专利名称：RACK1b基因对植物抗旱耐盐性的副调控作用及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物工程和植物改良基因工程领域。具体地说，本发明涉及 RACKlb基因及其编码的蛋白或多肽在调节植物抗旱耐盐性中的用途，以及通过抑制所述基 因或其表达的蛋白来改进植物对盐和/或干旱胁迫的抗性的方法及转基因植物。
背景技术：
全球粮食需求的增加和耕地面积的不断减少对各国粮食安全形成持续的压力。在 粮食生产中，干旱、盐碱等是最主要的非生物胁迫，每年造成农作物大量减产及品质下降。 并且，干旱和盐碱常相伴出现，例如土壤盐碱化是干旱地区常见的一种土地退化现象。有资料表明，中国每年由于干旱造成的水稻损失价值至少为20亿美元，而农田的 盐碱化也是减产、低产的主要原因。干旱和盐碱已成为我国农业面临的两个严重问题。因此，如何提高作物对干旱和/或盐碱的抗性能力对于提高产量，解决中国乃至 世界的粮食问题具有重大的意义，对于这些非生物逆境的研究是植物研究领域最迫切且最 具挑战性的工作之一。抗逆基因工程就是通过调控基因的转录表达来改善植物的抗逆能力。目前已经有 一部分抗旱、耐盐相关基因被克隆，而且通过基因工程技术获得一些抗逆植物或农作物品 系。然而，现在所发现的参与胁迫应答的基因及其表达蛋白只是冰山一角，还有许多基因及 其表达蛋白有待发现和研究、并进一步应用于农作物抗逆分子育种。因此，本领域迫切需要对参与胁迫应答的基因及其表达蛋白进行研究，开发出可 用于农作物抗逆育种的新方法和新品种，从而提高农作物产量和质量。活化的蛋白激酶C 受体(receptor for activated C-kinase 1，RACKl)是一类 包含Trp-Asp 40 (WD40)重复结构单元的蛋白质。RACKl蛋白是一类古老的蛋白(Neer等 (1994)Nature 371，297-300 ；McCahi 11 等(2002)Mol. Pharm. 62，1261-1273)，在蛋白序列 上高度保守，从低等的藻类Chlamydymonas到高等的植物及哺乳动物都有广泛的分布。有研究表明，RACKl蛋白参与了动物细胞中多种信号传导过程。在三维结构上， RACKl蛋白由7个叶片组成，呈β -螺旋桨状，与G蛋白的β亚基类似(Nakashima等， (2008) Plant Cell 20，2265-2279)。WD40重复结构单元被认为参与了蛋白质之间的相互作 用，而螺旋桨结构则为蛋白提供了相互作用的平台。然而，本领域中并未揭示RACKlb基因或蛋白与植物抗旱耐盐性之间的关系。
发明内容
本发明正是提供了 RACKlb基因对植物抗旱耐盐性的副调控作用及其相关的应用。在本发明的第一方面，提供了一种植物蛋白激酶C受体Ib蛋白，即RACKlb蛋白， 其包含具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、其保守性变异多肽、或其同源多肽。在一个优选例中，所述蛋白或多肽具有WD40重复结构单元和β -螺旋桨结构。
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在本发明的一个实施方式中，所述蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的，且受到抑制后植物抗旱耐盐性提高的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)和(b)中所述多肽同源、且其受到抑制后植物抗旱耐盐性提高的多肽。在一个优选例中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选作物或经济植物。在另一个优选例中，所述植物选自禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔 属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选禾本科植物。在另一个优选例中，所述植物选自水稻、玉米、拟南芥、烟草、番茄、大豆、油菜、苜 蓿、杨树、小麦、大麦、甘蔗、高粱、棉花或油菜，更优选水稻、玉米、拟南芥或烟草。在另一优选例中，所述盐是指氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含编码本发明多肽的核 苷酸序列。在一个优选例中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽或 其同源多肽。在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸选自下组(a)具有SEQ ID NO=I的核苷酸序列；(b) SEQ ID NO 1核苷酸序列的同源序列；或(c)在严格条件下，能与(a)-(b)中任一种核苷酸序列杂交的序列。在一个优选例中，所述多核苷酸选自SEQ ID NO :1的核苷酸序列、在严格条件下 能与SEQ ID NO :1的核苷酸序列杂交的序列、或与(a)-(b)中任一种核苷酸互补的序列。在本发明的第三方面中，提供了一种载体，它含有本发明所述的多核苷酸。在一个优选例中，所述载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺 乳动物细胞病毒，优选 pCAMBIA1301、pEGFP-l、pBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301 或 pHB， 更优选pHB。在本发明的第四方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明的载 体或基因组中整合有本发明的多核苷酸。在一个优选例中，所述宿主细胞选自原核细胞、低等真核细胞或高等真核细胞，优 选细菌细胞、酵母细胞或植物细胞，更优选大肠杆菌、链霉菌、农杆菌、酵母菌，最优选农杆 菌，所述农杆菌包括但不限于GV3101、EHA105、S0UP1301或C58，优选GV3101。在本发明的第五方面，提供了本发明RACKlb蛋白或多核苷酸的抑制剂。在一个优选例中，所述抑制剂是小分子干扰RNA或反义寡核苷酸。在本发明的第六方面，提供了一种提高植物抗旱耐盐性的方法，所述方法包括抑 制本发明RACKlb蛋白或多核苷酸的表达。在另一优选例中，所述抑制采用缺失、突变、RNAi、反义或显性负调节方法进行。在一个优选例中，所述抑制包括使得本发明的蛋白或多核苷酸序列发生一个或多 个氨基酸或核苷酸的取代、缺失或添加，从而使得所述植株具有提高的抗旱耐盐性。在另一优选例中，所述抑制是将T-DNA插入所述序列中，从而使得含有该突变序 列的植株具有提高的抗旱耐盐性。
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在另一个优选例中，所述方法包括将本发明的抑制剂作用于植物。在另一优选例中，所述抑制包括用含有针对本发明序列的小分子干扰RNA的载 体或含有所述载体的宿主细胞转化植物。在另一优选例中，所述方法还包括使得通过上述方法获得的具有提高抗旱耐盐性 的植株与非转基因植物或其它转基因植物杂交。 在另一优选例中，所述盐是指氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。在本发明的第七方面中，提供了一种筛选抗旱耐盐性植株的方法，所述方法包 括(i)检测候选植株中本发明RACKlb蛋白或多核苷酸的表达水平；(ii)将步骤(i)所检测到的候选植株中的表达水平与野生型植株中相应的表达 水平相比，如果候选植株中的表达水平较野生型植株有所降低，则表明所述植株是抗旱耐 盐性植株。在一个优选例中，所述盐是指氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。在本发明的第八方面中，提供了本发明所述的抑制剂在提高植物抗旱耐盐性中的 用途。在一个优选例中，所述抑制剂是针对本发明序列的小分子干扰RNA或反义寡核苷酸。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1 部分植物RACKl同源蛋白的序列比对。图2 =Atracklb突变体的鉴定。其中，图2A 突变体中T-DNA的插入位置和方向。 图2B =RT-PCR检测RACKlb基因的表达情况。图3 无菌培养的Atracklb突变体在盐胁迫条件下的表型观察。其中，图3A 正 常培养条件(MS培养基)下生长8天的幼苗；图3B =MS培养基上正常生长三天，后移至含 150mM NaCl的MS培养基上再生长5天的幼苗。Col 野生型拟南芥；racklb =Atracklb突 变体。图4 土壤种植的Atracklb突变体在盐胁迫条件下的表型观察。其中，图4A =NaCl 处理前，土培一周的植株；图4B 土培一周后，经50、100、150mM NaCl溶液依次处理3周的 植株。图5 =Atracklb突变体的在干旱胁迫下的表型观察。其中，图5A 正常供水条件下 生长3周的拟南芥小苗；图5B 干旱处理3周的拟南芥小苗；图5C 干旱处理3周后复水3 天后的拟南芥小苗。
具体实施例方式本发明人通过长期而深入的研究，发现RACKlb蛋白在植物响应胁迫的反应中有 副调控作用，racklb基因缺失突变后提高了植物抗旱耐盐性。在水稻、番茄、玉米、大豆、油 菜、烟草等植物中均有与拟南芥RACKlb蛋白高度同源的RACKlb蛋白序列，因此通过干扰
5RACKlb同源基因可提高水稻等作物的抗旱盐性，从而用于植物品种的改良。在此基础上，发 明人完成了本发明。具体而言，AtRACKlb蛋白是在比较拟南芥盐敏感突变体(Atcbll缺失突变体)蛋 白质组变化过程中发现的，该蛋白在Atcbl 1缺失突变体中上调表达。因此推测该蛋白在 拟南芥以及其他植物中可能参与了抗盐、抗旱的反应，并且对植物抗盐抗旱具有副调控的 作用。发明人利用T-DNA插入法获得了拟南芥racklb突变体纯系，这些突变体中几乎没 有相应基因的表达。利用所得的突变体进行拟南芥抗旱耐盐性试验，结果显示突变体的抗 旱耐盐性较野生型有较明显的改善。通过上述研究表明=RACKlb基因是拟南芥抗旱耐盐的 负调控因子，其表达抑制可增强植物对盐或干旱胁迫的抗性。序列比对研究还表明RACKlb同源蛋白普遍存在于植物中，例如水稻、番茄、玉米、 大豆、油菜、烟草、苜蓿、杨树等作物和经济植物，这些蛋白质的序列具有高度的相似性。由 此，可推测这些植物的RACKlb同源基因具有与拟南芥RACKlb基因相似的功能，其对植物抗 旱耐盐性的负调控作用可用于生产对盐胁迫和干旱抗性明显提高的转基因植物。RACKlb蛋白或多肽及其编码序列在本发明中，术语“RACKlb蛋白或多肽”、“RACKlb基因编码的蛋白质或多肽”或 “锌指蛋白转录因子”是指由本发明的RACKlb基因编码的蛋白质或多肽、它们的保守性变异 多肽、或其同源蛋白或多肽。RACKlb蛋白的基本结构(如WD40重复结构单元、β-螺旋桨 结构)，且所述蛋白或多肽表达受到抑制后，可提高植物干旱或盐胁迫抗性。所述RACKlb蛋白质或多肽的序列可选自(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多 肽；(b)将SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成 的，且其受到抑制后植物抗旱耐盐性提高的由(a)衍生的多肽；或(c)具有提高植物抗旱耐 盐性的(a)和(b)中所述多肽的同源多肽。本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重 组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本 发明中RACKlb蛋白或多肽优选由拟南芥、水稻、番茄、玉米、大豆、油菜、烟草、苜蓿、杨树等 RACKlb基因或其同源基因或家族基因编码。本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50 个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个 以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或 相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或 N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的RACKlb 蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有对植物抗旱耐盐性的副调 控活性。本领域技术人员可根据本领域常识和/或常规试验很容易地确定这些变异方式， 而不会影响蛋白或多肽的活性。在本发明中，“保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多20 个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸 所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生
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如本文所用，术语“RACKlb基因”或“植物RACKlb基因”可互换使用，均是指一种 编码本发明所述的RACKlb蛋白或多肽的序列，其与拟南芥RACKlb基因序列(参见SEQ ID NO 1)可高度同源或在严格条件下与所述基因序列杂交的分子或与上述分子高度同源的
7家族基因分子，所述基因表达受到抑制对植物干旱或盐胁迫抗性具有一定的改善作用。在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸是(a)具有SEQ ID NO 1的核苷酸序 列；(b)SEQ ID NO :1核苷酸序列的同源序列；或(c)在严格条件下，能与(a)-(b)中任一种 核苷酸序列杂交的序列，优选与(a)-(b)中任一种核苷酸序列互补的多核苷酸。如本文所用，术语“严格条件”是指⑴在较低离子强度和较高温度下的杂交和 洗脱，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵杂交时加有变性剂，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优 选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。本发明的RACKlb基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或 人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开 放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制 备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR 扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。应理解，本发明的RACKlb基因可获自拟南芥，获自其它植物的与拟南芥RACKlb 基因高度同源(如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以 上、80%以上，更优选85%以上如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也 在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如 BLAST。植物及其对盐和/或干旱胁迫的抗性如本文所用，所述的“植物”包括(但不限于)禾本科植物、锦葵科棉属植物、十 字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物等，优选所述植物为禾 本科植物，更优选为禾本科作物。例如，所述植物可选自水稻、番茄、玉米、大豆、油菜、烟 草、苜蓿、杨树、小麦、大麦、甘蔗、高粱、拟南芥、棉花或油菜，更优选水稻、番茄、玉米、大豆、 油菜或烟草。如本文所用，术语“作物”或“经济植物”是指在粮、棉、油等农业和工业中具有经 济价值的植物，其经济价值可体现在该植物的种子、果实、根、茎、叶等有用部位上。作物或 经济植物包括但不限于双子叶植物或单子叶植物。优选的单子叶植物为禾本科植物，更优 选水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。优选的双子叶植物包括但不限于锦葵科棉属植物、十字 花科芸苔属植物、锦葵科棉属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选禾 本科植物，更优选拟南芥、烟草和番茄等。如本文所用，术语“盐胁迫”是指指植物在含有高浓度盐分的土壤或者水体中生 长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。造成盐属胁迫的盐类包括(但不限于)氯 化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。本发明的RACKlb基因或其编码的蛋白质或多肽受到抑 制可增强植物对盐胁迫的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述基因、蛋白质或多肽抑 制处理的对照植物(例如野生型植物)相比所述植物在高浓度盐分存在下的生长发育未 受影响或受影响程度降低、或可在更高的盐浓度下存活。如本文所用，术语“干旱胁迫”是指植物在缺水的土壤或者其它干旱环境中生长 时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。本发明的RACKlb基因或其编码的蛋白质或多
8肽受到抑制可增强植物对干旱胁迫的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述基因、蛋白 质或多肽抑制处理的对照植物(例如野生型植物)相比所述植物在缺水条件下的生长发 育未受影响或受影响程度降低、或可在更干旱的条件下存活。提高棺物抗旱耐盐件的方法如本文所述，本发明的RACKlb蛋白或其编码序列与植物的抗旱耐盐性有密切的 联系=RACKlb蛋白或其编码序列受到抑制，则植物的抗旱耐盐性有所提高。因此，本发明还 提供了通过抑制RACKlb蛋白或其编码序列来提高植物抗旱耐盐性的方法。在本发明的一个实施方式中，可通过使用本发明RACKlb蛋白或其编码序列的抑 制剂来抑制其表达。所述抑制剂包括但不限于小分子干扰RNA、显性负调节或反义寡核苷 酸。本领域普通技术人员在知晓了 RACKlb蛋白及其编码序列的前提下，可通过常规 方法和试验筛选并获得所述的抑制剂。例如，可根据本领域中已知的常规方法设计和制备 针对RACKlb的反义寡核苷酸，其包括反义RNA、反义DNA及核酶，它们通过人工合成和生物 合成获得(可参考袁守军等，反义药物设计方法研究进展，解放军药学学报，第20卷第2 期ppl26-129 ；或使用计算机软件 RNAstructure 3. 7)。又例如，本领域普通技术人员可通过QIAGEN的商业化siRNA设计和合成服务 ("4-for Silencing siRNA duplexes”(QIAGEN News，2003 年 9 月第 3 期第 55-56 页， http://wwwl.qiagen.com/literature/qiagennews/0303/1024467_low.pdf)获得针对 RACKlb的小分子干扰RNA ；或采用本领域中已知的方法和软件来自行设计siRNA(参见 http //www. ebiotrade. com/newsf/2004-3/B200431216301. htm, RNAi 技术路线选择及应 用，2004 年 3 月 12 日；Status of siRNA Design Software, http//i. cs. hk/ sirna/ software/status, php)。在本发明的另一个实施方式中，可通过本领域已知的方法使得本发明的RACKlb 蛋白或其编码序列发生非保守性突变。如本发明所用，术语“非保守性突变”是指使得本发 明的RACKlb蛋白或其编码序列发生一个或多个氨基酸或核苷酸的取代、缺失或添加(优选 为非保守)，从而使得所述植株具有提高的抗旱耐盐性。例如，可通过插入T-DNA产生不表达RACKlb蛋白或其表达受到抑制的RACKlb编 码序列突变体，从而使得含有该突变序列的植株具有提高的抗旱耐盐性。还可采用辐射或 暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获 得上述突变蛋白质或多肽。可通过本领域中构建转基因植物的常规方法(例如农杆菌转化、基因枪转化、叶 盘法)来构建不表达RACKlb蛋白或其表达受到抑制的转基因细胞、组织器官或植物。对于 转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗病性提高的植物。可 通过观察该转基因植物的抗旱耐盐性是否发生变化来筛选和鉴别具有所需性状的植株。任 选地，可用所述转基因植物与非转基因植物或其它转基因植物杂交，以进一步改良植物的 性状。本发明的优点1.通过研究揭示了拟南芥中AtRACKl基因及其在水稻、玉米、番茄、苜蓿、杨树等 作物和经济植物中的同源基因在植物抗盐反应中，具有副调控作用，该基因突变后能够提
9高植物对高浓度盐胁迫的抗性。2.基于以上发现，可通过基因干扰和/或转基因的手段，构建抗旱耐盐的作物，其 在抗性育种上具有应用前景。
实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(例如可参照 如Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第三版，英文名称为《Molecular Cloning =A Laboratory Manual)) (2001, Cold Spring Harbor Laboratory press) SKi^MftjlJiar-ISiBf 建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.拟南芥的种棺1.拟南芥的无菌培养将种子在消毒酒精中浸3min，10%漂水中浸15min，用无菌水冲洗5次。将种子均 勻铺在MS固体培养基上，在4°C春化3天后放白光下生长。植物生长环境为相对湿度60 %，恒温20_22°C，光照周期14h (光)/8h (暗)，光 照强度 200 μ mo 1 HT2s-1。2.拟南芥的土壤种植将在MS固体培养基上生长约一周的幼苗移栽到浸含营养液的人工土壤中，转入 人工气候室中培养。幼苗上覆保鲜膜3天，待苗生长正常后揭去。人工土壤蛭石、泥炭土和珍珠岩(7:2:1)。营养液10g/10L花无缺(购自上海永通化工有限公司，溶剂为水)。实施例2. AtRACKlb序列以及其与其它植物的同源比对1. AtRACKlb 序列RACKlb cDNA 序列(AT1G48630. 1)如 SEQ ID NO 1 所示，其长度为 981bp。RACKlb 氨基酸序歹Ij (NP_850612. 1)如 SEQ ID NO 2 所示，其长度为 326aa。2. AtRACKlb同源基因的蛋白序列比对拟南芥中有三个RACKl基因，分别为AtRACKIA，AtRACKlb和AtRACKIC。用 AtRACKlb氨基酸序列在NCBI中同源搜索。图1所示为部分植物RACKl同源蛋白的序列比对。比对结果证明=AtRACKlb氨基酸序列在水稻、番茄、玉米、大豆、油菜、烟草等植物 中均有高度同源蛋白序列。实施例3. racklb突变体的鉴定拟南芥 T-DNA 插入突变体种子从 ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)购得。将购得的突变体种子铺于MS固体培养基上，一周后移植到土壤里，转入人工 气候室中继续培养三周左右。取幼苗的叶子，提取基因组DNA。用PCR的方法(PCR具体条
10件为95°C 2min ；40 个循环的 95°C 15sec，56°C 15sec 和 72°C 30sec ；72°C lOmin)，采用如 下方法检测植株是否含有T-DNA插入和是否为纯系步骤一用通用的T-DNA左界引物(LBal)和基因特异性引物(RP)这对引物，以全 部待选植株的基因组DNA做模板进行PCR，如能扩出目的条带，则留下此基因样本。步骤二 再用一对基因特异性引物(LP和RP)，对第一步筛选后保留的基因样本进 行PCR，如不能扩出目的条带，保留此基因样本。这些是最终筛选到的含有T-DNA插入且插 入纯合的植株。用Trizol (上海华舜)提取其RNA，用RT-PCR的方法检测基因下调表达的效果。 反转录试剂为Rever-Tra Ace M-MLV RTase (Τ0Υ0Β0，日本)，RNA反转录方法参考TOYOBO的 ReverTra Ace 一步法。所用到的引物如下T-DNA 左界引物(left border primer, LBal)TGG TTC ACG TAG TGG GCC ATC G(SEQ ID NO 3)；RACKlb特异性引物LP AGCTGATGGTCACAAGGAATG(SEQ ID NO :4)，RACKlb特异性引物RP CAAAATATCACATTTGTGGATTCT (SEQ ID NO :5)。RT-PCR 引物:5-GCTGATGGTCACAAGGAA-3(SEQ ID NO 6)；5-TCCGATTCCAGTAGAACC-3(SEQ ID NO :7)。试验结果如图2所示。结果显示T-DNA插入在RACKlb基因的内含子上，并且导 致目标基因无法表达。该结果表明racklb突变体(SALK_145920)植株体内的目标基因无法表达，可用 于后序的观察表型和胁迫处理实验。实施例4.盐胁迫试验1.无菌培养条件下的盐胁迫试验按照实施例1第1部分所述的方法在无菌条件下培养野生型和突变体拟南芥。将 铺于MS上的拟南芥种子(Col 野生型拟南芥；racklb =Atracklb突变体(由实施例3中获 得)见光三天后，移到含150mM NaCl的培养基上继续生长，5天后拍照记录。试验结果如图3中的照片所示。结果显示正常条件下，racklb与野生型Col生 长状况差异不明显，而在150mM NaCl条件下，racklb生长好于野生型，表现为野生型Col小 苗叶片发黄，racklb突变体叶色比野生型Col绿，存活率高(图3A)。2. 土壤种植条件下的盐胁迫试验按照实施例1第2部分所述的方法在土壤中种植野生型拟南芥和突变体拟南芥。 用NaCl处理在土壤中生长一周的幼苗，方法为依次用50mM NaCl溶液处理一周，IOOmM NaCl溶液处理一周，150mM NaCl溶液处理一周。处理三周后拍照记录。试验结果如图4中的照片所示。结果显示正常条件下，racklb生长与野生型Col 生长无明显差异。在高盐条件下，野生型Col已经枯死，而racklb生长仅受到部分抑制，明 显好于野生型Col。
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3.结论上述试验结果表明=Atracklb基因缺失突变后提高了植物对盐的抗性，证实了拟 南芥RACKlb蛋白在植物响应盐胁迫的反应中有副调控作用。实施例5.干旱胁迫试骑按照实施例1第2部分所述的方法，将在MS培养基上萌发5天后的野生型拟南芥 和突变体拟南芥小苗转移到土壤中，浇水并恢复生长3天。3天后停止浇水，开始干旱胁迫 处理，处理3周后拍照记录，浇水恢复后3天再次拍照记录。试验结果如图5中的照片所示。结果显示正常条件下，racklb生长与野生型Col 生长无明显差异。干旱3周后，Col和racklb均有萎蔫症状，但是racklb生长状态更好。 恢复浇水3天后，Col全部死亡，而racklb则可恢复正常生长。上述试验结果表明=Atracklb基因缺失突变后提高了植物对干旱的抗性，证实了 拟南芥RACKlb蛋白在植物响应干旱胁迫的反应中有副调控作用。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>RACKlb基因对植物抗旱耐盐性的副调控作用及应用<130)092438<160>7<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>981<212>DNA<213> 拟南芥(Arabidopsis sp.)<220><221>CDS<222>(1). . (981)<400>1atg get gaa gga ctc gtg ttg aaaMet Ala Glu Gly Leu Val Leu Lys15atg gtc acc gcc att get aca ccgMet Val Thr Ala lie Ala Thr Pro20act tcg tcg cgt gac aaa tea ateThr Ser Ser Arg Asp Lys Ser lie3540
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1权利要求
一种植物蛋白激酶C受体1b蛋白，即RACK1b蛋白，其包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、其保守性变异多肽、或其同源多肽。
2.如权利要求1所述的RACKlb蛋白，其特征在于，所述蛋白选自下组(a)具有SEQID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形 成的，且受到抑制后植物抗旱耐盐性提高的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)和(b)中所述多肽同源、且其受到抑制后植物抗旱耐盐性提高的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，它包含编码本发明多肽的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其选自下组(a)具有SEQID NO 1的核苷酸序列；(b)SEQID NO 1核苷酸序列的同源序列；或(c)在严格条件下，能与(a)-(b)中任一种核苷酸序列杂交的序列。
5.一种载体，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，它含有权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利 要求3所述的多核苷酸。
7.权利要求1所述RACKlb蛋白或权利要求3所述的多核苷酸的抑制剂。
8.一种提高植物抗旱耐盐性的方法，所述方法包括抑制权利要求1所述RACKlb蛋白或 权利要求3所述的多核苷酸的表达。
9.一种筛选抗旱耐盐性植株的方法，所述方法包括(i)检测候选植株中权利要求1所述RACKlb蛋白或权利要求3所述的多核苷酸的表达 水平；(ii)将步骤(i)所检测到的候选植株中的表达水平与野生型植株中相应的表达水平 相比，如果候选植株中的表达水平较野生型植株有所降低，则表明所述植株是抗旱耐盐性 植株。
10.权利要求7所述的抑制剂在提高植物抗旱耐盐性中的用途。
全文摘要
本发明提供了RACK1b基因对植物抗旱耐盐性的副调控作用及其应用。本发明具体涉及RACK1b蛋白、其编码序列RACK1b基因、以及它们的抑制剂。本发明还涉及提高植物抗旱耐盐性的方法和提供具有高抗旱耐盐性的转基因植物的方法。本发明提供了改善和研究植物抗旱耐盐性的新方法，具有广阔的应用前景。
文档编号C07K14/705GK101899107SQ20091005212
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者史杉杉, 孙卫宁 申请人:中国科学院上海生命科学研究院