改变改组轻链可变区，然后改组重链可变区，使单克隆抗体多样化)，Jespers 等(1994) Biotechnology 12(9) :899_903 (从针对抗原单表位的噬菌体展示谱中选择人抗 体)，Sharon等(1986) PNASUSA 83(8) :2628_31 (抗体的可变-多样性区段连接处的不变氨 基酸残基的定点诱变)；Casson等(1995) J. Immunol. 155(12) :5647_54 (抗体重链可变区 随机诱变产生的特异性的丢失和变化的进化)。因此，在本发明的一个方面中，上述工程化抗体的⑶Rl、2和/或3区可以包含准 确的氨基酸序列，如此处公开的抗体3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、 3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6和3A4-1C10的氨基酸序列。但是，在本发明的其它方面，所述 抗体包含 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和3A4-1C10的确切⑶R序列的衍生物，而仍然保留有效结合DEC-205的能力。这些序列修 饰可以包括一个或多个氨基酸添加、缺失或置换，例如上述保守序列修饰。序列修饰也可以 基于抗体 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和3A4-1C10的特定CDR1、CDR2和CDR3序列的上述共有序列。因此，在另一个实施方案中，工程化抗体可以包含一个或多个⑶R，所述⑶R与 抗体 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 和 3A4-1C10的一个或多个⑶R例如90%、95%、98%或99. 5%相同。在上述数值中间的范围， 例如，与上述序列中的一个或多个90-95 %、95-98 %或98-100 %相同的⑶R，也包括在本发明中。在另一个实施方案中，可以改变CDR的一个或多个残基，以改变结合，从而达到更 有利的结合速率、更有利的解离速率，或这两者，从而达到理想的结合常数。使用这一策略， 可以获得具有例如IOkT1或更高的超高结合亲和力的抗体。本领域公知的和本文描述的亲 和力成熟技术可以用来改变CDR区，然后针对希望的结合改变筛选得到的结合分子。因此， 当一个或多个CDR改变时，可以监测到结合亲和力以及免疫原性的改变，并且进行评分，从 而获得为了结合和低免疫原性的最佳组合而优化的抗体。除了 CDR内的修饰以外或者作为其替代，也可以在抗体重链和/或轻链可变区的 一个或多个构架区、FR1、FR2、FR3和FR4内进行修饰，只要这些修饰不消除抗体的结合亲和 力。例如，将本发明抗体的重链和/或轻链可变区的构架区中的一个或多个非种系氨基酸 残基置换为种系氨基酸残基，即，与该抗体具有显著序列同一性的重链或轻链可变区的人 种系序列中相应的氨基酸残基。例如，抗体链可以同与之具有显著序列同一性的种系抗体 链对齐，在抗体构架序列和种系链构架之间不匹配的氨基酸残基可以用来自种系序列的相
29应的残基置换。当抗体可变构架区和相当的人种系序列可变构架区之间的氨基酸不同时， 抗体构架氨基酸通常应当用相应的人种系序列氨基酸代替，如果合理地预期该氨基酸落入 以下类别之一中(1)直接非共价结合抗原的氨基酸残基，(2)与⑶R区相邻的氨基酸残基，(3)以其它方式与CDR区相互作用的氨基酸残基(例如，通过计算机建模确定，在 ⑶R区的大约3-6人内)，或 (4)参与VL-VH界面的氨基酸残基。“直接非共价结合抗原”的残基包括非常可能通过确定的化学力如氢键键合、范德 华力、疏水相互作用等与抗原上的氨基酸直接相互作用的构架区内位置处的氨基酸。因此， 在一个实施方案中，本发明抗体的构架区中的氨基酸残基被置换为直接与抗原非共价结合 的相应的种系氨基酸残基。“与⑶R区相邻的”残基包括与抗体一级序列中的一个或多个⑶R直接邻近的位置 中的氨基酸残基，例如，在直接邻近根据Kabat定义的⑶R，或者根据Chothia定义的⑶R的 位置中的氨基酸残基(参见，例如，Chothia和Lesk J. Mol. Biol. 196 :901 (1987))。因此， 在一个实施方案中，本发明抗体的构架区内的氨基酸残基被置换为与CDR区相邻的相应的
种系氨基酸残基。“以其它方式与⑶R区相互作用的”残基包括通过二级结构分析确定的、其空间定 向足以影响⑶R区的残基。这些氨基酸通常具有⑶R中某些原子的大约3埃单位(人)内的 侧链原子，并且必然含有能够根据确定的化学力(如以上所列出的)与CDR原子相互作用 的原子。因此，在一个实施方案中，本发明抗体的构架区内的氨基酸残基被置换为以其它方 式与CDR区相互作用的相应的种系氨基酸残基。已知在许多抗体中，构架中的几个位置处的氨基酸对于确定CDR构象是重要的 (例如，能够与CDR相互作用)(Chothia和Lesk,同上，Chothia等，同上，和Tramontano等， J. Mol. Biol. 215 :175 (1990)，所有这些都通过引用并入本文)。这些作者通过分析几种已 知抗体的结构，确定了对CDR构象重要的保守构架残基。基于CDR的构象，所分析的抗体落 入有限数量的结构或“规范”类别中。规范类别成员内的保守的构架残基被称为“规范”残 基。规范残基包括轻链的残基2、25、29、30、33、48、64、71、90、94和95以及重链的残基24、 26、29、34、54、55、71和94。另外的残基(例如，决定CDR结构的残基)可以按照Martin和 Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263 800的方法进行确认。特别是，已知轻链位置2、48、64和 71和重链位置26-30、71和94处的氨基酸(根据Kabat编号)能够与多种抗体中的⑶R相 互作用。轻链位置35和重链位置93和103处的氨基酸也可能与⑶R相互作用。可以实现 CDR构象的另外的残基可以按照Foote和Winter (1992) J. Mol. Biol. 224 487的方法进行 确认。这些残基被称为“游标”残基，并且是接近地位于CDR下(即，在CDR下形成“平台”) 的构架区中的残基。“参与VL-VH界面的”残基或“堆积残基”包括如例如Novotny和Haber，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，82 :4592-66(1985)或Chothia等(同上)定义的在VL和VH之间界面处的残基。偶然地，关于特定氨基酸是否落于一个或多个上述类别中，有一些不明确。在这些情况下，产生替代的变异抗体，其中之一具有所述特定的置换，另一个没有。这样产生的替 代的变异抗体可以在此处所述的任何分析中检测希望的活性，并且选择优选的抗体。构架区内置换的另外的候选物是在该位置处对于抗体而言不常见的或“罕见的” 氨基酸。这些氨基酸可以被置换为来自人种系序列的等同位置或来自更典型抗体的等同位 置的氨基酸。例如，当抗体构架区中的氨基酸对于该位置是罕见的，并且种系序列中相应的 氨基酸对于免疫球蛋白序列中的该位置是常见的；或者当抗体中的氨基酸对于位置是罕见 的，并且种系序列中相应的氨基酸相对于其它序列也是罕见的时，置换可能是需要的。预期 通过将不常见的氨基酸置换为恰好是抗体典型的来自种系序列的氨基酸，可以使抗体的免 疫原性较低。本文使用的术语“罕见的”表示在代表性的序列样本中，在低于大约20%、优选 地低于大约10%、更优选地低于大约5%、甚至更优选地低于大约3%、甚至更优选地低于 大约2%、甚至更优选地低于大约的序列中在该位置处出现该氨基酸，本文使用的术语 “常见的”表示在代表性样品中，在超过大约25%、通常超过大约50%的序列中出现该氨基 酸。例如，所有轻链和重链可变区序列分别分组为序列“亚组”，它们彼此特别同源，并且在 某些关键位置处具有相同的氨基酸(Kabat等，同上)。当确定抗体序列中的氨基酸在序列 之间是“罕见的”还是“常见的”时，通常优选地只考虑那些与所述抗体序列属于相同亚组 的序列。通常，抗体的构架区与它们所来源的人种系序列的构架区基本上相同，更通常的 是相同。当然，构架区中的许多氨基酸对抗体的特异性或亲和力没有直接贡献或只有很小 的贡献。因此，构架残基的许多保守置换可以耐受，而不会明显地改变得到的免疫球蛋白的 特异性或亲和力。因此，在一个实施方案中，抗体的可变构架区与人种系可变构架区序列或 这些序列的共有序列具有至少85%的序列同一性。在另一个实施方案中，抗体的可变构架 区与人种系可变构架区序列或这些序列的共有序列具有至少90%、95%、96%、97%、98% 或99%的序列同一性。除了简单结合DEC-205以外，可以根据本发明抗体的其它功能特性的保留来选择 抗体，例如(a)根据表面等离子体共振测定，以至少IO8M4的亲和常数结合人DEC-205 ；(b)在结合表达DEC-205的人树突细胞后内化；(c)定位于树突细胞的抗原加工区室；(d)激活表达DEC-205的人树突细胞；(e)与非人灵长类动物或其它物种的树突细胞上的DEC-205交叉反应；(f)产生或增强由MHC I类和II类途径两者介导的人T细胞应答，优选T细胞应 答；(g)产生或增强人CD4+、CD8+或NKT细胞应答；和(h)诱导周围⑶8+T细胞耐受性。抗DEC-205单克隆抗体的表征可以利用多种已知的技术表征本发明的单克隆抗体与DEC-205的结合。通常，最 初通过ELISA表征抗体。简要地说，微量滴定板可以用PBS中的纯化的DEC-205包被，然后 用PBS稀释的无关蛋白质如牛血清清蛋白(BSA)封闭。将来自DEC-205免疫的小鼠的血浆
31稀释液加至各孔中，并在37°C下温育1-2小时。用PBS/Tween 20洗板，然后与偶联至碱性 磷酸酶的山羊-抗-人IgG Fc特异性多克隆试剂于37°C温育1小时。洗涤后，用ABTS底 物使板显色，并在OD 405处分析。优选地，形成最高效价的小鼠用于融合。如上所述的ELISA测定可以用来筛选抗体，并因此筛选可产生显示与DEC-205免 疫原具有阳性反应性的抗体的杂交瘤。然后可以将优选地以高亲和力结合DEC-205的杂交 瘤进行亚克隆并进一步表征。然后可以从每个杂交瘤选择一个保留亲本细胞反应性(根据 ELISA)的克隆，用于制备细胞库(cell bank)，以及用于抗体纯化。为了纯化抗DEC-205抗体，选择的杂交瘤可以在摇瓶、2升旋瓶或其它培养系统中 生长。可以过滤并浓缩上清液，然后使用蛋白A-s印harose (Pharmacia，Piscataway，NJ) 进行亲和层析，以纯化该蛋白质。将缓冲液更换为PBS后，可以使用1. 43的消光系数根据 OD280或优选地通过浊度分析确定浓度。IgG可以通过凝胶电泳和抗原特异性方法来检查。为了确定选择的抗DEC-205单克隆抗体是否结合独特表位，每种抗体可以用商购 试剂(Pierce，Rockford, IL)生物素化。生物素化的MAb的结合可以用链霉亲和素标记的 探针来检测。为了确定纯化抗体的同种型，可以使用本领域公认的技术进行同种型ELISA。 例如，微量滴定板的孔可以用10yg/ml抗Ig包被，4°C过夜。用5% BSA封闭后，培养板与 10yg/ml单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应2小时。孔然后可以与IgGl 或其它同种型特异性偶联探针反应。如上所述使板显色并且进行分析。为了检测单克隆抗体与表达DEC-205的活细胞的结合，可以采用流式细胞术。简 要地说，表达膜结合DEC-205的细胞系和/或人PBMC (在标准生长条件下生长)与在含有 0. 1 % BSA和0. 01 % NaN3的PBS中的各种浓度的单克隆抗体于4°C混合1小时。洗涤后，细胞 与荧光素标记的抗IgG抗体在与第一抗体染色相同的条件下反应。样品可以通过FACScan 仪器进行分析，利用光散射和侧散射性质，以圈选单细胞，并确定标记的抗体的结合。(除了 流式细胞分析以外或者代替它)可以采用使用荧光显微镜的替代分析。可以完全如上所述 染色细胞，并进行荧光显微镜检查。该方法允许显示各细胞，但是根据抗原的密度，可能灵 敏度降低。可以通过Western印迹法进一步检测抗DEC_205IgG对于DEC-205抗原的反应性。 简言之，可以制备来自表达DEC-205的细胞的细胞提取物，并且进行十二烷基硫酸钠聚丙 烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20%小鼠血清封闭，并 用将要检测的单克隆抗体探查。IgG结合可以使用抗IgG碱性磷酸酶来检测，并用BCIP/NBT 底物片(Sigma Chem. Co.，St. Louis, MO)显色。分析各种抗DEC-205抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本 领域中已知的标准分析,例如,使用Biacore 2000SPR仪器(Biacore AB, Uppsala, Sweden) 的Biacore 表面等离子体共振(SPR)分析，如本文中的实施例2所述。II.分子偶联物/免疫毒素本发明提供多种治疗性分子偶联物(例如，疫苗偶联物)，其包括与结合APC上受 体的抗体(例如，结合DEC-205的抗体)连接的抗原如肿瘤或病毒抗原。这允许将抗原靶 向至APC，如表达DEC-205的细胞(例如，树突细胞和B细胞)，以增强加工、呈递及最终对 抗原的免疫应答，例如CTL应答。这种偶联物的示意图示于图8中。在所示的实例中，抗原 与基本上完整的抗DEC-205抗体的每一个重链的CH3域遗传融合。但是，应当理解，抗原也可以连接到这种抗体或其片段的其它部分上，并且也可以使用其它形式的偶联如化学偶 联，如下文进一步所述。用于本发明的合适的抗原包括，例如，希望发生针对它们的保护性或治疗性免疫 应答的传染病抗原和肿瘤抗原，例如，肿瘤细胞表达的抗原或病原体生物或传染病抗原。例 如，合适的抗原包括用于预防或治疗癌症的肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的例子包括但不 限于包含 3hCG、gplOO 或 Pmell7、HER2/neu、WTl、间皮蛋白、CEA、gplOO、MARTI、TRP-2、 melan-A、NY-ESO-U NY-BR-U NY-C0-58、MN(gp250)、独特型、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪 氨酸酶、端粒酶、SSX2和MUC-I抗原和生殖细胞来源的肿瘤抗原的序列的全部或部分的序 列。肿瘤相关抗原也包括血型抗原，例如，Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-l、B-2抗原。此外，本 发明的抗原-抗体构建体内也可以包含一种以上的抗原。例如，MAGE抗原可以与其它抗原 如黑色素A、酪氨酸酶和gplOO以及佐剂如GM-CSF或IL-12 —起组合，并且连接至抗APC抗 体上。其它合适的抗原包括用于预防或治疗病毒性疾病的病毒抗原。病毒抗原的 例子包括但不限于HIV-I gag、HIV-I env、HIV-I nef、HBV(表面或核心抗原)、HPV、 FAS、HSV-1、HSV-2、ρ 17、0RF2和0RF3抗原。细菌抗原的例子包括但不限于鼠弓形虫 (Toxoplasmagondii)或苍白密螺旋体(Ti^ponema pallidum)。本发明的抗体-细菌抗原偶 联物可以用于治疗或预防多种细菌性疾病如炭疽、肉毒中毒、破伤风、衣原体、霍乱、白喉、 莱姆病、梅毒和结核病。上述抗原的序列在本领域中是公知的。例如，MAGE-3 cDNA序列的实例在US 6, 235, 525 (Ludwig Institute for Cancer Research)中提供；NY-ESO-l 核酸和蛋白质序 列的实例在US 5，804，381 和US6, 069，233 (Ludwig Institute for Cancer Research)中提 供；Melan-A 核酸和蛋白质序列的实例在 US 5，620，886 和 US 5, 854, 203 (LudwigInstitute for Cancer Research)中提供；NY-BR-I核酸和蛋白质序列的实例在US 6，774，226和US 6，911，529 (Ludwig Institute for CancerResearch)中提供；NY-C0-58 核酸和蛋白质序 列的实例在 W002090986 (Ludwig Institute for Cancer Research)中提供；HER-2/neu 蛋白的氨基酸序列的实例可从GENBANK 登录号AAA58637获得；人癌胚抗原-样 1 (CEA-I)的核苷酸序列(mRNA)可从GENBANK 登录号NM_020219获得。可用于本发明药物组合物和方法中的HPV抗原可包括，例如，HPV-16抗原、HPV-18 抗原、HPV-31抗原、HPV-33抗原和/或HPV-35抗原；合适地是HPV-16抗原和/或HPV-18抗 原。HPV-16的基因组在Virology，145 181-185 (1985)中有描述，编码HPV-18的DNA序列在 美国专利No. 5，840，306中有描述，其公开内容通过引用全文并入本文中。HPV-16抗原(例 如，HPV-16的El和/或E2蛋白的血清反应区)在美国专利No. 6，531，127中有描述，HPV-18 抗原(例如，HPV-18的Ll和/或L2蛋白的血清反应区)在美国专利No. 5，840，306中有 描述，其公开内容通过引用全文并入本文中。类似地，HBV的全基因组可从GENBANK 登录号NC_003977获得，其公开内容通过引用全文并入本文中。HCV的基因组在欧洲专利申 请No. 318216中有描述，其公开内容通过引用全文并入本文中。通过引用全文并入本文中 的PCT/US90/01348公开了 HCV基因组克隆的序列信息、HCV病毒蛋白的氨基酸序列以及制 备和使用这些组合物用于包含由其衍生的HCV蛋白和肽的HCV疫苗的方法。蛋白质的抗原性肽(即含有T细胞表位的那些)可以用本领域公知的多种方式确认。例如，T细胞表位可以通过利用基于web的预测性算法(BIMAS & SYFPEITHI)分析蛋白 质的序列来预测，以产生潜在的MHC I类和II结合肽，它们匹配10，000个良好表征的以前 用CTL定义的MHC结合肽的内部数据库。可以将高得分的肽排序，并且基于对给定MHC分 子的高亲和力选择它们作为“感兴趣的”。另外一种确认含有T细胞表位的抗原性肽的方法是将蛋白质分为所需长度的非 重叠肽或所需长度的重叠肽，它们可以通过重组、合成方法或在某些限制情况下通过化学 切割蛋白质来产生，并检测其免疫原性，例如，引发T细胞应答(S卩，增殖或淋巴因子分泌)。为了通过例如精细作图技术确定蛋白质的精确的T细胞表位，通过T细胞生物学 技术测定，具有T细胞刺激活性并因此包含至少一个T细胞表位的肽可以通过在该肽的氨 基或羧基末端添加或删除氨基酸残基来进行修饰，并进行检测，以确定对修饰的肽的T细 胞反应性的变化。如果通过T细胞生物学技术测定，发现在天然蛋白质序列中具有重叠区 的两个或多个肽具有人T细胞刺激活性，可以产生包含这些肽的全部或一部分的另外的 肽，并且可以通过类似的方法检测这些另外的肽。利用这一技术，重组或合成地选择和产生 肽。肽的选择基于多种因素，包括对肽的T细胞应答的强度(例如，刺激指数)。然后可以 检测这些选择的肽的物理和化学性质(例如，溶解性、稳定性)，以确定这些肽是否适用于 治疗组合物，或者这些肽是否需要修饰。另外，疫苗偶联物可以包含一种或多种也能增强针对抗原的免疫应答的免疫刺激 剂。本发明的抗体-抗原疫苗偶联物可以通过遗传学或化学方法制备。在任一情况下，偶 联物的抗体部分可以由完整抗体或该抗体的一部分组成，如Fab片段或单链Fv。另外，偶联 物中可以包含一种以上的抗原和/或免疫刺激剂。化学构建的抗体-抗原偶联物可以使用多种众所周知的并且易于使用的交联试 剂制备。这些交联试剂可以是同功能的或异功能的化合物，如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡 啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、4_ (N-马来酰 亚氨基甲基)环己基-1-羧酸磺基琥珀酰亚氨酯(磺基-SMCC) ,5,5'-联硫基双(2-硝基 苯甲酸)(DTNB)，它们与抗树突细胞抗体和选择的抗原上的不同的反应性氨基酸或碳水化 合物侧链形成共价键。也可以使用其它偶联剂和交联剂产生共价键，如蛋白A、碳二亚胺和 邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)；(参见，例如，Karpovsky 等(1984) J. Exp. Med. 160 1686 ； Liu, MA 等(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括 Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78，118-132) ；Brennan 等(Science (1985) 229 :81_83)，和 Glennie 等 (J. Immunol. (1987) 139 =2367-2375)所描述的方法。优选的偶联剂为SATA和硫代-SMCC, 两者均可从Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)获得。也可以使用上述相同的连接方法 将免疫刺激剂与本发明的分子偶联物化学连接。在另一个实施方案中，本发明的抗体与治疗性部分如细胞毒素、药物或放射性同 位素连接。当与细胞毒素偶联时，这些抗体偶联物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒 剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌 肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉 素、柔红霉素、二羟基蒽醌(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、 1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似 物或同系物。治疗剂包括但不限于，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、噻替派苯丁酸 氮芥(thio印achlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白 消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合钼(II) (DDP)顺钼)，蒽环类 抗生素(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素类(例如，放线菌素D(以 前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，抗有丝分裂剂(例如，长春新碱 和长春碱)。本发明的抗体可以与放射性同位素例如放射性碘偶联，以产生细胞毒性放射性 药物，用于治疗树突细胞相关的疾病，如自身免疫病或炎性疾病，或移植物抗宿主病。本发明的抗体偶联物可以用来改变特定的生物学反应，且药物部分不应理解为局 限于经典的化疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。这样的 蛋白质包括，例如，具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单 胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-Y ；或生物反应调节物，如淋 巴因子、白介素_1( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素_6( “IL-6”)、粒细胞巨噬细胞 集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。将这种治疗性部分与抗体偶联的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon 等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld 等(eds. ), pp.243-56(Alan R. Liss,Inc.1985) ；Hellstrom 等，"Antibodies For Drug Delivery" ,in Controlled Drug Delivery(2nd Ed·), Robinson 等(eds·), pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc.1987)； Thorpe, " Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review", in Monoclonal Antibodies ' 84 :Biological and Clinical Applications,Pinchera 等(eds·), pp.475-506 (1985) ； " Analysis, Results, and FutureProspectiVe Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies InCancer Therapy" , in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy,Baldwin等(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985)， 禾口 Thorpe 等， "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates" , Immunol. Rev. , 62 :119-58(1982)。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以用来将完整细胞例如肿瘤细胞、效应细 胞或微生物病原体直接靶向至树突细胞。例如，抗DEC-205抗体可以在细胞表面直接表达， 例如，通过用含有编码本发明抗体的核酸序列的载体转染或转导细胞。这可以通过例如用 编码含有跨膜域和抗树突细胞抗体或其抗原结合片段的融合蛋白的核酸转染靶细胞来完 成。产生这种核酸、融合蛋白和表达这种融合蛋白的细胞的方法例如在美国专利申请No 09/203, 958中有描述，在此通过引用并入本文。或者，利用化学连接体、脂质标签或其它 相关方法，抗树突细胞抗体或其抗原结合片段可以结合到细胞或病原体上(deKruif，J.等 (2000) Nat. Med. 6 :223_227 ；Nizard, P.等(1998) FEBS Lett. 433 :83_88)。表面锚定有抗 DEC-205抗体的细胞可以用来诱导针对细胞例如肿瘤细胞或微生物病原体的特异性免疫应 答。III.药物组合物在另一个实施方案中，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上 可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的单克隆抗体。也提供了含有包含本发明 的抗体的双特异性分子或分子偶联物的组合物。在一个实施方案中，组合物包括多种(例如两种或多种)本发明的分离的抗体的组合。优选地，组合物中的每种抗体结合DEC-205 的不同的、预先选择的表位。本发明的药物组合物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治 疗可包括本发明的组合物联合至少一种或多种另外的治疗剂，如抗炎剂、DMARD(疾病改善 抗风湿药)、免疫抑制剂和化疗剂。本发明的药物组合物也可以与放射疗法一起施用。与其 它抗体如CD4特异性抗体或IL-2特异性抗体的共施用也包括在本发明中。这种与CD4特异 性抗体或IL-2特异性抗体的组合被认为在治疗自身免疫病和移植排斥方面特别有用。与 针对CTLA4、CD40等的抗体的组合在癌症和传染病的治疗中特别有用。在另一个实施方案中，被APC快速内化的疫苗偶联物可以与增强树突细胞的抗原 呈递细胞活性(例如，免疫刺激性细胞因子的释放)的单克隆抗体组合。本文所用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上兼容的溶剂、分散介 质、包衣料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适用于静脉内、肌 内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(如通过注射或输注)。取决于给药途径，活性化合物 (即抗体、双特异性和多特异性分子)可包被以某种材料，以保护所述化合物免受可能使其 失去活性的酸和其它自然条件的作用。可以与本发明的抗体和构建体一起使用的佐剂的例子包括弗氏不完全佐剂和完 全佐齐Ll (Difco Laboratories, Detroit, Mich. ) ；MerckAdjuvant 65 (Merck and Company, Inc.，Rahway，N. J.) ；AS-2 (SmithKline Beecham，Philadelphia，Pa.)；铝盐，如氢氧化铝凝 胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬液；酰化糖；阳离子或阴离子 衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解的微球；细胞因子，如GM-CSF、白介素-2、-7、-12和其它 类似因子；3D-MPL ；CpG寡核苷酸；和单磷酰脂质A，例如3-脱-0-酰化单磷酰脂质A。MPL 佐剂可从 Corixa Corporation (Seattle, Wash ；参见，例如，美国专利 No. 4, 436, 727 ；4, 877, 611 ；4，866，034 和 4，912，094)获得。含有 CpG 的寡核苷酸(其 中CpG 二核苷酸未甲基化)是公知的，并且在例如WO 96/02555，WO 99/33488和美国专 利No. 6，008，200和5，856，462中有描述。也描述了免疫刺激性DNA序列，例如，Sato等， Science273 :352，1996。其它替代佐剂包括，例如，皂草苷，如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc. , Framingham, Mass.)；七叶素；洋地黄阜苷；或石头花属 (Gypsophila) 或奎奴亚藜(Chenopodiumquinoa)皂草苷 ；Montanide ISA 720(Seppic, France) ；SAF(Chiron, California, United States) ；ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron) ；SBAS 系列佐剂(例如，SBAS-2 或 SBAS-4，可获自 SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium)； Detox (Enhanzyn ) (Corixa, Hamilton, Mont.) ；RC—529 (Corixa, Hamilton, Mont.)禾口其它 氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)；聚氧乙烯醚佐剂，如WO 99/52549A1中所述的那些； 合成》餅喧#，如咪喹莫特[S-26308，R-837], (Harrison，等，Vaccine 19 1820-1826, 2001 ； 和瑞喹莫德[S-28463，R-848] (Vasilakos，等，Cellularimmunology 204 :64_74，2000 ；在 抗原呈递细胞和T细胞表面组成型表达的羰基和胺的席夫碱，如妥卡雷琐(Rhodes，J.等， Nature 377 =71-75,1995)；作为蛋白质或肽的细胞因子、趋化因子和共刺激分子，包括例 如促炎细胞因子，如干扰素、GM-CSF, IL-I α、IL-I β、TGF-α和TGF-β，Thl诱导物，如干 扰素 Y > IL-2、IL-12、IL-15、IL-18 和 IL-21，Th2 诱导物，如 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和IL-13，和其它趋化因子和共刺激基因，如 MCP-I、MIP-I α、MIP-I β、RANTES, TCA-3、CD80、 ⑶86和⑶40L ；免疫刺激剂靶向配体，如CTLA-4和L-选择素，凋亡刺激蛋白和肽，如Fas ；基 于合成脂质的佐剂，如 vaxfectin，(Reyes 等，Vaccine 19 :3778_3786，2001)、鲨烯、α-生 育酚、聚山梨醇酯 80、DOPC 和胆固醇；内毒素，[LPS], (Beutler, B. , CurrentOpinion in Microbiology 3 =23-30,2000)；引发Toll受体产生Thl-诱导细胞因子的配体，如合成分 枝杆菌脂蛋白，分枝杆菌脂蛋白P19、肽聚糖、磷壁酸和脂质AjP CT(霍乱毒素，亚单位A和 B)和LT (来自大肠杆菌的不耐热肠毒素，亚单位A和B)，热休克蛋白家族(HSP)和LLO (单 核细胞增多性李斯特菌素0;W0 01/72329)。这些和各种其它Toll-样受体(TLR)激动剂 例如在 Kanzler 等，Nature Medicine, May2007, Vol 13，No 5 中有描述。“药学上可接受的盐”是指保持了亲代化合物的所需生物活性而不引起任何不期 望的毒理学作用的盐(参见如Berge，S.M.等(1977) J. Pharm. Sci. 66 1-19)。这样的盐的 例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些由诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、 氢碘酸、亚磷酸等无毒性无机酸衍生的盐，以及由诸如脂族单羧酸和脂族二羧酸、苯基取代 的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等无毒性有机酸衍生的盐。碱加成盐包括 那些由诸如钠、钾、镁、钙等碱土金属衍生的盐，以及由诸如N，N’_ 二苄基乙二胺、N-甲基葡 糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒性有机胺衍生的盐。本发明的组合物可以利用本领域公知的多种方法给药。本领域技术人员应当理 解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。活性化合物可以与保护该化合物不被 快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊化递送系统。可 以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、 聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人 员所公知。参见，例如，Sustained andcontrolled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson，ed.，MarcelDekker, Inc.，New York，1978。为通过某些给药途径施用本发明化合物，可能有必要使所述化合物包被以某种材 料，或使所述化合物与某种材料一起给药，以防止其失去活性。例如，所述化合物可在适当 的载体如脂质体或稀释剂中给予患者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和含水缓冲溶液。 脂质体包括水包油包水型CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等(1984) J. Neuroimmunol. 7 27)。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分 散液的无菌粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。除非任 何常规介质或试剂与活性化合物不相容，涉及其在本发明的药物组合物中的应用。还可以 向组合物中掺入补充的活性化合物。治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物 配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如 水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散 介质。例如，通过使用诸如卵磷脂等包被材料，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大 小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中优选包含 等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇，或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸 收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物的延长的吸收。
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通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的 成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺 入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备 无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，该方法由其预 先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。调节剂量方案，以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以给予单次团 注(single bolus)，可以随时间施用几个分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需， 可以按比例减小或增加剂量。例如，本发明的抗体可以通过皮下注射每周施用一次或两次， 或者通过皮下注射每月施用一次或两次。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均勻的剂量单位形式。此 处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的受试者的物理不连续单位；每 个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产 生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合 物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个 体敏感性的活性化合物的限制。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半 胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、 丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合 剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。对于治疗性组合物，本发明制剂包括适于经口给药、鼻内给药、局部给药(包括口 腔和舌下给药)、直肠给药、阴道给药和/或胃肠外给药的那些剂型。所述制剂可方便地以 单位剂型的形式提供，且可通过药物技术领域公知的任何方法制备。能与载体材料组合以 产生单一剂型的活性成分的量根据待治疗的受试者和特定给药方式而变化。能与载体材料 组合以产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的组分量。通常，以总共百分之 百计，这个量为约0. 001%至约99%活性成分，优选约0. 005%至约70%，最优选约0. 01% 至约30%。适于通过阴道给药的本发明制剂也包括阴道栓剂、卫生栓、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡 沫剂或喷雾剂，它们含有如本领域公知的适当的载体。用于本发明组合物的局部给药或透 皮给药的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。 活性化合物可在无菌条件下与药学上可接受的载体混合，需要时也可与任何防腐剂、缓冲 剂或抛射剂混合。本文所用的短语“肠胃外给药”是指不同于肠和局部给药的给药模式，通常是通过 注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮 下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。可用于本发明的药物组合物中的适当的水性或非水性载体的例子包括水、乙醇、 多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适当的混合物，植物油如橄榄油，和注射用有 机酯如油酸乙酯。例如通过应用包被材料如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的颗 粒大小，和通过应用表面活性剂，可维持适当的流动性。这些组合物也可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌程序或通过包含各种抗细菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等 来确保防止存在微生物。也可能需要在组合物中包含等渗剂，例如，糖、氯化钠等。另外，通 过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射型药物的延长的吸收。当本发明化合物作为药物给予人和动物时，可单独给予和作为药用组合物给予， 该组合物中包含例如0. 001-90% (更优选0. 005-70%，如0. 01-30% )的活性成分及与其 组合的药学上可接受的载体。不管所选择的给药方式如何，本发明的化合物(可以适当的水合形式使用)和/ 或本发明的药用组合物可通过本领域技术人员公知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能变化，以获得可有效实现对特 定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量 水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的 活性、给药途径、给药时间、所应用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与应用的特 定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状 况、总体健康情况和病史、以及医学领域中公知的其它因素。在本领域具有普通技术水平的 医师或兽医可容易地确定和开出所需的药用组合物的有效量。例如，医师或兽医开始开出 的药物组合物中使用的本发明化合物的剂量水平低于为达到希望的治疗效果所需要的剂 量水平，然后逐渐增加剂量，直至达到所希望的效果。通常，合适的本发明组合物的日剂量 为有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这个有效剂量通常取决于上述因素。优选 给药方式为静脉、肌内、腹膜内或皮下给药，优选在最接近目标部位处给药。如需要，治疗性 组合物的有效日剂量可以两个、三个、四个、五个、六个或更多分剂量的形式在一天中以合 适的间隔分开给药，且任选地以单位剂型给药。虽然本发明化合物有可能单独给药，但优选 将所述化合物作为药用制剂(组合物)来给药。治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方 案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No. 5，399，163、 5，383，851,5, 312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556 中公开的装置。可 用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括美国专利No. 4，487，603，该专利公开了用 于以受控速率分散药物的可植入式微量输注泵；美国专利No. 4，486，194，该专利公开了用 于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No. 4，447，233，该专利公开了用于以精确的输注速 率递送药物的医用输注泵；美国专利No. 4，447，224，该专利公开了用于连续递送药物的变 流可植入式输注装置；美国专利No. 4，439，196，该专利公开了具有多腔室的渗透药物递送 系统和美国专利No. 4，475，196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。本领域技术人员 知道许多其他这样的植入物、递送系统和模块。在某些实施方案中，可以配制本发明的抗体以确保在体内的正确分布。例如， 血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物 能够穿过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法， 参见，例如，美国专利4，522，811 ；5，374，548 ；和5，399，331。脂质体可以包含可被选 择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个部分，从而增强定向药物递送(参见， 例如，V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29 685)。定向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利5，416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 1038)；抗体(P. G. Bloeman 等(1995) FEBS Lett. 357 140 ；M. Owais 等(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39 180)；表面活性剂蛋白 A 受体(Briscoe等(1995) Am. J. Physiol. 1233 134)，其不同种类可包括本发明的制剂 以及本发明的分子组分；pl20 (Schreier等(1994) J. Biol. Chem. 269 9090)；也参见 K. Keinanen ；M. L. Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346 123 J. J. Killion ；I. J. Fidler (1994) Immunomethods4 :273。在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗性化合物配制于脂质体 中；在更优选的实施方案中，所述脂质体包括定向部分。在最优选的实施方案中，脂质体中 的治疗性化合物通过团注递送到最接近肿瘤或感染的部位。组合物的流动性必须达到易于 注射的程度。它在生产和储藏的条件下必须稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污 染作用。化合物抑制癌症的能力可以在预测对于人肿瘤的有效性的动物模型系统中评价。 或者，组合物的这种特性可以通过利用熟练技术人员已知的分析检查该化合物抑制如体外 抑制的能力进行评价。治疗有效量的治疗性化合物可以减少肿瘤大小，或者以其它方式缓 解受试者的症状。本领域普通技术人员能够根据以下因素来确定所述化合物的量，如受试 者的体型、受试者症状的严重程度以及选择的特定组合物或给药途径。也可以根据本领域公知的方法评价抗体增强抗原呈递或诱导针对多种靶细胞或 病原体的细胞毒性T细胞(CTL)应答的能力。组合物必须是无菌的，其流动性必须达到能使组合物可通过注射器递药的程度。 除水之外，载体可为等渗缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等) 及其合适的混合物。例如，通过使用如卵磷脂的包衣，在分散液情况下通过维持需要的颗粒 大小，和通过使用表面活性剂，能够维持适当的流动性。在许多情况下，优选地在组合物中 包括等渗剂，如糖类、多元醇如甘露糖醇或山梨糖醇，以及氯化钠。可通过在组合物中加入 能延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝或明胶，来实现注射用组合物的长期吸收。当活性化合物如上所述被适当地保护时，它可经口给药，例如与惰性稀释剂或可 同化的食用载体一起给药。IV.本发明的应用和方法在一个实施方案中，本发明的抗体、双特异性分子和分子偶联物可以用来治疗和/ 或预防(例如，针对其进行免疫)多种疾病和病症。可以用本发明的抗体治疗的一种主要的疾病适应症是癌症。包括但不限于结肠 癌、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、肥大细胞瘤、乳房腺 癌、白血病或类风湿性成纤维细胞瘤(fibroblastsoma)。另一种主要的疾病适应症是传 染性疾病，包括但不限于HIV、肝炎(例如甲、乙、丙型肝炎)、流感、疱疹、贾第虫病、疟疾、 利什曼原虫病、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。另一种主要的疾病适应症包括自身免疫病。为了用于治疗，本发明的疫苗偶联物可以单独或与免疫刺激剂一起直接施用于受 试者(即，在体内)。在一个方面，免疫刺激剂与偶联物连接。或者，偶联物可以间接施用于 受试者，这是通过首先使偶联物与APC如树突细胞接触(例如，通过培养或温育)，然后将该 细胞施用给受试者(即来自体内地)。偶联物向APC的接触和递送，使得它们在施用前被APC加工和呈递，也被称为抗原或细胞“加载”。向APC加载抗原的技术在本领域中公知，包 括，例如，Gunzer 和 Grabbe，Crit Rev Immunol 21(1-3) 133-45 (2001)，和 Steinman，Exp Hemato124(8) :859_62(1996)。在所有情况中，疫苗偶联物和免疫刺激剂以有效量施用，以发挥它们的理想的治 疗效果。术语"有效量"是指实现希望的生物学效应所所需的或足以实现该效应的量。例 如，有效量可以是消除肿瘤、癌症或细菌、病毒或真菌感染所必需的量。用于任何特定用途 的有效量可以根据如下因素而变化，如所治疗的疾病或病症、施用的具体偶联物、受试者的 大小、或疾病或病症的严重程度。本领域普通技术人员可以根据经验确定特定多特异性分 子的有效量，而无需过多的实验。疫苗偶联物的优选施用途径包括，例如，注射(例如，皮下、静脉内、肠胃外、腹膜 内、鞘内)。注射可以是团注或连续输注。其它施用途径包括口服。本发明的疫苗偶联物也可以与佐剂和其它治疗剂共施用。应当理解，本文使用的 术语“共施用”包括本发明的抗体和偶联物与佐剂和其它药物同时、分开或顺序施用的任何 一种或全部，包括作为给药方案的一部分施用。偶联物一般配制在单独的或与这些药物组 合的药学可接受的载体中。这些载体的例子包括溶液、溶剂、分散介质、延迟剂、乳剂等。这 些介质用于药物活性物质的应用是本领域公知的。适用于分子的任何其它常规载体落入本 发明的范围内。适合与疫苗偶联物共施用的药物包括其它抗体、细胞毒素和/或药物。在一个实 施方案中，该药物是已知有助于或诱导免疫应答的抗CTLA-4抗体。在另一个实施方案中， 该药物是化疗剂。疫苗偶联物也可以与放射一起施用。适于在肿瘤治疗中与本发明的抗体和偶联物共施用的化疗剂包括，例如紫杉醇、 细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长 春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、l-脱氢 睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同 系物。其它治疗剂包括，例如，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿 糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、噻替派苯丁酸氮芥 (thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消 安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合钼(II) (DDP)顺钼)，蒽环类抗 生素(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素类(例如，放线菌素D(以 前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新 碱和长春碱)和替莫唑胺。可消除或抑制例如免疫细胞(例如调节性T细胞、NKT细胞、巨噬细胞、骨髓来源 的抑制细胞、未成熟的或抑制性树突细胞)或在肿瘤局部微环境中由肿瘤或宿主细胞产生 的抑制性因子(例如，16 3、口引哚胺2，3双加氧酶-100)的免疫抑制活性的药物，也可以与 本发明的抗体和偶联物一起施用。这些药物包括抗体和小分子药物，如IDO抑制剂，如1甲 基色氨酸或衍生物。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以用来治疗患有自身免疫病、免疫系统疾 病或炎性疾病的患者，该疾病例如是以与树突细胞的免疫调节有关的异常或不希望的免疫 活性为特征的疾病。可能受益于本发明的抗树突细胞治疗的自身免疫、免疫系统和炎性疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、免疫介导的或1型糖尿病、重症肌无力、恶性贫血、阿 狄森病、干燥综合征、银屑病、红斑狼疮、炎性肠病如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、硬皮病/ 雷诺氏综合征、莱特尔综合征和自身免疫性甲状腺病如桥本甲状腺炎和格雷夫斯病。例如， 患有自身免疫病的患者可以受益于树突细胞介导的自身抗原呈递的抑制。本发明的抗体也可以用于预防和治疗所有形式的变态反应和变应性疾病，包括但 不限于眼科变应性疾病，包括变应性结膜炎、春季结膜炎、春季角结膜炎和巨乳头状结膜 炎；鼻变应性疾病，包括变应性鼻炎和窦炎；耳变应性疾病，包括咽鼓管搔痒，上呼吸道和 下呼吸道的变应性疾病，包括内源性和外源性哮喘；皮肤的变应性疾病，包括皮炎、湿疹和 风疹；和胃肠道的变应性疾病。与本发明的抗体共施用的用于治疗这类免疫疾病的合适的药物包括，例如，免疫 抑制剂，如雷帕霉素、环孢菌素和Π(506 ；抗TNFa剂，如依那西普、阿达木单抗和英夫利昔 单抗；和留类。具体的天然和合成留类的例子包括，例如醛固酮、倍氯米松、倍他米松、 布地奈德、氯泼尼醇、可的松、可的伐唑、脱氧皮质酮、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟可 龙(difluorocortolone)、氟氯缩松、氟米松、氟尼缩松、肤轻松、醋酸氟轻松、氟考丁酯、氟 可的松、氟可龙(fluorocortolone)、氟米龙、氟氢缩松、氟替卡松、氯氟舒松、氢化可的松、 icomethasone、甲泼尼松、甲泼尼龙、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、替可的松和曲安西龙。可用本发明的人抗DEC-205抗体治疗的其它疾病的实例包括移植排斥和移植物 抗宿主病。移棺排斥近年来，在用于移植组织和器官，如皮肤、肾脏、肝脏、心脏、肺、脾脏和骨髓的手术 技术的效果方面有相当大的进步。还没有解决的主要问题也许是缺少令人满意的用于在移 植接受者中诱导对所移植的同种异体移植物或器官的免疫耐受性的药物。当同种异体细胞 或器官移植到宿主(即供体和受体为同物种的不同个体)时，宿主免疫细胞很可能发起针 对移植物中的外来抗原的免疫应答(宿主抗移植物病)，导致移植的组织被破坏。CD8+细 胞、CD4+细胞和单核细胞都参与对移植的组织的排斥。本发明的抗体可用于抑制受体中树 突细胞介导的、同种抗原诱导的免疫应答，从而防止这些细胞参与对移植的组织或器官的 破坏。移植物抗宿主病本发明的抗体的一个相关用途是调节参与“移植物抗宿主病”(GVHD)的免疫应答。 GVHD是一种潜在的致命疾病，在具有免疫能力的细胞被转移到同种异体接受者时会发生该 疾病。在这种情况下，供体中具有免疫能力的细胞会攻击接受者中的组织。皮肤、内脏上皮 和肝脏中的组织是常见的攻击目标，它们在GVHD发病过程中会被破坏。当移植免疫组织 时，如骨髓移植时，该疾病会造成特别严重的问题；但在其它情况下(包括心脏和肝脏移植 物情况)也报道了较不严重的GVHD。本发明治疗剂可用于抑制宿主抗原呈递细胞如树突细 胞的活性。本发明进一步用以下实施例进行说明，这些实施例不能理解为是对本发明的进一 步限制。在本申请中引用的序列表、附图和所有引用文献、专利和出版的专利申请的内容通 过引用专门结合到本文中。实施例实施例1DEC-205特异性人单克隆抗体(HuMab)的 产生通过用可溶性人DEC-205抗原免疫HuMAb 转基因小鼠("HuMab”是Medarex, Inc.，Princeton, New Jersey 的商标)HC2/KCo7 株产生人抗 DEC-205 单克隆抗体。HC2/ KCo7HuMAb小鼠如美国专利5，770，429和5，545，806所述产生，其全部公开内容通过参考并 入本文。抗原和免疫抗原是包含与抗体Fc域融合的DEC-205胞外域(包含全部10个 凝集素结合域)的可溶性融合蛋白。人DEC-205的核酸和氨基酸序列在PCT专利公布WO 96023882 (Steinman)中提供。抗原与完全弗氏佐剂(Sigma)混合用于第一次免疫。之后， 抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma)混合。另外的小鼠用RIBI MPL+TDM佐剂系统(Sigma)中 的可溶性DEC-205蛋白免疫。溶于PBS的5_25微克可溶性重组DEC-205抗原或PBS中的 为了表面表达人DEC-205而转染的5x IO6CHO细胞与佐剂1 1混合。每14天向小鼠的腹 腔注射100微升制备的抗原。融合前3-4天给产生抗DEC-205滴度的动物静脉注射10微 克可溶性重组DEC-205抗原。取小鼠脾脏，分离的脾细胞用于杂交瘤制备。杂交瘤制备P3x63Ag8.653鼠骨髓瘤细胞系(ATCC CRL 1580)用于融合。含有 10% FBS的RPMI 1640 (Invitrogen)用于培养该骨髓瘤细胞。向杂交瘤生长培养基中添加 另外的培养基补充物，包括3% Origen-杂交瘤克隆因子(Igen)，10% FBS (Sigma)，L-谷 氨酰胺(Gibco)O. 庆大霉素(Gibco)，2-巯基乙醇(Gibco)，HAT (Sigma ； l.Ox IO4M 次黄 嘌呤，4. Ox 10_7M氨基蝶呤，1. 6x 10_5M胸苷)或HT (Sigma ；1. Ox 10_4M次黄嘌呤，1. 6x 10_5M 胸苷)培养基。脾细胞与653骨髓瘤细胞以6 1的比例混合，并离心沉淀。逐滴添加聚乙二醇， 同时小心混合以促进融合。让杂交瘤生长1-2周，直到形成可见的集落。收集上清液，并利 用人κ链特异性捕获和人Fc特异性检测通过ELISA用于初始筛选人IgG。然后通过流式 细胞术或使用DEC-205ELISA测定IgG阳性上清液的DEC-205特异性。亚克隆并扩增产生特异性HuMab IgG的杂交瘤。然后按照标准条件通过蛋白A柱 层析纯化产生的HuMab，这导致分离出许多特别感兴趣的抗体。实施例2通过表面等离子体共振(SPR)测定HuMab的亲和力和速率常数使用Biacore 2000SPR 仪器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)，按照厂商指导，通 过Biacore 表面等离子体共振(SPR)分析检查来自实施例1的各种人抗DEC-205抗体的 结合亲和力和结合动力学。使用Biacore提供的胺偶联试剂盒，按照厂商指导(BIAcoreProduct No.BR-1000-50，包括偶联试剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基_3_ (3-二甲基氨基丙 基)碳二亚胺盐酸盐(EDC))，使用标准胺偶联化学，将纯化的重组人DEC-205融合(或对 照)蛋白共价连接到Biacore CM5传感器芯片上(共价连接到金表面上的羧甲基化的葡 聚糖；Biacore Product No. BR-1000-14)。将低水平的配体固定，以限制分析物的质量转运 对动力学参数的任何影响，使得观测的Rmax为200RU等级。通过使抗体以1. 25-200nM的浓度和35 μ 1/分钟的低流速流经在HBS-NP缓冲液(HBS-N 缓冲液，Biacore Product No. BR-1003-69 :4_ (2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)0. 24%,氯化钠0. 88%，足量的水，过滤/除气并且预平衡至室温，使用1 2000稀 释的表面活性剂P20)中的传感器芯片来检测结合。抗原-抗体缔合和解离动力学在每种 情况下进行大约300至600秒。在每种情况下使用无关蛋白质进行相应的对照，用于“背景”减除。以35μ 1/min 单次注射18mM NaOH 17秒用作整个研究中的再生条件。在每种情况下使用Biacore’ s动力学向导从在HBS-NP运行缓冲液中稀释的分析 物浓度系列得出动力学参数。使用Biacore 动力学向导软件(Biacore AB)按照厂商指导 将缔合和解离曲线与1 ILangmuir结合模型拟合。测定的亲和力和动力学参数(背景已 减除)在以下表1中显示。对于每种抗体，所示的数字是两个单独实验系列的平均值，在每 种情况下使用分别制备的传感器芯片(其中ka =结合的速率常数，kd =解离的速率常数， Kd =解离平衡常数(亲和力的量度)，Ka =结合平衡常数，Rmax =最大SPR响应信号)。表 1 实施例3HuMab与表达人DEC-205的细胞的结合 抗DEC-205HuMab与在其表面上表达人DEC-205的CHO-S细胞上的DEC-205结合 的能力如下所述通过流式细胞术进行研究。 检测抗体与在其表面上表达人DEC-205的CHO-S细胞的结合。蛋白A纯化的 HuMab 3D6-2F4、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9、3C7-3A3、5D12-5G1、1G6-1G6 禾口 3A4-1C10与表达人DEC-205的CHO-S细胞以及CHO-S对照细胞在4°C温育。所有抗体都以 饱和浓度使用。1小时后，用含有0. BSA和0.05% NaN3(PBA)的PBS洗涤细胞，并通过 细胞与PE标记的山羊抗人IgG Fc特异性探针在4°C温育来检测结合的抗体。用PBA从细胞上洗去过量的探针，按照厂商说明通过使用LSR 仪器(BD Biosciences, NJ, USA)的分 析确定细胞结合的荧光。结果示于图1中。如图1所示，证明HuMab高水平结合表达人DEC-205的CHO-S细胞。这些数据证 明与对照细胞相比，这些抗体有效地和特异性地结合在活CHO-S细胞上表达的人DEC-205。实施例4 HuMab与人树突细胞的结合人外周血单个核细胞(PBMC)通过对Leukopak血小板血浆分离制品(platelet apheresis preparation)进行密度梯度离心而获得。单核细胞通过粘附到组织培养瓶上 2小时分离，然后通过在巨噬细胞无血清培养基(Gibco)中与2ng/ml GM-CSF和lOng/ml IL-4温育5-7天分化为树突细胞。抗DEC_205HuMab结合如上制备的人树突细胞上的DEC-205的能力如下所述通过 流式细胞术进行研究。蛋白A 纯化的 HuMab 3D6-2F2、3D6-4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5_2A9、 3C7-3A3.5D12-5G1UG6-1G6和3A4-1C10和同种型对照(人IgG)与人树突细胞在4°C温 育。所有抗体都以饱和浓度使用。1小时后，用含有0. 1% BSA和0. 05% NaN3(PBA)的PBS 洗涤细胞，通过细胞与PE标记的山羊抗人IgG Fc特异性探针在4°C温育来检测结合的抗 体。用PBA从细胞上洗去过量的探针，按照厂商说明通过使用LSR 仪器(BD Biosciences, NJ, USA)的分析来确定细胞结合的荧光。结果示于图2，结果表明与同种型对照相比，证明 HuMab与人树突细胞有高水平结合。实施例5测定HuMAb的DEC-205结合特征的ELISA分析微量滴定板用PBS中的可溶性DEC-205/Fc融合蛋白包被，然后用PBS中的5%牛 血清白蛋白封闭。以饱和浓度添加蛋白A纯化的HuMab和同种型对照，并于37°C温育。用 PBS/Tween洗板，然后于37°C与偶联有碱性磷酸酶的山羊抗-人IgG Fc特异性多克隆试剂 温育。洗涤后，平板用PNPP底物(lmg/ml)显色，并使用微量滴定板读数器在OD 405-650 处分析。结果示于图3，结果表明与同种型对照相比，HuMab被证明有高水平的结合。实施例6抗体内化分析每等份5x IO5个人单核细胞衍生的树突细胞与人IgG(lmg/ml)温育，以阻断非 特异性结合。然后细胞与100μ g/ml溶于封闭缓冲液的FITC-偶联的抗-DeC-205HuMab 3G9-2D2在冰上温育30分钟用于结合，随后转移到37 °C放置0、10、30、60和120分析用于内 化。使用相同浓度的FITC-偶联的人IgGl作为对照。然后洗涤细胞，并用低聚甲醛固 定。洗涤固定的细胞，重悬浮于水中，并细胞离心到显微镜载玻片上。使用Zeiss LSM 510 Meta共焦显微镜获取图像。结果示于图4中，结果显示与对照相比，FITC-标记的HuMab被 证明有效地内化到树突细胞内。实施例7抗体测序如以上实施例1所述，来自产生特异性HuMab IgG的杂交瘤的HuMab通过蛋白A柱 层析法进行纯化，导致分离出8种特别感兴趣的抗体(“HuMab”)。HuMab 3D6_2F4、3D6_4C8、3G9-2D2、5A8-1F1、2D3-1F5-2A9 (VH 区)、3C7_3A3、1E6-3D10 (VH 区)和 5C3-2-3F6的 Vh 和 Vl 编码区使用来自相应杂交瘤的RNA进行确认。将RNA逆转录为cDNA，通过PCR扩增V编码 区，将PCR产物测序。以下是HuMab的V1^nt区的核酸和氨基酸序列(在氨基酸序列中， 互补决定区(CDR)以下划线标出)。3D6-2F4VH 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ;JH4) (SEQ ID NO 2)atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcatcttcag tatctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaa gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagctcctcactttgactactggggcca gggaaccctggtcaccgtctcctcagctagc3D6-2F4Vh氨基酸序列(SEQ ID NO :3)，包括信号肽MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSIYGMHWVRQAPGKGLEffVAV IffYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAYYYCARAPHFDYffGQGTLYTYS S3D6-2F4 Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO :4)，不包括信号肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSIYGMHWVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAPHFDYffGQGTLVTVSS3D6-2F4Vh CDRl(SEQ ID NO 5) :IYGMH3D6-2F4Vh CDR2(SEQ ID NO 6) :YIffYDGSNKYYADSVKG3D6-2F4Vh CDR3(SEQ ID NO 7) APHFDY3D6-2F4 Vl 核酸序列(VK1，基因座 L15 ;JK2) (SEQ ID NO 8)atgggatggagctgtatcatcctgttcctcgtggccacagcaaccggtgtccactccgacatccagatg acccagtctccatcctcactgtctgcatctgttggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtattag cagctggttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaa gtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaa gattttgcaacttattactgccaacagtataatagttacccgtacacttttggccaggggaccaagctggagatcaa acgtacg3D6-2F4Vl氨基酸序列(SEQ ID NO :9)，包括信号肽MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSL IYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIK 3D6-2F4Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 10)，不包括信号肽DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSffLAffYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIK3D6-2F4 Vl CDRl (SEQ ID NO: 11) RASQGI SSffLA3D6-2F4 Vl CDR2 (SEQ ID NO: 12) =MSSLQS3D6-2F4 Vl CDR3 (SEQ ID NO: 13) :QQYNSYPYT3D6-4C8VH 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ;JH4) (SEQ ID NO 14)atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcatcttcagtatctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaa gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagctcctcactttgactactggggcca gggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac3D6-4C8Vh氨基酸序列(SEQ ID NO : 15)，包括信号肽 MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSIYGMHWVRQAPGKGLEffVAV IffYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAPHFDYffGQGTLVTVSS3D6-4C8Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 16)，不包括信号肽 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSIYGMHWVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAPHFDYffGQGTLVTVSS3D6-4C8Vh CDRl (SEQ ID NO: 17) : IYGMH3D6-4C8 Vh CDR2 (SEQ ID NO: 18) :YIffYDGSNKYYADSVKG3D6-4C8 Vh CDR3 (SEQ ID NO: 19) APHFDY3D6-4C8VL 核酸序列(VK1，基因座 L4 ;JK4) (SEQ ID NO 20)atggacatgagggtccccgctcagctcctggggcttctgctgctctggctcccaggtgccagatgtgcc atccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtca gggcattagcagtgctttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctatgatgcctcca gtttggaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctg cagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttaccctctcactttcggcggagggaccaaggt ggagatcaaa3D6-4C8Vl氨基酸序列(SEQ ID NO :21)，包括信号肽MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLL IYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK3D6-4C8Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 22)，不包括信号肽AIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK3D6-4C8 Vl CDRl(SEQ ID NO 23) RASQGISSALA3D6-4C8 Vl CDR2(SEQ ID NO 24) :DASSLES3D6-4C8 Vl CDR3(SEQ ID NO 25) :QQFNSYPLT3G9-2D2，Vh 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ；D 未确定;JH4) (SEQ ID NO 26)atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcag taattatggcatgtactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaa gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatctctggggatggtactttgacta ttggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagc3G9-2D2，Vh氨基酸序列(SEQ ID NO 27)，包括信号肽MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMYffVRQAPGKGL EffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAYYYCARDLffGffYFDYffGQGTLYTVSSASTKGPSVFPLA3G9-2D2，Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 28)，不包括信号肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMYffVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLffGffYFDYffGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA3G9-2D2, Vh CDRl(SEQ ID NO 29) NYGMY3G9-2D2, Vh CDR2(SEQ ID NO 30) :YIffYDGSNKYYADSVKG3G9-2D2, Vh CDR3(SEQ ID NO 31) :DLffGffYFDY
3G9-2D2, Vl 核酸序列(VK3，基因座 L6 ;JK4) (SEQ ID NO 32)atgggatggagctgtatcatcctgttcctcgtggccacagcaaccggtgtccactccgaaattgtgttg acacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttag cagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggcca ctggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaa gattttgcagtttattactgtcagcagcgtcgcaactggccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaa acgtacg3G9-2D2，Vl氨基酸序列(SEQ ID NO 33)，包括信号肽MEAPAQLLFLLLLffLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIY DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRNVPLTFGGGTKVEIK3G9-2D2，Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 34)，不包括信号肽EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRNffPLTFGGGTKVEIK3G9-2D2, Vl CDRl(SEQ ID NO 35) :RASQSVSSYLA3G9-2D2, Vl CDR2(SEQ ID NO 36) :DASNRAT3G9-2D2, Vl CDR3(SEQ ID NO 37) QQRRNffPLT5A8-1F1, Vh 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ;JH2) (SEQ ID NO 38)atggagtttgggctgacctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcag tacctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggag gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagacttctactggtacttcgatctctg gggccgtggcaccctggtcactgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaagg5A8-1F1，Vh氨基酸序列(SEQ ID NO : 39)，包括信号肽MEFGLTffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHffVRQAPGKGLEffVA IIffYDGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDFYffYFDLffGRGTLVTVSSASTKGPSV FPLA5A8-1F1，Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 40)，不包括信号肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEffVAIIffYDGGNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDFYffYFDLffGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLA5A8-1F1, Vh CDRl(SEQ ID NO 41) TYGMH5A8-1F1, Vh CDR2 (SEQ ID NO 42) JIffYDGGNKYYADSVKG
5A8-1F1, Vh CDR3(SEQ ID NO 43) :DFYffYFDL5A8-1F1, Vl 核酸序列(VK3，基因座 L6 JKl) (SEQ ID NO 44)atggaagccccagctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggagaaattgtg ttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgt tagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacaggg ccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct gaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtaggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacga5A8-1F1，Vl氨基酸序列(SEQ ID NO 45)，包括信号肽MEAPAQLLFLLLLffLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIY DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRTFGQGTKVEIK5A8-1F1，Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 46)，不包括信号肽EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRTFGQGTKVEIK5A8-1F1, Vl CDRl(SEQ ID NO 47) :RASQSVSSYLA5A8-1F1, Vl CDR2(SEQ ID NO 48) :DASNRAT5A8-1F1, Vl CDR3(SEQ ID NO 49) QQRRT3C7-3A3, Vh 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ;JH2) (SEQ ID NO 50)atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcag tagctataacatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcatttatatggtatgatggaa gtaataaatactatggagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaaaaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaagagctggggatcgggtggtactt cgatctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac3C7-3A3，Vh氨基酸序列(SEQ ID NO :51)，包括信号肽MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYNMHffVRQAPGKGLEffVA FIWYDGSNKYY⑶SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREELGIGffYFDLffGRGTLVTVSSASTKG PSVFPLA3C7-3A3，Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 52)，不包括信号肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYNMHWVRQAPGKGLEffVAFIffYDGSNKYYGDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREELGIGffYFDLffGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLA3C7-3A3, Vh CDRl(SEQ ID NO 53) SYNMH3C7-3A3, Vh CDR2(SEQ ID NO 54) :FIWYDGSNKYY⑶SVKG3C7-3A3, Vh CDR3(SEQ ID NO 55) :EELGIGffYFDL3C7-3A3, Vl 核酸序列(VK3，基因座 L6 JKl) (SEQ ID NO 56)atggaagccccagctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggagaaattgtg ttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgt tagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacaggg ccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct gaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtaggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgc3C7-3A3，Vl氨基酸序列(SEQ ID NO 57)，包括信号肽
MEAPAQLLFLLLLffLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIY DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRTFGQGTKVEIK3C7-3A3，Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 58)，不包括信号肽EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAffYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRTFGQGTKVEIK3C7-3A3, Vl CDRl(SEQ ID NO 59) :RASQSVSSYLA3C7-3A3, Vl CDR2(SEQ ID NO 60) :DASNRAT3C7-3A3, Vl CDR3(SEQ ID NO 61) QQRRT2D3-1F5-2A9，Vh 核酸序列(VH3，基因座 0rph_C16 ; JH3) (SEQ ID NO 62)atggagtttgtgctgagctgggttctccttgttgctatattaaaaggtgtccagtgtgaggttcagctg gtgcagtctgggggaggcttggtacatcctggggggtccctgagactctcctgtgcaggctctggattcaccttcag taactatgctatgcactgggttcgccaggctccaggaaaaggtctggagtgggtatcaactattggtactggtggtg gcacaccctatgcagactccgtgaagggccgcttcaccatctccagagacaatgccaagaactccttgtatcttcaa atgaacagcctgagagccgaggacatggctgtgtattactgtgcattaagtgcttttgatgtctggggccaagggac aatggtcaccgtctcttcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac2D3-1F5-2A9，Vh 氨基酸序列(SEQ ID NO 63)，包括信号肽MEFVLSffVLLVAILKGVQCEVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSNYAMHWVRQAPGKGLEffVST IGTGGGTPYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCALSAFDVffGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLA2D3-1F5-2A9，Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 64)，不包括信号肽EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSNYAMHWVRQAPGKGLEffVSTIGTGGGTPYADSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCALSAFDVffGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLA2D3-1F5-2A9, Vh CDRl(SEQ ID NO 65) NYAMH2D3-1F5-2A9, Vh CDR2(SEQ ID NO 66) :TIGTGGGTPYADSVKG2D3-1F5-2A9, Vh CDR3(SEQ ID NO 67) SAFDV1E6-3D10Vh 核酸序列(VH3，基因座 0rph_HC16 ;JH4)(SEQ ID NO 68)Atggagtttgtgctgagctgggttttccttgttgctatattaaaaggtgtccagtgtgaggttcagct ggtgcagtctgggggaggcttggtacatcctggggggtccctgagactctcctgtgcaggctctggattcaccttc agtagctatgctatgcactgggttcgccaggctccaggaaaaggtctggagtgggtatcagctattggtactggt ggttacacatactatgtagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaagtccttgtat cttcaaatgaacagcctgagagccgaggacatggctgtgtattactgtgcaagagagccgttttacgatattttg actggttattccccatactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggc ccatcggtcttccccctggcac1E6-3D10Vh氨基酸序列(SEQ ID NO :69)，包括信号肽MEFVLSffVFLVAILKGVQCEVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEffVSA IGTGGYTYYVDSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDMAVYYCAREPFYDILTGYSPYFDYffGQGTLVTVSS1E6-3D10Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 70)，不包括信号肽
EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEffVSAIGTGGYTYYVDSVKGRFTI SRDNAKKSLYLQMNSLRAEDMAVYYCAREPFYDILTGYSPYFDYffGQGTLVTVSS1E6-3D10 Vh CDRl (SEQ ID NO 71) SYAMH1E6-3D10 Vh CDR2(SEQ ID NO 72) :AIGTGGYTYYYDSVKG1E6-3D10 Vh CDR3(SEQ ID NO 73) :EPFYDILTGYSPYFDY5C3-2-3F6VH 核酸序列(VH3，基因座 3-33 ;JH2) (SEQ ID NO 74)Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcag tagctataacatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaa gtaataaatactatggagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaagagctggggatcgggtggtactt cgatctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac5C3-2-3F6Vh 氨基酸序列(SEQ ID NO :75)，包括信号肽MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYNMHWVRQAPGKGLEffVAV IWYDGSNKYY⑶SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREELGIGWYFDLWGRGTLVTVSS5C3-2-3F6Vh “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO 76)，不包括信号肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYNMHWVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYGDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREELGIGffYFDLffGRGTLVTVSS5C3-2-3F6 Vh CDRl(SEQ ID NO 77) SYNMH5C3-2-3F6 Vh CDR2(SEQ ID NO 78) :VIWYDGSNKYY⑶SVKG5C3-2-3F6 Vh CDR3(SEQ ID NO 79) :EELGIGffYFDL5C3-2-3F6 VK Vl 核酸序列(VK1，基因座 L18 ;JK5) (SEQ IDNO 80)Atggacatgagggtccccgctcagctcctggggcttctgctgctctggctcccaggtgccagatgtgc catccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagt cagggcattagcagtgctttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctatgatgcc tccagtttggaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagc agcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttaccctcacttcggccaagggaca cgactggagattaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct ggaactgcctctgttgtgtgcctgcaagggc5C3-2-3F6VK Vl 氨基酸序列(SEQ ID NO :81)，包括信号肽MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLL IYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPHFGQGTRLEIK5C3-2-3F6VK Vl “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO :82)，不包括信号肽 AIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPHFGQGTRLEIK5C3-2-3F6 Vl CDRl(SEQ ID NO 83) RASQGISSALA5C3-2-3F6 Vl CDR2(SEQ ID NO 84) :DASSLES5C3-2-3F6 Vl CDR3(SEQ ID NO 85) :QQFNSYPH5D12-5G1 VH 核酸序歹lj (VH3，基因座 3-33 ;JH2) (SEQ ID NO 86)
Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctg gtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcag tagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaa gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctg caaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggcccccctcggtacttcgatctctg gggccgtggcaccctggtcactgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac5D12-5G1 VH氨 基酸序列(SEQ ID NO :87)，包括信号肽MEFGLSffVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEffVAV IffYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPPRYFDLffGRGTLVTVSS5D12-5G1VH “成熟”氨基酸序列(SEQ ID NO :88)，不包括信号肽QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPPRYFDLWGRGTLVTVSS5D12-5G1 VH CDRl(SEQ ID NO 89) SYGMH5D12-5G1 VH CDR2(SEQ ID NO 90) :YIffYDGSNKYYADSVKG5D12-5G1 VH CDR3(SEQ ID NO 91) :GPPRYFDL为了参考，提出的相应种系序列(没有偏见地指定)的氨基酸序列如下种系L6(SEQ ID NO 92)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP种系L4(SEQ ID NO 93)AIQLTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYP种系L15(SEQ ID NO 94)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRARQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYP系νΞ3-33 (SEQ ID NO 95)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR系Orph-C 16 (SEQ ID NO 96)EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSAIGTGGGTYYADSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCAR八和Vh序列相对于提出的相应种系序列的序列比对显示于图5中，只是用于说明 的目的。实施例83G9- β hCG APC-靶向疫苗偶联物DEC-205靶向疫苗偶联物是通过将β hCG抗原连接到来自上述实施例7的HuMab 3G9-2D2(也确定与猕猴DEC-205交叉反应)上产生的。连接是通过基因融合共价连接抗原 与抗体的重链而实现的。产生含有新霉素和二氢叶酸还原酶基因的质粒，其含有与抗体3G9-2D2重链的CH3结构域和3G9-2D2轻链融合的β hCG编码序列。使用标准方案(Qiagen Inc, Valencia, CA)，用得到的质粒构建体转化CHO细胞。在含有抗生素G418的培养基中选择被转染的 细胞。选择后，通过有限稀释克隆细胞，并用稳定的克隆系产生细胞库用于进一步研究。 为了证实3G9-i3hCG构建体的表达，在还原和非还原条件下在SDS-PAGE上进行蛋白质的 Western印迹分析。观察到该融合蛋白具有预期的分子量并且正确装配(即，同时含有重 链融合和轻链)。具体地，使用变性条件通过SDS-PAGE分析疫苗偶联物和单独的抗体，并 且通过Western印迹分析进行检测。然后使用山羊抗人IgG、使用β hCG C-末端肽特异性 mAb (US Biologicals)分别探查该印迹。结果证实，根据融合产物的适当大小和组成证明， 被转化的CHO细胞特异性表达3G9- β hCG疫苗偶联物。实施例9使用3G9_i3 hCG APC-靶向疫苗偶联物的抗原特异性活性能够呈递抗原的细胞是在来源上是人细胞，并且在外周血单个核细胞(PBMC)、单 核细胞(THP-I)、B类淋巴母细胞(C 1R. A2，1518B-LCL)和单核细胞衍生的DC之间不同。 通过流式细胞术评估，所有细胞的细胞表面DEC-205表达都是阳性的。将载体pk :3G9_hCGi3转染入CHO细胞。使用G418选择稳定的克隆，随后亚克隆。 在上清液中收集细胞产生的融合蛋白(3G9- β hCG疫苗偶联物；实施例8)，并在蛋白A柱上 纯化。从正常健康供体的Ieukopack获得T细胞。通过每周2_3次用3G9_hCG β所针对 的和对于⑶8+和⑶4+Τ细胞富集的自体DC刺激，在体外产生抗原特异性T细胞，之后通过 GrB或IFN γ ELISpot分析(MabTech)用多种APC (如上所述)检测抗原特异性活性。每3-4 天添加细胞因子IL-7和IL-2，以保持效应物的传递和活性。在低剂量IL-2的存在下使用 Miltenyi-MACS T细胞扩增试剂盒扩增抗原特异性T细胞10-12天。利用⑶40L(Alexis Biochemicals)诱导DC的成熟。如图9A所示，在DC和单核细胞(THP-I)以及B类淋巴母 细胞中中获得CD8+T细胞应答(图9B)。因此，抗原通过DEC-205受体向B细胞的靶向导致 MHC-I类限制的T细胞的刺激。等同方案本领域技术人员只使用常规实验方法，就可确认或能够确定本文所述的本发明特 定实施方案的许多等同方案。这样的等同方案包括在以下权利要求书中。
权利要求
一种分离的人单克隆抗体，其中该抗体结合人树突和上皮细胞205受体(DEC-205)并且显示至少一种以下性质(a)根据表面等离子体共振测定，以至少108M-1的亲和常数结合人DEC-205；(b)在结合表达DEC-205的人树突细胞后内化；(c)产生或增强对抗原的人CD4+T细胞应答；(d)产生或增强对抗原的人CTL或NKT应答；(e)定位于树突细胞的抗原加工区室；或(f)诱导周围CD8+T细胞耐受性。
2.权利要求1的抗体，其中，所述人T细胞应答由MHCI类或II类途径之一或两者介导。
3.一种分离的人单克隆抗体，其结合位于人DEC-205胞外域上的表位。
4.一种分离的单克隆抗体，其中该抗体结合人DEC-205并且包含重链可变区，该重链 可变区(a)利用人种系Vh 3-33基因，并且(b)包含SEQ ID NO :28、4、16、40、52、76和88的 任一个中相比SEQID NO 95的至少一个氨基酸置换。
5.一种分离的单克隆抗体，其中该抗体结合人DEC-205并且包含重链可变区，该重链 可变区(a)利用人种系0rph-C16基因，并且(b)包含SEQ ID NO :64和70的任一个中相比 SEQ ID NO 96的至少一个氨基酸置换。
6.权利要求4或5的抗体，其中该抗体进一步包含轻链可变区，该轻链可变区选自以下 区域，该区域(a)利用人种系VK3-L6基因并且包含SEQ ID NO :34、46、58的任一个中相对 于SEQ ID NO :92的至少一个氨基酸置换；(b)利用人种系VK1-L4基因并且包含SEQ IDNO 22或82中相对于SEQ ID NO 93的至少一个氨基酸置换；和(c)利用人种系VK1-L15基因 并且包含SEQ ID NO 10中相比SEQ IDNO 94的至少一个氨基酸置换。
7.一种分离的单克隆抗体，其中该抗体结合人DEC-205并且包含重链可变区，该重链 可变区⑴利用人种系Vh 3-33基因，并且包含SEQ ID NO :28、4、16、40、52、76和88的任一个 中相比SEQ ID NO 95的至少一个氨基酸置换；或(ii)利用人种系Orph-C 16基因，并且包含SEQ ID NO 64和70的任一个中相比SEQ ID NO 96的至少一个氨基酸置换；并且其中所述抗体进一步包含轻链可变区，该轻链可变区(a)利用人种系VK3-L6基因并且包含SEQID NO :34、46、58的任一个中相比SEQ ID NO 92的至少一个氨基酸置换；(b)利用人种系VK1-L4基因并且包含SEQID NO 22或82中相比SEQ ID NO 93的至 少一个氨基酸置换；或(c)利用人种系VK1-L15基因并且包含SEQID NO: 10中相比SEQ ID NO :94的至少一 个氨基酸置换。
8.一种分离的单克隆抗体，其中所述抗体结合人DEC-205并且包含选自SEQ ID NO 28、4、16、40、52、64、70、76或88及其保守序列修饰的重链可变区；和选自SEQ ID NO :34、 10、22、46、58或82及其保守序列修饰的轻链可变区。
9.一种结合人DEC-205的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重链可变区；和 包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的轻链可变区，其中重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO :31、7、19、43、55、67、73、79、91及其保守序 列修饰的氨基酸序列。
10.权利要求9的抗体，其中所述轻链可变区⑶R3序列包含选自SEQID N0:37、13、 25、49、61、85及其保守序列修饰的氨基酸序列。
11.权利要求10的抗体，其中所述重链可变区⑶R2序列包含选自SEQID NO :30、6、 18、42、54、66、72、78、90及其保守序列修饰的氨基酸序列；且所述轻链可变区CDR2序列包 含选自SEQ IDNO :36、12、24、48、60、84及其保守序列修饰的氨基酸序列。
12.权利要求11的抗体，其中所述重链可变区⑶Rl序列包含选自SEQID NO :29、5、 17、41、53、65、71、77、89及其保守序列修饰的氨基酸序列；且所述轻链可变区⑶Rl序列选 自SEQ ID NO :35、11、23、47、59、83及其保守序列修饰。
13.权利要求9-12中任一项的抗体，其中所述保守序列修饰是保守氨基酸置换。
14.一种分离的单克隆抗体，其结合人DEC-205并且包含选自下组的重链和轻链可变 区 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列(i)包含SEQID NO 29的重链可变区CDRl ； 包含SEQ ID NO 30的重链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 31的重链可变区⑶R3 ； 包含SEQ ID NO 35的轻链可变区⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 36的轻链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 37的轻链可变区⑶R3 ； 或其保守序列修饰；(ii)包含SEQID NO 17的重链可变区CDRl ； 包含SEQ ID NO 18的重链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 19的重链可变区⑶R3 ； 包含SEQ ID NO 23的轻链可变区⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 24的轻链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 25的轻链可变区⑶R3 ； 或其保守序列修饰；(iii)包含SEQID NO 5的重链可变区CDRl ； 包含SEQ ID NO 6的重链可变区CDR2 ； 包含SEQ ID NO 7的重链可变区CDR3 ； 包含SEQ ID NO 11的轻链可变区⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 12的轻链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 13的轻链可变区⑶R3 ；其保守序列修饰；(iv)包含SEQID NO 41的重链可变区CDRl ； 包含SEQ ID NO 42的重链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 43的重链可变区⑶R3 ；3包含SEQ ID NO 47的轻链可变区⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 48的轻链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 49的轻链可变区⑶R3 ； 或其保守序列修饰；(ν)包含SEQ ID NO 53的重链可变区CDRl ； 包含SEQ ID NO 54的重链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 55的重链可变区⑶R3 ； 包含SEQ ID NO 59的轻链可变区⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 60的轻链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 61的轻链可变区⑶R3 ； 或其保守序列修饰；和(viii)包含SEQ ID NO 77的重链可变区CDRl ； 包含SEQ ID NO 78的重链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 79的重链可变区⑶R3 ； 包含SEQ ID NO 83的轻链可变区⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 84的轻链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 85的轻链可变区⑶R3 ； 或其保守序列修饰。
15.一种分离的单克隆抗体，其结合人DEC-205并且包含 包含SEQ ID NO 29的重链可变区⑶Rl ；包含SEQ ID NO 30的重链可变区⑶R2 ； 包含SEQ ID NO 31的重链可变区⑶R3 ； 包含SEQ ID NO 35的轻链可变区⑶Rl ； 包含SEQ ID NO 36的轻链可变区⑶R2 ；和 包含SEQ ID NO 37的轻链可变区⑶R3。
16.一种结合人DEC-205的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含 包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重链可变区；和包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的轻链可变区，其中重链可变区CDR3序列包含选自共有序列(A，G，Y，S，P，-) (P，W，S，R) (Y，A，H) F D (Y， L，V) (SEQ ID NO 99)的氨基酸序列，其中“_”表示在该共有位点不存在氨基酸残基的选项。
17.权利要求16的抗体，其中所述轻链可变区⑶R3序列包含选自共有序列QQ(R，Y， F) (R，N) (Τ, S, N) (Y, W,-) (P,-) (Y，L，H，_) (Τ,-) (SEQ ID NO 102)的氨基酸序列，其中 “_” 表示在该共有位点不存在氨基酸残基的选项。
18.权利要求17的抗体，其中所述重链可变区⑶R2序列包含选自共有序列(V，I，F，T， A) I (W, G) (Y, Τ) (D, G)G(S, G, Y) (N, Τ) (K, P) Y(Y, A, V) (A, G, -)D S V K G(SEQ ID NO 98) 的氨基酸序列，其中“_”表示在该共有位点不存在氨基酸残基的选项，并且所述轻链可变区 CDR2 序列包含选自共有序列(D,A)A S (N，S) (R，L) (A，Q，Ε) (T，S) (SEQ ID NO 101)的氨基 酸序列。
19.权利要求18的抗体，其中所述重链可变区⑶Rl序列包含选自共有序列(I，N,T，S) Y (G, N, A) M (H, Y) (SEQ ID NO 97)的氨基酸序列；并且所述轻链可变区CDRl序列包含选 自共有序列 R A S Q (S, G) (I,V)S S(Y，W，A)L A (SEQ ID NO: 100)的氨基酸序列。
20.一种分离的单克隆抗体，其结合人DEC-205并且包含选自下组的重链和轻链可变 区 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列⑴包含选自共有序列(I，N，T，S)Y(G，N，A)M(H，Y) (SEQ IDNO 97)的氨基酸序列的重 链可变区CDRl ；(ii)包含选自共有序列(V,I，F，T，A) I (W, G) (Y，T) (D，G)G(S，G，Y) (N，Τ) (K，P) Y(Y， A, V) (A, G, -)D S V K G(SEQ ID NO 98)的氨基酸序列的重链可变区CDR2 ；(iii)包含选自共有序列(A，G，Y，S，P，_)(P, W, S, R) (Y, A, H) FD (Y, L, V) (SEQ ID NO: 99)的氨基酸序列的重链可变区CDR3 ；(iν)包含选自共有序列 RA S Q (S，G) (I，V) S S (Y，W, A) LA (SEQ ID NO 100)的氨基 酸序列的轻链可变区CDRl ；(ν)包含选自共有序列(D，A)A S (N，S) (R，L) (A, Q，Ε) (Τ, S) (SEQ ID NO 101)的氨基 酸序列的轻链可变区CDR2 ；(vi)包含选自共有序列 Q Q(R，Y，F) (R，N) (Τ, S，N) (Y，W, -) (P，-) (Y，L，H，-) (Τ,-) (SEQ ID NO 102)的氨基酸序列的轻链可变区CDR3 ；其中“-”表示在该共有位点不存在氨 基酸残基的选项。
21.一种分离的单克隆抗体，其结合人DEC-205并且包含含有选自SEQ ID NO :28、4、 16、40、52、64、70、76、88及其保守序列修饰的氨基酸序列的重链可变区。
22.权利要求21的抗体，其进一步包含含有选自SEQID NO :34、10、22、46、58、82及其 保守序列修饰的氨基酸序列的轻链可变区。
23.一种分离的单克隆抗体，其结合人DEC-205并且包含含有选自下组的氨基酸序列 的重链可变区和轻链可变区(a)分别为SEQID NO 28和34，及其保守序列修饰；(b)分别为SEQID NO 16和22，及其保守序列修饰；(c)分别为SEQID NO :4和10，及其保守序列修饰；(d)分别为SEQID NO 40和46，及其保守序列修饰；(e)分别为SEQID NO 52和58，及其保守序列修饰；(d)分别为SEQ ID NO 76和82，及其保守序列修饰。
24.一种分离的单克隆抗体，其结合人DEC-205并且包含含有氨基酸序列SEQ ID N0 28的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO 34的轻链可变区。
25.一种分离的单克隆抗体，其结合人DEC-205并且包含重链可变区，该重链可变区包 含与选自SEQ ID NO :28、4、16、40、52、64、70、76和88的氨基酸序列至少90%相同的氨基 酸序列。
26.权利要求25的抗体，其进一步包含轻链可变区，该轻链可变区包含与选自SEQID NO :34、10、22、46、58和82的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。
27.一种分离的单克隆抗体，其结合人DEC-205并且包含重链可变区和轻链可变区，该 重链可变区和轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列(a)分别为 SEQ ID NO 28 和 34 ；(b)分别为SEQ ID NO 16 和 22 ；(c)分别为SEQ ID NO :4 和 10 ；(d)分别为SEQ ID NO 40 和 46 ；(e)分别为SEQ ID NO 52 和 58 ；禾口(f)分别为SEQ ID NO 76 和 82。
28.一种分离的单克隆抗体，其结合人DEC-205并且包含重链可变区和轻链可变区，该 重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO :28至少90%相同的氨基酸序列，该轻链可变区 包含与氨基酸序列SEQID NO 34至少90%相同的氨基酸序列。
29.一种分离的单克隆抗体，其结合人DEC-205并且包含重链可变区，该重链可变区包 含选自SEQ ID N0:28、4、16、40、52、64、70、76和88的氨基酸序列，或其中重链可变区构架 区中的至少一个氨基酸残基被相应的种系残基置换的序列。
30.权利要求29的抗体，其进一步包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自SEQID NO :34、10、22、46、58和82的氨基酸序列，或其中轻链可变区构架区中的至少一个氨基酸残 基被相应的种系残基置换的序列。
31.权利要求29或30的抗体，其中所述至少一个置换的氨基酸残基选自直接非共价 结合抗原的残基；与CDR相邻的残基、CDR-相互作用残基、参与VL-VH界面的残基、规范残 基、游标区残基和链间堆积残基。
32.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、 IgAl、IgA2、IgAsec、IgD 和 IgE 抗体。
33.一种分离的抗体，其与权利要求1-2或4-31中任一项的抗体竞争结合。
34.一种结合人DEC-205的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含由选自下组的核酸 序列编码的重链可变区和轻链可变区(a)分别为SEQ ID NO 26 和 32 ；(b)分别为SEQ ID NO 14 和 20 ；(c)分别为SEQ ID NO 2 禾口 8 ；(d)分别为SEQ ID NO 38 和 44 ；(e)分别为SEQ ID NO 50 和 56 ；禾口(f)分别为SEQ ID NO 74 和 80 ；或与(a)-(f)的核酸序列具有至少90%同一性的核酸序列。
35.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体。
36.一种表达载体，其包含编码结合人DEC-205的抗体的轻链、重链或轻链和重链可变 区的核苷酸序列。
37.一种表达载体，其包含编码如权利要求1-34中任一项所述的结合人DEC-205的抗 体的轻链、重链或轻链和重链可变区的核苷酸序列。
38.用权利要求36或权利要求37的表达载体转化的细胞。
39.包含与抗原连接的权利要求1-34中任一项的抗体的分子偶联物。
40.权利要求39的分子偶联物，其中所述抗原包括病原体的成分。
41.权利要求39的分子偶联物，其中所述抗原包括肿瘤抗原、变应原或自身抗原。
42.权利要求39的分子偶联物，其中所述抗原包括肿瘤抗原。
43.权利要求42的分子偶联物，其中所述肿瘤抗原选自i3hCG、gpl00或Pmell7、HER2/ neu、WT1、间皮蛋白、CEA、gp 100、MART 1、TRP-2、NY-BR-I、NY-C0-58、MN (gp250)、独特型、酪 氨酸酶、端粒酶、SSX2、MUC-I、MARTl、me lan-A, NY-ESO-1、MAGE-I、MAGE-3、MAGE-A3 和高分 子量_黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)。
44.权利要求43的分子偶联物，其中所述肿瘤抗原是来自βhCG、NY-ES0-1、间皮蛋白 或HER2/neu的序列。
45.权利要求40的分子偶联物，其中所述抗原来自HIV、HPV、HBV或HCV。
46.权利要求40-45中任一项的分子偶联物，进一步包含治疗剂。
47.权利要求46的分子偶联物，其中所述治疗剂选自细胞毒性剂、免疫抑制剂和化疗剂。
48.一种双特异性分子，其包含与具有不同于所述抗体的结合特异性的分子连接的权 利要求1-34中任一项的抗体。
49.一种组合物，其包含权利要求1-34中任一项的抗体，权利要求39-47中任一项的分 子偶联物，或权利要求48的双特异性分子，和药学有效的载体。
50.权利要求49的组合物，进一步包含治疗剂。
51.权利要求50的组合物，其中所述治疗剂是免疫抑制剂。
52.权利要求50的组合物，其中所述治疗剂是抗体。
53.权利要求49的组合物，其包含选自TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、LTR8或TLR9激 动剂的免疫刺激剂。
54.一种将抗原靶向至受试者中的DEC-205的方法，包括向该受试者施用权利要求49 的组合物。
55.一种在受试者中诱导或增强针对抗原的免疫应答的方法，包括向该受试者施用权 利要求49的组合物。
56.权利要求55的方法，其中所述免疫应答包括作为MHC-I和/或MHC-II偶联物的组 分呈递抗原。
57.一种在受试者中诱导或增强针对抗原的T细胞介导的免疫应答的方法，包括给受 试者施用权利要求49的组合物，使得所述抗原被加工并且呈递给T细胞，从而诱导或增强 针对该抗原的T细胞介导的应答。
58.权利要求57的方法，其中所述T细胞应答由⑶4+和⑶8+T细胞两者介导。
59.权利要求57的方法，其中所述T细胞应答由细胞毒性T细胞或辅助T细胞介导。
60.一种免疫受试者的方法，包括给受试者施用权利要求49的组合物。
61.权利要求60的方法，其中所述组合物以足以诱导树突细胞释放细胞因子的量施用。
62.一种治疗受试者的疾病的方法，包括给受试者施用有效量的权利要求48的组合物。
63.权利要求62的方法，其中所述疾病选自结肠癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肾 癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、肥大 细胞瘤、乳房腺癌、白血病和类风湿性成纤维细胞瘤。
64.权利要求62的方法，其中所述疾病选自细菌、真菌、病毒和寄生虫传染病。
65.权利要求62的方法，其中所述疾病选自变态反应、移植排斥和自身免疫病。
66.权利要求62的方法，其中所述疾病选自包括类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖 尿病、重症肌无力、恶性贫血、阿狄森病、干燥综合征、银屑病、红斑狼疮、克罗恩氏病、溃疡 性结肠炎、硬皮病、雷诺综合征、莱特尔综合征、桥本甲状腺炎或格雷夫斯病的自身免疫病。
67.一种检测生物样品中是否存在DEC-205的方法，包括(a)使生物样品接触权利要求1-34中任一项的抗体，其中所述抗体用可检测物质标 记；和(b)检测与DEC-205结合的所述抗体，从而检测生物样品中是否存在DEC-205。
68.一种将抗原靶向至受试者中的B细胞的方法，包括给受试者施用包含与该抗原连 接的结合B细胞表面上受体的分子的分子偶联物，使得该B细胞刺激MHC I类限制的T细 胞。
69.一种在受试者中诱导或增强针对抗原的免疫应答的方法，包括给受试者施用包含 与该抗原连接的结合B细胞表面上受体的分子的分子偶联物，使得该B细胞刺激MHC I类 限制的T细胞。
70.一种针对抗原免疫受试者的方法，包括给受试者施用包含与该抗原连接的结合B 细胞表面上受体的分子的分子偶联物，使得该B细胞刺激MHC I类限制的T细胞。
71.权利要求68-70中任一项的方法，其中所述受体是C-型凝集素受体。
72.权利要求68-71中任一项的方法，其中所述受体是DEC-205。
73.权利要求68-72中任一项的方法，其中所述结合受体的分子是一种抗体。
74.权利要求73的方法，其中所述抗体是抗DEC-205抗体。
75.权利要求68-74中任一项的方法，其中所述B细胞通过共刺激途径激活。
76.权利要求68-75中任一项的方法，其中所述抗原被B细胞在MHCI类分子上呈递。
77.权利要求68-76中任一项的方法，其中所述抗原在HLA-A2.1分子上呈递。
78.权利要求68-77中任一项的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
79.权利要求78的方法，其中所述肿瘤抗原是i3hCG。
80.权利要求68-77中任一项的方法，其中所述抗原是病原体。
81.用于治疗受试者的疾病的权利要求78的方法，其中所述疾病选自结肠癌、胃癌、乳 癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肾癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、纤 维肉瘤、横纹肌肉瘤、肥大细胞瘤、乳房腺癌、白血病和类风湿性成纤维细胞瘤。
82.用于治疗受试者的疾病的权利要求80的方法，其中所述疾病选自细菌、真菌、病毒 和寄生虫传染病。
83.一种分离的人抗体或人源化抗体，其结合被权利要求1-3中任一项的抗体结合的表位。
84.一种分离的抗体，其结合被权利要求4-31中任一项的抗体结合的表位。
全文摘要
本申请公开了结合人DEC-205的分离的单克隆抗体和基于相关抗体的组合物和分子。也公开了包含所述抗体的药物组合物，以及使用所述抗体的治疗和诊断方法。
文档编号C07K16/28GK101888856SQ200880119337
公开日2010年11月17日 申请日期2008年11月7日 优先权日2007年11月7日
发明者L·A·维塔勒, L·何, T·科勒, V·雷玛克里斯纳 申请人:塞尔德克斯医疗公司