专利名称：Lmp2a蛋白来源的hla-a2限制性表位多肽及其用途的制作方法
LMP2A蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽及其用途技术领域-
本发明涉及一条LMP2A蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽，及其在实体瘤的治疗及预防中的应用
背景技术：
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)属疱疹病毒科丫亚科成员，由Epstein和Barr于1964年首次从非洲儿童淋巴瘤中分离得到，全球约95%的人感染过EBV并成为携带者。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是与EBV感染高度相关的上皮细胞来源的恶性肿瘤，为头颈部常见肿瘤之一。NPC高发于东南亚及我国华南地区。江苏目前发病率也在不断增高，平均每周新增病例10 20例，每年约960例新发病例。临床上NPC不能手术治疗，主要是通过放疗和化疗，但这种治疗方法并不能完全有效地清除肿瘤细胞，而且副反应较大，部分患者易复发和转移。因此在传统治疗方案的基础上加以生物治疗，发展以细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)为基础的免疫治疗己成为目前研究的方向。
病毒蛋白在NPC肿瘤细胞中呈潜伏II型表达，即仅表达EBV核抗原(EBNA1)和EBV潜伏膜蛋白(LMP1、 LMP2)。 LMP2是一个包含12个跨膜区域的疏水膜蛋白，由LMP2A和LMP2B组成，两者mRNA仅N端第1个外显子不同，共享C端2 9个外显子，LMP2A表达量远高于LMP2B。 LMP2A是静止B细胞中唯一可检测到的EBV潜伏期基因表达产物，可增强细胞周期诱导和凋亡抑制等相关基因的表达，改变DNA和RNA新陈代谢相关基因表达，减少B细胞特异性因子和免疫相关基因的表达。研究表明，LMP2A蛋白富含HLA-A限制性CTL的抗原决定簇，诱导机体产生LMP2A表位特异性的CTL，能特异性杀伤表达LMP2A的相关肿瘤细胞。加之LMP2A其本身不是转化基因，但在EBV潜伏感染及转化细胞中发挥了重要作用，是EBV相关肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。
在NPC的免疫治疗中，以LMP2A为靶抗原设计的表位多肽治疗性疫苗已成为目前研究的热点。表位肽疫苗的优点在于化学性质稳定、制备方便、不需细菌或病毒等载体、根据需要可设计成特异性或通用性疫苗。随着生物信息学的发展，以往通过合成大量交叠肽(overlap peptides)再利用后续实验加以筛选的方法己逐步被计算机预测方法取代，极大地加快了基于表位的疫苗设计进程。随着研究的不断进行，陆续有新的LMP2A特异性表位被鉴定出来。
免疫原性弱和诱导免疫耐受是当前表位疫苗研究面临的主要问题，新的研究发现导致免疫耐受的原因主要与传统短肽的提呈途经有关。van der Burg在传统的MHC-I限制性表位序列基础上，添加锚定序列和连接序列，体外合成长肽，发现长肽在提高免疫原性和克服免疫耐受方面明显优于传统的短肽，其开发的HPV相关疾病治疗性多肽疫苗已经进入III期临床试验。研究新型抗原佐剂、选择合适的抗原提呈细胞和对抗原肽进行修饰加工是表位疫苗研究的热点。
热休克蛋白(heat shock protein, HSP)家族具有结合多肽、稳定多肽(分子伴侣)、转运多肽的作用。新近发现树突状细胞(dendritic cell, DC)表达HSP70受体，多肽与HSP70形成的复合物可通过受体介导的高效抗原内吞作用被捕获，结合的多肽被递呈至MHC分子，激发特异性T细胞免疫应答。分枝杆菌HSP70还能刺激DC表面的共刺激分子的表达与细胞因子的分泌，在连接天然免疫和获得性免疫中发挥了重要的桥梁作用，被公认为"天然免疫佐剂"。
发明内容
本研究的目的是筛选并鉴定LMP2A特异性CTL表位肽，将其或配合适宜的免疫佐齐U，作为一种新的表位疫苗，直接免疫机体，用于替代较为繁琐的重组病毒载体免疫疗法和树突状细胞过继免疫疗法。
一种LMP2A蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽，它是多肽LMP2A264，由九个氨基酸组成，其位置为264-272,其序列为QLSPLLGAV。
本研究采用生物信息学与体外实验相结合的方法，筛选并鉴定了三条有效的HLA-A2限制性的LMP2A特异性的表位，分别是LMP2A264 (QLSPLLGAV)、 LMP2A426(CLGGLLTMV)和LMP2A356 (FLYALALLL)。其中LMP2A264 (QLSPLLGAV)为本实验在中国人群中首次鉴定的新的LMP2A特异性表位。在EBV健康携带者和NPC患者中的体外实验结果显示这三条肽段均可以有效的诱导CTL反应，杀伤表达LMP2A蛋白的特异性靶细胞。
多肽LMP2A264可以按多肽一般的合成法合成，如多肽固相Fmoc合成法合成，该
4合成法的固相载体可以选用羧基树脂，如王氏树脂。可以用多肽自动合成仪合成。
发明人之前进行了 LMP2A重组腺病毒和痘苗病毒载体疫苗及树突状细胞(dendriticcell, DC)疫苗的研究，但这两类疫苗存在一定的缺陷。病毒载体疫苗一类的基因疫苗在使用的安全性上一直存有争议。DC疫苗使用自体外周血单个核细胞体外诱导后获得成熟DC，负载靶抗原后回输给患者，不会产生排异反应，安全可靠，但花费较高的人力和物力，在一定程度上制约了DC疗法的发展与应用。而本研究的多肽疫苗具有化学性质稳定、易于制备、肿瘤识别专一性强、无潜在致癌性等优点，在使用中只需检测一下患者的HLA型别，即可应用对应HLA限制性的多肽进行治疗。本研究鉴定的三条多肽为HLA-A2限制性，因HLA-A2型为中国人群NPC患者最为常见的基因型。LMP2A多肽可制备为干粉状，纯度最高可达98°/。以上，在常温下即可稳定保存，可根据需要制备成合适浓度，联合免疫佐剂(如细胞因子、热休克蛋白等)免疫机体即可达到治疗作用，是一种新型的鼻咽癌免疫治疗药物。
发明人表达、鉴定和纯化了分枝杆菌热休克蛋白70 (HSP70)，构建了评价EBV相关多肽疫苗体内试验的转基因动物模型。系统研究了EBV新表位多肽LMP2A264在健康志愿者和转基因小鼠体内外诱导EBV特异性的CTL的免疫学研究，评价了多肽lmp2a264对LMP2A阳性实体瘤肿瘤预防和肿瘤治疗试验，证明多肽QLS在体内外均可以诱导LMP2A特异性细胞毒性T淋巴细胞反应。因此，本发明的多肽LMP2A264可以应用于制备治疗或预防LMP2A阳性实体瘤肿瘤的药物。该多肽LMP2A264与热休克蛋白形成非共价复合物及相关融合蛋白有增强疗效的作用，所述的热休克蛋白种类包括哺乳动物来源的gp96、 HSP70和分枝杆菌属来源的HSP110、 HSP70、 HSP65。
图1为ELISPOT检测反应性CD8+T细胞IFN-y分泌情况PBMC经rVV-LMP2A-DC诱导获得LMP2A特异性CTL，与负载不同多肽的自体DC共孵育，ELISPOT法检测IFN-y的分泌。根据平均SFC/5xl04CD8+T (右)和SI值
(左)评估特异性CTL的应答强度。其中1:多肽QLS; 2:多肽ALL; 3:多肽CLG;4:多肽KLL; 5:多肽MLL; 6:多肽FLY
图2为NPC患者PBMC经多肽刺激后分泌IFN-y的CD8+T细胞比率NPC患者PBMC经多肽体外刺激后作为反应细胞，与293T-LMP2A细胞共孵育，FACS检测CD8和IFN-y双阳性细胞的比率。图中右上象限代表CD8+ IFN-/ T淋巴细 胞。右上角的数字越大说明肽治疗该患者的效果越好。 图3为NPC患者多肽特异性CTL杀伤活性检测-
NPC患者PBMC经多肽刺激后作为效应细胞，分别以293T-2A和293T细胞作为革巴 细胞，按效靶比10:1加入96孔U型底培养板，孵育4h后检测特异性杀伤效果。柱子 越高说明多肽药效越好。
图4为多肽QLS免疫小鼠的效果评价，柱子越高，效果越好。
图5为多肽QLS治疗肿瘤的疗效比较，图为三组试验终点肿瘤质量的统计结果。
具体实施例方式
实施例1. EBV-LMP2A特异性CTL表位的发现
本实施例通过生物信息学结合体外实验的方法筛选出HLA-A2限制性的LMP2A特 异性表位肽。
1)试验方法
采用如下三种生物信息学预测软件预测可能的LMP2A蛋白的表位肽SYFPEITHI (http:〃www.uni-tuebingen.de/uni/kxi)、 MHCPred (http: 〃www.je皿er.ac.uk/ MHCPred/)禾口 NetMHC(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-2.0/)。同时符合下列条件者入选①预 测分值较高；②多项式方案分析分值大于选定阈值(本研究为-23);③在以上三种方 法预测结果中出现两次或两次以上。
本发明人选择了如下6条多肽进行研究
表1. LMP2A特异性CTL候选表位肽
多肽编号位置序列
LMP2A264 (QLS)264-272QLSPLXGAV
LMP2A300(AIX)300-308ALLTLAAAL
LMP2A426(CLG)426-434CLGGLLTMV
LMP2A177(KIX)177-185KLLTPVTVL
LMP2A395(MLX)395-403MLLLIVAGI
LMP2A356(FLY)356-364FLYALALLL
上述肽段分别负载树突状细胞后与LMP2A特异性CTL作用，通过ELISPOT技术检测IFN-Y的分泌情况来判定CTL是否被激活，从而判定哪些肽段是有效的LMP2A 特异性表位肽。以平均斑点形成细胞(spot forming cells, SFC)和反应指数(responding index, RI)来表示ELISPOT结果，其中RI = (number of SFC/5xl04 CD8+ T cells with peptide — number of SFC/5><104CD8+T cells without peptide) / number of SFC/5xl04CD8+T cells without peptide,当SFC/5xl04CD8+T cells>20且RD2时判定为阳性结果。阳性 结果及预示该表位肽可用于肿瘤免疫治疗。 2)试验结果(见图1)
多肽QLSPLLGAV (QLS)、 CLGGLLTMV (CLG)禾口 FLYALALLL (FLY)表现为 阳性反应，其中QLSPLLGAV为本实验在中国人群中首次鉴定的新的LMP2A特异性 表位。
实施例2.新发现的肽QLS在鼻咽癌患者体外试验诱导Thl型细胞因子试验
1) 试验方法
用多肽体外刺激鼻咽癌患者PBMC，多肽刺激浓度为20pg/ml，同时加入细胞因子 IL-2，终浓度为20U/ml。 5天后收集细胞与靶细胞(LMP2A-293T细胞)作用，检测胞 内IFN- Y的分泌及CTL杀伤效果，评估多肽的体外免疫效果。如图2所示，FACS检测 CD8+/IFN-Y+T细胞的频率。
2) 试验结果(见图2)
结果显示，HLA-A2阳性NPC患者XLD、 XWM、 ZHW和CJW的PBMC经由多 肽体外刺激后，分泌IFN-Y的CD8细胞数量明显高于其他非HLA-A2阳性NPC患者。
实施例3.新发现的肽QLS在鼻咽癌患者体外试验诱导CTL杀伤试验
1) 试验方法
多肽刺激后的T淋巴细胞与LMP2A-293T细胞按效靶比10:1加至96孔U型底培 养板，用双色法流式细胞术检测细胞杀伤活性检测靶细胞的死亡率，评估多肽在不同患 者中诱导的CTL杀伤活性。
2) 结果显示，
HLA-A2阳性NPC患者来源的CTL可杀伤靶细胞，而在其他非HLA-A2型的NPC 患者(患者l、 2、 3、 5、 7、 10、 11)中没有检测到明显杀伤活性(见图3)。杀伤活性 预示体内治疗可以杀伤肿瘤细胞能力，该结果同时证明新发现的肽主要用于HLA-A2.1
7阳性的患者(即HLA限制性)
实施例4. LMP2A来源的QLS表位肽在转基因小鼠模型体内免疫疗效的研究
1) 试验方法
用PBS、 QLS多肽溶液、QLS加不全福氏佐剂混合乳化物、QLS与分枝杆菌HSP70 的非共价复合物，分别在0、 5、 10天皮下免疫C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)lEnge/J专基因 小鼠模型，然后在末次免疫后7天，去死小鼠，无菌取出脾脏，研磨、过滤得脾细胞悬 液。然后用ELIspot检测分泌INF-y的特异性脾细胞水平体，用LDH法检测特异性细胞 毒性T淋巴细胞水平。
2) 试验结果
结果显示QLS和不全福氏佐剂以及QLS和分枝杆菌热休克蛋白70的复合物组可以 诱导转基因小鼠体内特异性T淋巴细胞反应，单独QLS组体内直接免疫，免疫原性很 弱，而HSP70对照组不能诱导体内特异性T淋巴细胞反应。(见图4)
3) 试验结论
新的表位QLS直接免疫转基因鼠模型、和不全福氏佐剂乳化后免疫转基因鼠模型、 和分枝杆菌热休克蛋白70非共价连接复合物免疫转基因鼠后结果显示，QLS直接免疫， 免疫原性非常弱和HSP70对照组无显著性差异，加不全佐剂和热休克蛋白后可直接免 疫，具有明显的免疫疗效，包括诱导Thl型细胞因子和CTL杀伤活性。
实施实例5动物模型中研究新肽治疗肿瘤疗效 1)试验方法
.多肽合成方法，采用固相合成法合成多肽。它的最大特点是不必纯化中间产物， 合成过程可以连续进行，进而为多肽合成的自动化奠定了基础。目前全自动多肽的合成， 基本都是固相合成。其基本过程如下基于Fmoc化学合成，先将所要合成的目标多 肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这一氨 基酸的氨基作为多肽合成的起点，同其他的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键，不断 重复这一过程，即可得到多肽。根据多肽的氨基酸组成不同，多肽后处理方式不同，纯 化方式也有差异。合成的多肽QLS是粉末状，为灰白色，多肽QLS长期保存需要避光保存，并应保存在-20度，短期可以保存在4度。短时间可以常温运输。合成的多肽Q LS按1mg/支分装，纯度>98%。
多肽溶解方法先用有机溶剂二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)少量 溶解多肽，然后按浓度用生理盐水溶解。
多肽给药方法按50pg多肽QLS溶于200^1福氏不全佐剂中，皮下免疫动物， 或者50叫多肽QLS和100^1重组HSP70蛋白溶液结合溶解，皮下免疫动物，以及对 照组用磷酸盐缓冲液(PBS)皮下免疫动物。
动物肿瘤模型选30只转基因小鼠，分成三组，每组10只，皮下注射1 X106 B AA细胞，约15天肿瘤长到0.3mm直径，开始用疫苗治疗。每5天免疫一次，共3次， 15天后解剖肿瘤，称重比较对照组和治疗组肿瘤大小，结果见图5.
试验结论
多肽QLS可以有效治疗转基因小鼠模型的LMP2A阳性肿瘤。
权利要求
1.一种LMP2A蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽，其特征是它是多肽LMP2A264，由九个氨基酸组成，其位置为264-272，其序列为QLSPLLGAV。
2. 权利要求1所述的多肽LMP2A264在制备治疗或预防LMP2A阳性实体瘤肿瘤的药物中的应用。
3. 根据权利要求2所述的多肽LMP2A264在制备治疗或预防LMP2A阳性实体瘤肿瘤药物中的应用，其特征是多肽LMP2A264与热休克蛋白非共价复合物及相关融合蛋白有增强LMP2A264疗效的作用。
4. 根据权利要求3所述的多肽LMP2A264在制备治疗或预防LMP2A阳性实体瘤肿瘤药物中的应用，其特征是所述的热休克蛋白种类包括哺乳动物来源的gp96、 HSP70和分枝杆菌属来源的HSP110、 HSP70、 HSP65。
全文摘要
一种LMP2A蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽，它是多肽LMP2A<sub>264</sub>，由九个氨基酸组成，其位置为264-272，其序列为QLSPLLGAV。发明人表达、鉴定和纯化了分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)，构建了评价EBV相关多肽疫苗体内试验的转基因动物模型。系统研究了EBV新表位多肽LMP2A<sub>264</sub>在健康志愿者和转基因小鼠体内外诱导EBV特异性的CTL的免疫学研究，评价了多肽LMP2A<sub>264</sub>对LMP2A阳性实体瘤肿瘤预防和肿瘤治疗试验，证明多肽LMP2A<sub>264</sub>在体内外均可以诱导LMP2A特异性细胞毒性T淋巴细胞反应。因此，本发明的多肽LMP2A<sub>264</sub>可以应用于制备治疗或预防LMP2A阳性实体瘤的药物。
文档编号C07K7/06GK101643497SQ200910035098
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月15日 优先权日2009年9月15日
发明者冯东举, 刘根焰, 刘英霞, 锋 周, 堃 姚, 冰 王, 谢芳艺, 云 陈 申请人:南京医科大学