专利名称：人类角膜内皮细胞的扩增方法
技术领域：
本发明大体而言涉及一种扩增角膜内皮细胞之方法，更具体言之，本发明
涉及一种例如角膜内皮重建时治疗疑难的角膜内皮细胞失偿(decompensation)的 方法及移植物。
背景技术：
角膜内皮细胞位于角膜后方的基底膜(即后弹力膜(Descemet's membrane)) 上的单层扁平六角形细胞，其形成不含任何其它细胞类型的纯细胞薄片。角膜 内皮细胞对维持角膜的透明度十分重要。该功能是基于内皮对基质水合(stromal hydration)的调节，包括眼球水状液的屏障及泵功能。眼内手术、青光眼、外伤 或者先天性角膜疾病对人类角膜内皮造成的伤害可导致不可逆的角膜水肿，此 至少部分是因为人类角膜内皮细胞在出生之后不具有丝分裂活性或具有极低的 有丝分裂活性，以致细胞群体随年龄增长而逐渐减少。
当对人类角膜内皮细胞之伤害引起角膜水肿时，通常建议使用同种异体移 植物之后板层角膜移植术或穿透性角膜移植术治疗。后板层角膜移植术或穿透 性角膜移植术的一个主要顾虑是一个捐赠者角膜只能提供一个病患的角膜内皮 层移植。穿透性角膜移植术的另一顾虑是同种异体移植排斥反应。此外，在许 多国家，捐赠者角膜的供应不足。
近来，有研究报导在兔子模型上，将裸露的羊膜用作培养人类角膜内皮细 胞移植的载体(Ishino Y等人的Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45:800—806)。
然而，根据上述结果，该羊膜并未用作活体外(exvivo)细胞扩增的基材
发明内容
本发明的一个态样是提供一种用于扩增人类角膜内皮细胞的方法，该方法 包括
a) 提供含或不含羊膜细胞的羊膜，其中该羊膜含细胞外间质；
b) 将内皮层片或包括人类角膜内皮干细胞的细胞悬浮液置于该羊膜上；及
c) 于该羊膜上培养角膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适 当面积的时间。
本发明的另一态样提供一种产生用于病患植入部位的外科移植物的方法， 该方法包括
a) 提供含或不含羊膜细胞的羊膜，其中该羊膜含细胞外间质；
b) 将内皮层片或含人类角膜内皮干细胞的细胞悬浮液置于该羊膜上；
c) 于该羊膜上培养角膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适 当面积的时间；
d) 自该羊膜分离上述经培养的角膜内皮细胞；及
e) 将步骤d)中得到的该细胞移植至一载体上，以制得外科移植物。 本发明的另一态样是关于一种外科移植物，其可通过本发明的上述方法制备。
本发明的再一态样是关于一种治疗病患缺乏角膜内皮细胞的损伤部位的方 法，该方法包括
a) 提供含或不含羊膜细胞的羊膜，其中该羊膜含细胞外间质；
b) 将内皮层片或含人类角膜内皮干细胞的细胞悬浮液置于该羊膜上；
c) 于该羊膜上培养角膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适 当面积的时间；
d) 自该羊膜分离上述经培养的角膜内皮细胞；
e) 将步骤d)中得到的细胞移植至一载体上，以制得外科移植物；及
f) 将步骤e)中得到的该外科移植物移植于该损伤部位。
结合附图将更容易理解本发明的上述发明内容及实施方式。为达成说明本 发明的目的，图中展示目前较佳的实施例。然而，应了解本发明并不限于附图 中展示的实施例。
附图中
图1是扫描电子显微镜(SEM)影像，其显示根据本发明一实施例，在活体外
扩增并移植至人类角膜圆片上的人类角膜内皮干细胞。
具体实施例方式
根据本发明的一实施例，提供一种用于扩增人类角膜内皮细胞的方法，该
方法包括
a) 提供含或不含羊膜细胞的羊膜，其中该羊膜含细胞外间质；
b) 将内皮层片或含人类角膜内皮干细胞的细胞悬浮液置于该羊膜上；以及
c) 于该羊膜上培养角膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适 当面积的时间。
根据本发明，羊膜用于扩增人类角膜内皮细胞。该羊膜可含或不含羊膜细 胞，其中该羊膜含细胞外间质。根据本发明之一实施例，在该羊膜的基底膜侧 进行活体外培养来扩增该角膜内皮干细胞。将角膜内皮干细胞置于该羊膜的基 底膜侧，使角膜内皮细胞相对于基底膜的位置为面向上方。于该羊膜上培养角 膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适当面积或大小之时间，例 如直径约2至约3 cm的面积。
羊膜提供一种促进角膜内皮干细胞群扩增的特殊合适的基材(niche substmte)。在本发明的实例中，于羊膜上扩增角膜内皮细胞后，自该羊膜分离该 等角膜内皮细胞并将其移植至一载体，以制得外科移植物。接着，将置于裸露 的角膜后层表面上的所培养的角膜内皮细胞移植入病患眼睛。
本发明的另一态样提供一种产生施用于病患移入部位(recipient site)的外科 移植物的方法，其包含下述步骤-a) 提供含或不含羊膜细胞的羊膜，其中该羊膜含细胞外间质；
b) 将内皮层片或含人类角膜内皮干细胞的细胞悬浮液置于该羊膜上；以及
c) 于该羊膜上培养角膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适 当面积的时间；
d) 自该羊膜分离上述经培养的角膜内皮细胞；以及
e) 将步骤d)中得到的细胞移植至一载体上，以制得外科移植物。
根据本发明一实施例，步骤d)中使用的载体可为角膜圆片、经处理或改质 的羊膜薄片或任一能承载细胞的适当基材。在本发明一实施例中，载体可为大 小介于约8.5 mm与约9.0 mm之间的角膜圆片。该角膜圆片的厚度约小于 10(Him。该角膜圆片可为取自捐赠者或眼库(eye bank)的裸露角膜后层。在本 发明一实例中，该角膜盘为含有后弹力膜的角膜后层。
根据本发明的实施例，上述角膜内皮干细胞得自在对病患健康眼睛进行角 膜后轮部组织切片(posterior limbal biopsy)内皮层，或取自捐赠者的内皮层的人 类角膜内皮细胞，较佳为角膜内皮层周边所取得的人类角膜内皮细胞。
本发明亦关于一种用于病患缺乏角膜内皮细胞的损伤部位的外科移植物， 其可通过上述方法制备。
本发明也关于一种治疗病患缺乏角膜内皮细胞的损伤部位的方法，其中该 方法包括
a) 提供含或不含羊膜细胞的羊膜，其中该羊膜含细胞外间质；
b) 将内皮层片或含人类角膜内皮干细胞的细胞悬浮液置于该羊膜上；以及
c) 于该羊膜上培养角膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适 当面积的时间；
d) 自该羊膜分离上述经培养的角膜内皮细胞；
e) 将步骤d)中取得的上述细胞移植至一载体上，以制得外科移植物；及
f) 将步骤e)中取得的该外科移植物移植于该损伤部位。 参考以下特定、非限制性实例，进一步详细描述本发明。实例1:自角膜后轮部组织切片(limbalbiopsy)制备人类角膜内皮干细胞的培
养
在进行小梁切除术(Trabeculectomy)期间，通过活组织切片方式自病患或另
一活体的相同眼或不同眼取得周边的内皮层的一小片。使用优碘 (Betadine.RTM.)(聚维酮碘(Prvidone-iodine))消毒眼睑。在无菌条件下，距离轮部 组织约5至6 mm之处，产生长度约8 mm以轮部组织为底之结膜瓣(conjunctival flap)。在距离轮部组织约3 mm处产生长度约5 mm、深度约400 (im以轮部组织 为底之巩膜瓣(scleral flap),且该瓣延伸至角膜，并距离轮部组织约2 mm。当掀 起巩角膜瓣时，前房(anteriorchamber)由轮部组织区进入，且在该轮部组织区周 围平行延伸约3 mm的长度。进行小梁切除术，并自移除的组织分离角膜内皮层。 接着使用分离的角膜内皮细胞进行培养，以10-0缝线间断缝合巩角膜瓣及结膜 创口。
实例2:自捐赠者角膜制备人类角膜内皮干细胞
自捐赠者角膜取得周边角膜内皮层的小片。在进行穿透性角膜移植术 (penetrating keratoplasty)时，环锯中央角膜以取得捐赠者角膜的巩角膜周缘 (sclerocomeal rim)。使用第15号外科手术刀将具有后弹力层的角膜内皮层与小 梁组织网(Trabecular meshwork)仔细地分离。从一个捐赠者角膜取得六小片周边 角膜内皮层。
将含有角膜内皮干细胞的周边的角膜内皮层的小片置于含有1.5毫升(ml) 培养基的35 mm培养皿中。该培养基含有OPTIMEM-1作为基础培养基(basal medium),补充5至8%病患血清、10纳克/毫升(ng/ml)的纤维母细胞生长因子 (Fibroblast Growth Factor, FGF)、 5 ng/ml的表皮生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、 10微克/毫升(iag/ml)的抗坏血酸、50 jig/ml的青霉素(penicilline)、 50 pg/ml的链霉素(streptomycin)及2.5 mg/ml的防治霉(fungizone)。将培养皿中 的小片立即送至实验室的无菌层流净化罩中培养。
实例3:制备人类羊膜及在该人类羊膜上扩增人类角膜内皮干细胞
根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)的宗旨并取得同意后，可在剖腹 产时取得人类羊膜。使用含有抗生素的PBS (5 ml，含0.3X氧氟沙星(ofloxacin))清洗羊膜，然后存放于-8(TC的DMEM及甘油中。
将羊膜基底膜侧朝上，平滑地移于培养盘上，并在使用前置于37X:，含5% 二氧化碳(C02)及95%空气的潮湿恒温箱内培育过夜。于羊膜上进行角膜内皮 外植体的培养。在含有约l至1.5ml培养基的35mm培养皿中，将含有角膜内 皮干细胞的周边角膜内皮层植入/转移至羊膜基底膜侧。每隔两天更换一次培养 基，并培养2至4周，此时角膜内皮干细胞已生长并扩散至直径约2至3cm的 面积。通过在37 。C使用1.2国际单位(IU)裂解酶II(dispaseII)处理约1至2小时， 接着再使用胰蛋白酶(trypsin)/乙二胺四乙酸(EDTA)处理数小时，将经培养的人 类角膜内皮干细胞自培养皿剥离，以取得供继代培养用的细胞悬浮液。
实例4:制备人类角膜盘及将经扩增的人类角膜内皮干细胞移植至人类角膜
圆片
在对患有大泡性角膜病变(bullous keratopathy)病患进行穿透性角膜移植术 时，取得新鲜制备包括患病内皮细胞的全厚度的角膜中央圆片。如实例2所述， 将全厚度的角膜中央圆片置于上述含有1.5 ml培养基的35 mm培养皿中。立即 将培养皿中的角膜圆片送至实验室的无菌层流净化罩中培养。在汉克斯平衡盐 溶液(Hank，s Balanced Salt Solution (HBSS))中，与0.02 mg/ml胰蛋白酶/EDTA于 37 "C培育1小时以除去病患内皮细胞。通过使用火焰抛光吸量管(flame-polished pipette)剧烈搅散可使细胞分开。以后弹力膜侧朝上的方式将裸露的角膜圆片置 于24孔的培养皿中，接着将实例3所取得的小体积(0.3至0.5 ml)的上述继代 培养用的细胞悬浮液，包含大约2x 105个细胞，吸注至裸露角膜圆片的后弹力 膜上，使用实例2所述的培养基培养约10至14天。细胞移植后，以逐渐减低 的血清浓度(10%， 5°/。， 2%)，在37 。C的培养基F99 (哈姆氏F12/培养基199 (Ham's /Medium 199》中培育角膜约1星期。使用显微镜及扫描电子显微镜从形 态学评估移植成功率。
参照图1，放大倍率为1000倍的扫描电子显微镜影像显示根据本发明所述 方法的一实施例，将经活体外扩增的人类角膜内皮干细胞移植至人类角膜圆片。 人类角膜内皮的周边区域就增殖及继代培养而言，具有高度增殖能力。经活体 外扩增的人类角膜内皮细胞的自体移植物(auto-graft)或同种异体移植物(alk)-gmft)及内皮角膜移植术为未来的角膜重建提供了最佳的解决办法。
在预先处理过的羊膜基材上进行活体外扩增的独特技术能确保健康及年轻 的角膜内皮干细胞的继代培养并移植至接受者角膜。使用自体性角膜内皮干细 胞进行移植时，经扩增的人类角膜内皮干细胞具有于移植后不需要施行免疫抑 制处理(immunosuppression)的优点。针对以此方式移植的同种异体角膜内皮干细 胞而言，因仅移植角膜内皮干细胞而未移植其它类型细胞，减少排斥反应的发 生率。
相信对于所属技术领域的技术人员而言，本文已充分揭示其独特及具发明 性的外科移植物及产生方法，且所属技术领域的技术人员不需进行繁复的试验 即可实施本发明，且可在不脱离本发明的权利要求所定义的精神及范围下，对 其作变更。
权利要求
1. 一种扩增人类角膜内皮细胞的方法，该方法包括a)提供含或不含羊膜细胞的羊膜，其中该羊膜含细胞外间质；b)将内皮层片或含人类角膜内皮干细胞的细胞悬浮液置于该羊膜上；及c)于该羊膜上培养角膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适当面积的时间。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于于该羊膜的基底膜侧上扩增上述角膜内皮干细胞。
3. —种产生用于病患植入部位的外科移植物的方法，该方法包括a) 提供含或不含羊膜细胞的羊膜，其中该羊膜含细胞外间质；b) 将内皮层片或含人类角膜内皮干细胞之细胞悬浮液置于该羊膜上；及c) 于该羊膜上培养角膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适 当面积的时间；d) 自该羊膜分离该等经培养的角膜内皮细胞；及e) 将步骤d)中得到之该等细胞移植至一载体上，以制得外科移植物。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于于该羊膜的基底膜侧上进行上 述角膜内皮干细胞之的活体外培养。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于上述角膜内皮干细胞取自 于在该病患的健康眼睛进行后轮部组织切片的角膜内皮层。
6. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于上述角膜内皮干细胞取自 于捐赠者的内皮层。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于该内皮层为一周边的角膜内皮层。
8. 根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其特征在于该载体为角膜圆 片或羊膜层片。
9. 根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其特征在于该载体厚度小于 约100pm。
10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于该载体为角膜圆片。
11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于该角膜圆片为裸露的角膜后层。
12. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于该角膜圆片为含有后弹力 膜的角膜后层。
13. —种根据权利要求3-12中任一项所述的方法制备的外科移植物。
14. 一种治疗病患缺乏角膜内皮细胞的损伤部位的方法，该方法包括a) 提供含或不含羊膜细胞的羊膜，其中该羊膜含细胞外间质；b) 将一内皮层片或含人类角膜内皮干细胞的细胞悬浮液置于该羊膜上；及c) 于该羊膜上培养角膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适 当面积的时间；d) 自该羊膜分离上述经培养的角膜内皮细胞；及e) 将步骤d)中得到的上述细胞移植至一载体上，以制得外科移植物；及f) 将步骤e)中得到的该外科移植物移植于该损伤部位。
15. 根据权利要求14所述的方法，其特征在于于该羊膜的基底膜侧上进 行上述角膜内皮干细胞的活体外培养。
16. 根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于上述角膜内皮干细胞 取自于在该病患的健康眼睛进行后轮部组织切片的角膜内皮层。
17. 根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于上述角膜内皮干细胞 取自于捐赠者的内皮层。
18. 根据权利要求14至17中任一项的方法，其特征在于该内皮层为一周 边的角膜内皮层。
19. 根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其特征在于该载体为角 膜圆片或羊膜层片。
20. 根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其特征在于该载体厚度 小于约100pm。
21. 根据权利要求14至20中任一项所述的方法，其特征在于该载体为角 膜圆片。
22. 根据权利要求21所述的方法，其特征在于该角膜圆片为裸露的角膜 后层。
23. 根据权利要求21所述的方法，其特征在于该角膜圆片为含有后弹力 膜的角膜后层。
全文摘要
一种扩增人类角膜内皮细胞的方法，其包括a)提供含或不含羊膜细胞的羊膜，其中该羊膜含细胞外间质；b)将内皮层片或含人类角膜内皮干细胞的细胞悬浮液置于该羊膜上；及c)于该羊膜上培养角膜内皮细胞一段足使上述角膜内皮干细胞扩增至一适当面积的时间。本发明也关于一种使用上述扩增人类角膜内皮细胞的方法产生施用于病患植入部位(recipient site)的外科移植物的方法，及由该方法制备的外科移植物。
文档编号C12N5/02GK101437939SQ200780015455
公开日2009年5月20日 申请日期2007年4月30日 优先权日2006年4月28日
发明者蔡瑞芳 申请人:蔡曜年;蔡瑞芳