一种培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基及其应用。
【背景技术】
[0002]随着生物技术的发展，体外培养的奶牛瘤胃上皮细胞可作为瘤胃营养调控的重要手段，但是奶牛瘤胃上皮细胞体外培养时贴壁和生长遇到了问题，目前研究者在培养奶牛瘤胃上皮细胞时大都使用DMEM/F12培养基，在使用DMEM/F12培养基条件下奶牛瘤胃上皮细胞贴壁所需时间长、生长缓慢，说明此种培养基用于奶牛瘤胃上皮细胞体外培养的效果不好。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于建立用于奶牛瘤胃上皮细胞培养的完全培养基。
[0004]本发明的技术方案是:一种培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基，1000 mL完全培养基由以下原料制成:浓度为l~5ng/mL的EGF，浓度为0.5-1.5ug/mL的IGF-1，浓度为0.5-1.5ug/mL的氢化可的松，浓度为100~300 IU/mL的青链霉素，100mL胎牛血清，余量为DMEM/F12 粉剂。
[0005]所述的培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基的制备方法，它的步骤如下:
(1)将DMEM/F12粉剂制成DMEM/F12基础培养液；
(2)在500~800mL DMEM/F12基础培养液中加入100mL胎牛血清，制成DMEM/F12培养液；
(3)加入EGF，IGF-1，青链霉素，再加入DMEM/F12基础培养液定容至1000mL，制成培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基。
[0006]所述培养基的pH为7.0~7.4。
[0007]本发明的有益效果是:本发明对商业DMEM/F12配方进行了改进，进而达到奶牛瘤胃上皮细胞贴壁快、生长快的目的。普通DMEM/F12培养基培养的细胞在接种后5~6d开始贴壁长出细胞，而所述的完全培养基培养的细胞在接种后3~4d开始贴壁长出细胞，缩短2~3d0贴壁后普通DMEM/F12培养基培养细胞4~5d仍生长缓慢、不能铺满培养瓶，而所述的完全培养基培养细胞只需3~4d可铺满培养瓶。
【附图说明】
[0008]图1为普通DMEM/F12培养瘤胃上皮细胞图；
图2为完全培养基培养瘤胃上皮细胞图。
【具体实施方式】
[0009]—种培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基，1000 mL完全培养基由以下原料制成:浓度为l~5ng/mL的EGF，浓度为0.5-1.5ug/mL的IGF-1，浓度为0.5-1.5ug/mL的氢化可的松，浓度为100~300 IU/mL的青链霉素，lOOmL胎牛血清，余量为DMEM/F12粉剂。
[0010]培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基的制备方法，它的步骤如下:
(1)将DMEM/F12粉剂制成1000mL DMEM/F12基础培养液；
(2)在500~800mL DMEM/F12基础培养液中加入lOOmL胎牛血清，制成DMEM/F12培养液；
(3)加入EGF，IGF-1，青链霉素，再加入DMEM/F12基础培养液定容至1000mL，制成培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基。
[0011]所述培养基的pH为7.0~7.4。
[0012]一种培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基的应用，将奶牛瘤胃上皮组织剪碎后加酶进行消化，细胞筛过滤后进行瘤胃上皮细胞增殖培养，最后收集细胞，所述培养为胶原包被贴壁培养，所述的胶原包被贴壁培养为I型鼠尾胶原包被。
[0013]原代瘤胃上皮细胞培养步骤如下:
(1)取样:无菌条件下，取出新生荷斯坦奶牛瘤胃组织，用剪刀剪开瘤胃并将其胃内层外置，然后用75%乙醇浸泡组织lOmin，最后用含双抗的HBSS轻轻清洗组织5次。重复75%乙醇浸泡和HBSS清洗步骤三遍；
(2)消化:用剪刀轻轻剪下胃上皮组织，然后用剪刀将其剪成1mm3大小，37°C、5%C02培养箱中，用50mL离心管盛0.5% Pronase E+0.5% Collagenase II酶液消化剪碎组织1.5h左右，消化期间摇动离心管数次，以利用于组织充分消化；
(3)过滤:在显微镜下看到细胞脱落后，用100目细胞筛过滤消化液，将过滤后消化液放置于离心管中吹打数次，之后1500rpm离心lOmim获取细胞沉淀；
(4)包被:将所用培养瓶用I型鼠尾胶原包被。
[0014](5)培养:将获得的细胞沉淀用普通DMEM/F12培养基或完全培养基重悬，并将其置于37°C、5%C02细胞培养箱中培养；
(6)换液:24h后换用新鲜完全培养基继续培养。
[0015]运用倒置显微镜观察瘤胃上皮细胞原代培养的形态，普通DMEM/F12培养基和所述培养基培养细胞结果见图1和图2，其中呈铺路石样生长的为瘤胃上皮细胞。
[0016]普通DMEM/F12培养基培养的细胞在接种后5~6d开始贴壁长出细胞，而所述的完全培养基培养的细胞在接种后3~4d开始贴壁长出细胞，缩短2~3d。贴壁后普通DMEM/F12培养基培养细胞4~5d仍生长缓慢、不能铺满培养瓶，而所述的完全培养基培养细胞只需3~4d可铺满培养瓶。
【主权项】
1.一种培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基，其特征在于:1000 mL完全培养基由以下原料制成:浓度为l~5ng/mL的EGF，浓度为0.5-1.5ug/mL的IGF-1，浓度为0.5-1.5ug/mL的氢化可的松，浓度为100~300 IU/mL的青链霉素，100mL胎牛血清，余量为DMEM/F12粉剂。2.根据权利要求1所述的培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基的制备方法，其特征在于，它的步骤如下: (1)将DMEM/F12粉剂制成1000mL DMEM/F12基础培养液； (2)在500~800mL DMEM/F12基础培养液中加入100mL胎牛血清，制成DMEM/F12培养液； (3)加入EGF，IGF-1，青链霉素，再加入DMEM/F12基础培养液定容至1000mL，制成培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基。3.根据权利要求1所述的培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基的制备方法，其特征在于:所述培养基的pH为7.0-7.4。4.一种培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基的应用，其特征在于:将奶牛瘤胃上皮组织剪碎后加酶进行消化，细胞筛过滤后进行瘤胃上皮细胞增殖培养，最后收集细胞，所述培养为胶原包被贴壁培养，所述的胶原包被贴壁培养为I型鼠尾胶原包被。
【专利摘要】本发明公开了一种培养奶牛瘤胃上皮细胞的完全培养基：1000mL完全培养基由以下原料制成：浓度为1~5ng/mL的EGF，浓度为0.5~1.5ug/mL的IGF-1，浓度为0.5~1.5ug/mL的氢化可的松，浓度为100~300IU/mL的青链霉素，100mL胎牛血清，余量为DMEM/F12粉剂。本发明的有益效果是：本发明对商业DMEM/F12配方进行了改进，进而达到奶牛瘤胃上皮细胞贴壁快、生长快的目的。普通DMEM/F12培养基培养的细胞在接种后5~6d开始贴壁长出细胞，而所述的完全培养基培养的细胞在接种后3~4d开始贴壁长出细胞，缩短2~3d。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105238741
【申请号】CN201510774237
【发明人】廉红霞, 李改英, 孙宇, 傅彤, 高腾云
【申请人】河南农业大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月14日