专利名称：一种高纯度绝经期促性腺素及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化和生物医药领域。具体而言，本发明涉及一种高纯度绝经 期促性腺素及其制备方法和用途。
背景技术：
绝经期促性腺素(Human Menopausal Gonadotropins，简称HMG)含有卵泡刺激素 (Follicle-stimulating hormone,简禾尔 FSH)禾口黄体生成激素(leuteinizing hormone,简 称LH)两种活性成分，它们是由垂体产生的糖蛋白激素，都是由α链和β链两个亚基组 成。FSH的α亚基与LH、绒毛膜促性腺素(chorionic gonadotropin，简称CG)的α亚基完 全相同，具有92个氨基酸，分子量约为14500D，第52和78位置上的天冬酰胺是发生N-糖 基化的氨基酸。FSH的β亚基由111个氨基酸组成，分子量约为18000D，其中第7和24位 置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。而LH的β亚基由121个氨基酸组成，分子量 约为14800D ；CG的β亚基则有145个氨基酸，分子量22000-39000D。临床上HMG主要用于治疗不育症，它可以从垂体或绝经期妇女的尿液中提取出 来，也可通过DNA重组技术而制备。含有FSH的第一代产品是尿促性素(HMG)，如Serono公司的Pergonal，它是FSH 与LH比例约为1的混合物。但是它的比活和纯度都很低，比活一般在40-300IU/mg蛋白， 纯度只有2-3%的有效成分，其余约97%都是杂蛋白，由于杂蛋白含量大，对人体有潜在的 副作用，给药方式也只能局限于肌肉注射。高纯度的尿促性素(PHMG)是本领域所特别需要 的，它应当纯度高、杂质少，不含有大量的杂蛋白，因此不会造成人体的过敏反应，并且由于 这些优点它可以使用皮下注射，提高患者的顺应性。但是，pHMG的纯化很有难度，由于它同时含有FSH和LH两种成分，而且需要两者 按一定的比例构成，而FSH和LH的结构性质又不相同，因此在后期的纯化过程中很容易使 两者分离从而导致达不到希望的比例，这在PHMG的纯化中尤其突出，目前还没有关于直接 获得高纯度HMG的方法的报道。因此本领域迫切需要开发出一种制备纯度高、杂质少的高纯度HMG的方法，便于 使用于皮下注射，方便患者的使用、减轻痛苦。
发明内容
本发明旨在提供一种纯度高、杂质少的高纯度HMG的制备方法。本发明的另一个目的是提供由上述方法纯化得到的高纯度HMG。本发明的又一个目的是提供由上述方法纯化得到的高纯度HMG的药物组合物。本发明的再一个目的是提供由上述方法纯化得到的高纯度HMG的用途。在本发明中，提供了一种高纯度绝经期促性腺素(purified HumanMenopausal Gonadotropins, pHMG)，其HPLC纯度不低于95%，其杂质HPLC含量不超过5% ；优选HPLC 纯度不低于96 %，杂质HPLC含量不超过4%。
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在另一优选例中，所述的绝经期促性腺素来自重组的绝经期促性腺素或其变体、 或人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。在另一优选例中，所述的高纯度的绝经期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)与黄体 生成素(LH)的生物效价比例为1 0. 1-3。在另一优选例中，所述的高纯度绝经期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)与黄体生 成素(LH)的生物效价比例为1 0.5-1.4。在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的高纯度绝经期促性腺 素(PHMG)的制备方法，所述的方法包括步骤将低纯度HMG通过染料亲和层析纯化，得到高 纯度绝经期促性腺素；所述的低纯度HMG比活在2000FSH国际单位/mg蛋白以下。在另一优选例中，所述的方法包括步骤(1)将含有低纯度HMG的溶液上样至染料亲和层析的层析柱上；(2)用pH6-ll的缓冲液进行洗涤；和(3)用pH6-ll的缓冲液进行洗脱，得到高纯度绝经期促性腺素。在另一优选例中，所述含有低纯度HMG的溶液中低纯度HMG的浓度为0. l-10w/v%o在另一优选例中，所述含有低纯度HMG的溶液的pH为4-8。在另一优选例中，所述的缓冲液选自醋酸钠溶液、醋酸铵溶液、甘氨酸-NaOH溶 液、Tris-HCl溶液或磷酸盐溶液。在另一优选例中，在步骤(3)中包括下述步骤(3')用pH6-ll的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；(3")浓缩洗脱液后，加入无水乙醇，离心得到沉淀；和(3"‘)将沉淀脱水，得到干燥的高纯度绝经期促性腺素。在另一优选例中，所述染料亲和层析的填料的染料配基选自Cibacron Blue、 Orange、Red、Green0在另一优选例中，所述染料亲和层析的填料的固相载体选自皂土、玻璃微球、石英 微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、或琼脂糖。在另一优选例中，所述染料亲和层析的填料选自Blue Sepharose FF或 BlueSepharose 6B。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物中含有治疗有效量 的如上所述的本发明提供的高纯度绝经期促性腺素，和药学上可接受的载体。在本发明的第四方面，提供了一种如上所述的本发明提供的高纯度绝经期促性腺 素的用途，所述高纯度绝经期促性腺素用于制备治疗不育综合症的药物。据此，本发明提供了一种制备纯度高、杂质少的高纯度HMG的方法，所得到的高纯 度绝经期促性腺素便于使用于皮下注射，方便患者的使用、减轻痛苦。
图1显示了 pHMG的纯度图谱。
具体实施例方式发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现通过染料亲和层析色谱可以获得高纯度的HMG，其HPLC纯度彡95%，杂质HPLC含量彡5%，是目前已知纯度最高的HMG，并且FSH 和LH的生物效价比例可以在要求的范围内，如1 0.1-1 3。具体地，本发明将低纯度 HMG通过染料亲和层析纯化，得到高纯度绝经期促性腺素。如本文所用，“低纯度HMG”是指生物效价在2000FSH国际单位(IU)/mg以下的HMG， 优选生物效价在40-500FSH IU/mg。可以通过本领域熟知的方法获得低纯度HMG，例如但不 限于，从绝经期妇女尿液中通过高岭土吸附、洗脱，丙酮沉淀，乙醇溶液抽提，离子交换层析 色谱(包括阳离子、阴离子色谱)，甚至疏水色谱得到。也可以通过商业渠道获得。低纯度 HMG中FSH和LH的生物效价比例在1 0. 1_3范围，更佳地，在1 0.5-1. 4范围。如本文所用，“绝经期促性腺素”、“尿促性素”和“HMG”可以互换使用，都是指一类 由垂体产生的糖蛋白激素或其变体，含有FSH和LH两种活性成分。可以是重组的绝经期促 性腺素或其变体、或是人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。如本文所用，“卵泡刺激素”和“FSH”可以互换使用，都是指一类用于促进精子或卵 泡产生、促进卵巢发育的激素或其变体，其可在天然情况下由垂体前叶分泌，可从绝经期妇 女的尿液中提取或可通过重组技术获得的。如本文所用，“黄体生成激素”和“LH”可以互换使用，都是指是由脑垂体前叶嗜碱 性细胞分泌的，作用于成熟的卵胞，能引起排卵并生成黄体的一类激素或其变体。如本文所用，“杂质”是指除了绝经期促性腺素之外的其它物质，是指除FSH、LH以 外的杂蛋白，如降解亚基、聚合亚基等。其含量测定方法与本发明提供的检测高纯度绝经期 促性腺素纯度的高效液相色谱(HPLC)方法一样，在所述HPLC检测条件下，通过面积归一法 得到杂质含量。制备方法本发明提供的高纯度绝经期促性腺素的制备方法，是将低纯度HMG通过染料亲和 层析纯化。在本发明的一个实施例中，所述的制备高纯度绝经期促性腺素的方法包括步骤(1)将含有低纯度HMG的溶液上样至染料亲和层析的层析柱上；和(2)用pH6-ll的洗涤液进行洗脱，得到高纯度绝经期促性腺素。染料亲和层析的填料可以是本领域所熟知的，例如但不限于，Green琼脂糖、 Orange琼脂糖；较佳地为Blue琼脂糖；更佳地为Blue Sepharose 6B。较佳地，所述洗涤液中的离子浓度在0. 01-5M，洗涤液选自醋酸钠溶液、甘氨 酸-NaOH溶液、或Tris-HCl溶液。在本发明的一个优选实施例中，所述高纯度绝经期促性腺素通过以下步骤获得将含有低纯度HMG的溶液上样至染料亲和层析的层析柱上；和用pH6-ll的缓冲液进行洗涤和洗脱，得到高纯度绝经期促性腺素。在本发明的另一优选例中，所述的制备高纯度绝经期促性腺素的方法包括步骤⑴将含有低纯度HMG的溶液上样至染料亲和层析的蓝色琼脂糖 (BlueSepharose)层析柱上；所述的含有低纯度HMG的溶液是将低纯度HMG溶解于pH4_8缓 冲液；(ii)用步骤(i)中的缓冲液洗涤；(iii)用 pH6-ll 的 0. 03-0. 07M 甘氨酸-NaOH 缓冲液洗涤；
(iv)用含低浓度盐的PH6-11的0. 03-0. 07M Tris-HCl缓冲液洗涤；(ν)用含高浓度盐的ΡΗ6-11的0. 03-0. 07Μ Tris-HC缓冲液洗脱，收集洗脱液；(ν)浓缩洗脱液，加入无水乙醇，离心得到沉淀；和(vi)将沉淀脱水，得到干燥的高纯度绝经期促性腺素。所述的盐是盐酸盐或硫酸盐，其中的金属离子选自Na、K、或铵；一般在步骤(iv) 和步骤(ν)中使用同一种盐；所述的低浓度为0-0. 5M，较佳地为0. 1-0. 5M，更佳地为0. 3-0. 5M ；所述的高浓度 为0. 5-5M，较佳地为2-5M，更佳地为3-5M。在本发明提供的制备高纯度绝经期促性腺素的方法中，所述的含有低纯度HMG的 溶液是将低纯度HMG溶解于0. 01-0. 03M醋酸盐缓冲液而得；较佳地，所述含有低纯度HMG 的溶液PH为4-8。高纯度绝经期促性腺素(pHMG)通过本发明的方法可以制备得到高纯度绝经期促性腺素，其杂质HPLC含量 较佳地，杂质HPLC含量< 4%。本发明制备得到的高纯度的绝经期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)与黄体生成素 (LH)的生物效价比例为1 0. 1-3 ；较佳地，卵泡刺激素(FSH)与黄体生成素(LH)的生物 效价比例为1 0.5-1.4。药物组合物如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种 赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施 用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形 剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另 外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如崩解剂、润湿剂、乳化剂、PH缓冲物质等。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种剂型。这些剂型以下面方式 之一施用口服、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、和肌肉注射或输入，或借助一种外植 储器用药。其中优选优选皮下注射给药方式。用途通过本发明的方法制备得到的高纯度绝经期促性腺素可以用于制备治疗不育综 合症的药物，所述的药物可以通过常规途径施用，其中包括(但并不限于)肌注、皮下注射 等。优选皮下注射施用。药物制剂形式应与施用方式相匹配。药物的施用量，按活性物质计 算，通常为每天约0. 01-5μ g/kg体重，较佳地约0. 05-0. 5ug/kg体重，更优选为0. 2-0. 4ug/ kg体重。本发明的药物可直接使用，也可与其它治疗剂或辅剂联合使用。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示 的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特 征的一般性例子。本发明的主要优点在于
1、提供了一种高纯度、杂质少的HMG，可应用于皮下注射；2、提供了一种高纯度HMG的纯化方法，方法简单有效，适合产业化。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按 重量计。本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明中FSH、LH生物效价的测定按中国药典2005版附录XII M、XII N的方法进行。比活是指单位重量的蛋白中所含的效价，在本发明中，HMG或pHMG的比活是指每 毫克蛋白中含多少国际单位FSH或LH。其中，蛋白含量的测定方法是按照Lowry法或其衍 生的方法进行测定。本发明中HPLC纯度或HPLC含量是指按照面积归一化法计算的峰面积百分比。本发明中绝经期促性腺素纯度的测定方法如下(检测限为2. 5IU)色谱柱Superdex7510/300 GL流动相乙腈0. 2M磷酸钠溶液pH7. 0 = 200 1000样品配制取样品用流动相溶解至500IU/mL进样量100μ L柱温30°C流速0· 5mL/min检测波长215nm运行时间60min绝经期促性腺素主峰保留时间约为18-19min。实施例1制备高纯度绝经期促性腺素I在本实施例中，将低纯度HMG(购自上海天伟生物制药有限公司)用作pHMG的起 始原料，其中FSH的生物效价为273IU/mg，LH的生物效价为319IU/mg。将5OOmL Blue Sepharose FF (购自 GE Amersham)，装入层析柱，用平衡液(0. 02M 醋酸钠，PH7. 0)平衡。将IOg低纯度HMG用IL平衡液溶解，用HCl或NaOH溶液调节pH约7. 0，然后上样 至上述Blue Sepharose FF层析柱上，上样结束后用平衡液洗涤5倍柱体积，然后用0. 05M Glycin-NaOH pHIO 洗涤 8 倍柱体积，再用 0. 05MTris-HCl, 0. 4M NaCl，pH9 洗涤 8 倍柱体积， 最后用0.05M Tris-HCl,4M NaCl，pH9洗脱，分部收集洗脱液(收集很多份，例如每300mL 为一份)，然后将含有效成分的部分合并，即合并有效成份，用10000MW膜超滤浓缩后，边搅 拌边加入5倍体积预冷的无水乙醇，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得236mg干
7燥品，即高纯度绝经期促性腺素I。生物效价的测定方法按照中国药典2005版附录XII M、附录XII N的方法测定 FSH、LH生物效价。其结果见表1 表1所得干燥品的生物效价和纯度 结果表明，采用本发明的方法进行纯化，可以使HMG的纯度大大提高。实施例2制备高纯度绝经期促性腺素II将500mL Blue Sepharose 6B (购自 GE Amersham)，装入层析柱，用平衡液(0. 02M 醋酸钠，PH7. 0)平衡。将6g同实施例1中相同来源的低纯度HMG用600mL平衡液溶解，用HCl或NaOH溶 液调节PH约7.0，然后上样至上述Blue Sepharose 6B层析柱上，上样结束后用平衡液洗涤 5倍柱体积，然后用0. 05M Glycin-NaOH pHIO洗涤5倍柱体积，再用0. 05M Tris-HCl，0. 2M NaCl，pH9洗涤5倍柱体积，再用0. 05MTris_HCl，0. 5M NaCl，pH9洗涤7倍柱体积，最后用 0.05M Tris-HCl, 4M NaCl，pH9洗脱，分段收集洗脱液，合并有效成份，用10000MW膜超滤浓 缩至IOOmL,即得高纯度绝经期促性腺素II。对此液体取样测定FSH、LH生物效价及蛋白含 量，计算比活。生物效价的测定方法按照中国药典2005版附录XII M、附录XII N的方法测定 FSH、LH生物效价。蛋白质含量测定方法按Lowry法进行测定。FSH比活的计算方法比活=FSH生物效价(IU/mL) +每毫升液体中的蛋白含量 (mg/mL)其结果见表2:表2所得干燥品的生物效价和纯度
8 结果表明，采用本发明的方法进行纯化，可以使HMG的纯度大大提高。实施例3pHMG冻干针剂的制备用于制造100瓶pHMG冻干针剂，且每瓶含75IU FSH和75IU LH的例子如下将实施例1所制备的高纯度绝经期促性腺素I 1. 64mg，溶解于5mL注射用无热原 水中，用0. 22 μ m过滤器进行无菌过滤，并用注射用无热原水洗涤过滤器。将Ig乳糖溶解于30mL注射用无热原水中，如果需要的话，用HCl或NaOH调节 PH6. 5士0. 2，用0. 22 μ m过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述FSH溶液中，用注射用无热 原水定容至75mL，混勻。将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶0. 75mL，进行冷冻干燥。所得到的安瓿瓶中，每瓶含约75IU FSH、75IU LH和IOmg乳糖。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范 围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术 实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将 被视为涵盖于该权利要求范围之中。
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权利要求
一种高纯度绝经期促性腺素(purified Human Menopausal Gonadotropins，pHMG)，其特征在于，其HPLC纯度不低于95％，其杂质HPLC含量不超过5％；优选HPLC纯度不低于96％，杂质HPLC含量不超过4％。
2.如权利要求1所述的高纯度绝经期促性腺素，其特征在于，所述的绝经期促性腺素 来自重组的绝经期促性腺素或其变体、或人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。
3.如权利要求1所述的高纯度绝经期促性腺素，其特征在于，所述的高纯度的绝经期 促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)与黄体生成素(LH)的生物效价比例为1 0. 1-3。
4.如权利要求1所述的高纯度绝经期促性腺素，其特征在于，所述的高纯度绝经期促 性腺素中，卵泡刺激素(FSH)与黄体生成素(LH)的生物效价比例为1 0.5-1.4。
5.一种如权利要求1-4任一所述的高纯度绝经期促性腺素(pHMG)的制备方法，其特征 在于，所述的方法包括步骤将低纯度HMG通过染料亲和层析纯化，得到高纯度绝经期促性 腺素；所述的低纯度HMG比活在2000FSH国际单位/mg蛋白以下。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(1)将含有低纯度HMG的溶液上样至染料亲和层析的层析柱上；(2)用pH6-ll的缓冲液进行洗涤；和(3)用pH6-ll的缓冲液进行洗脱，得到高纯度绝经期促性腺素。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述含有低纯度HMG的溶液中低纯度 HMG 的浓度为 0. l-10w/v%。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述含有低纯度HMG的溶液的pH为4-8。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液选自醋酸钠溶液、醋酸铵 溶液、甘氨酸-NaOH溶液、Tris-HCl溶液或磷酸盐溶液。
10.如权利要求5-9任一所述的制备方法，其特征在于，所述染料亲和层析的填料的染 料配基选自 Cibacron Blue、Orange、Red、Green。
11.如权利要求5-9任一所述的制备方法，其特征在于，所述染料亲和层析的填料的固 相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚 糖凝胶、纤维素、或琼脂糖。
12.如权利要求5-9任一所述的制备方法，其特征在于，所述染料亲和层析的填料选自 Blue Sepharose FF 或 Blue Sepharose 6B。
13.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物中含有治疗有效量的如权利要求1-4 任一所述的高纯度绝经期促性腺素，和药学上可接受的载体。
14.一种如权利要求1-4任一所述的高纯度绝经期促性腺素的用途，其特征在于，用于 制备治疗不育综合症的药物。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度绝经期促性腺素及其制备方法和用途。所述的高纯度绝经期促性腺素的HPLC纯度不低于95％，其杂质HPLC含量不超过5％。
文档编号C07K1/22GK101928342SQ20091005327
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月18日 优先权日2009年6月18日
发明者严惠敏, 季斌, 季晓铭, 洪云海, 郭照晔, 高霄梁 申请人:上海天伟生物制药有限公司