一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用的制作方法

专利名称：一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用的制作方法
一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用。背景技术：
避孕原理，就是用科学的方法来阻止和干扰正常受孕过程中的某些环节，以避免 怀孕，防止生育。目前所采用的避孕方法很多，国内外用于免疫节育的现有技术有①抗促 性腺激素释放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)疫苗；②抗卵透明带(ZP) 蛋白疫苗；③抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗；④抗精子表面抗原疫苗。以上避孕方法存 在内分泌平衡和性功能紊乱、引起自身免疫性疾病、节育效果差等缺点。

发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种免疫避孕的嵌合肽。本发明的再一的目的是，提供一种免疫避孕的合成肽hESP1(l3_1Q7。本发明的另一的目的是，提供一种免疫避孕的合成肽hIZUmo216_22(1。本发明的另一的目的是，提供嵌合肽，合成肽hESP1(13_1OT和合成肽Izumo216.的用 途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种免疫避孕的嵌合肽，其氨基酸序 列如序列表中SEQ ID 1所示。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种免疫避孕的合成肽ESP， 其氨基酸序列如序列表中SEQ ID 2所示。所述，免疫避孕的合成肽hESP1(13_112，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID :4所示。所述，免疫避孕的合成肽hESP98_112，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID :5所示。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种免疫避孕的合成肽 hIZumo216_22(1，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID 3所示所述，免疫避孕的合成肽hIZumo212_221，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID 6所示。所述，免疫避孕的合成肽hIZumo212_227，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID 7所示。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是嵌合肽，合成肽hESP1Q3_1Q7或合成肽Izum0216_22Q作为免疫避孕疫苗，在避孕中的应 用。需要说明的是，SEQID :1 序列是 NCAYKTTQANK GGG TGGFTPEIGK GGGTSIERLTETK GGG KGKEATLTKP ；SEQ ID :2 序列是 TGGFT ；SEQ ID :3 序列是 ATLTK ；SEQ ID :4 序列是 TGGFTPEIGK ；SEQ ID 5 序列是 TTTFPTGGFTPEIGK ；SEQ ID 6 序列是 KGKEATLTKP ；SEQ ID 7 序列是 KGKEATLTKPMVGPED。本发明优点在于1，发明了精子蛋白hESP与UU436蛋白之间存在交叉反应抗原；2，发明了短肽hESP1Q3_1Q7具有抗生育作用；
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3，发明了人精子蛋白hlzumo与UU474蛋白之间存在交叉反应抗原ATLTK ；4，发明了短肽hIZumo212_227具有抗生育作用，而UU474蛋白没有明显抗生育作用；5，本发明首次研究了由精子蛋白hESP、hlzumo和tNASP与UU的交叉反应抗原组 成的嵌合肽，免疫小鼠后可以产生较强的可逆性的抗生育效果。

图1 十五肽ppl/pp2/pp3/pp4的原核融合表达，十五肽ppl/pp2/pp3/pp4重组融 合表达载体pTSA18-stv，通过E. coli原核表达后，经15% SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染 色。泳道M 蛋白markers ；泳道1 诱导前全菌裂解物；泳道2，3，4，5 依次为ppl/pp2/pp3/ PP4诱导后全菌沉淀裂解物。图2 =Western blot 分析鉴定融合表达十五肽 ppl-stv/pp2-stv/pp3-stv/ pp4-Stv交叉反应性，泳道0 空载体pTSA18-stv诱导全菌裂解物；泳道1，2，3，4 依次 为融合肽段pp l-stv/pp2-stv/pp3-stv/pp4-stv诱导后全菌裂解物，上样量2 μ 1/孔， 兔 anti-mESP-Pl 多抗，1 8000 ；泳道 5，6，7，8 依次为肽段 ppl-stv/pp2-stv/pp3_stv/ pp4-Stv诱导后全菌裂解物，上样量2μ 1/孔，兔免疫前血清，1 8000。图3 :rUU436蛋白的原核表达纯化，rUU436蛋白原核表达，亲和层析纯化后，分段 收集各部洗脱液，经15% SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色，泳道M 蛋白marker ；泳道1 最后洗脱液即蛋白样品；泳道2-5 前段洗脱液，含较多杂蛋白。图 4 =Western blot 分析鉴定 rUU436 蛋白与 anti-rmESP-Pl 交叉反应性，rUU436 蛋白，经15% SDS-PAGE分离后转PVDF膜，与兔anti-mESP-Pl免疫反应，ECL显示。泳道1， 2 兔anti-mESP-Pl多抗1 8000 ；泳道3，4 兔免疫前血清；泳道2，4 :rUU436蛋白；泳道 1，3 无抗原样品。图5 =ELISA检测免疫后小鼠血清中抗合成肽hESP98_112和抗rUU436抗体，合成肽 hESP98_112及rUU436蛋白免疫小鼠抗血清及免疫前血清作为一抗，1 100稀释，测定吸光值。图6 =ELISA检测合成肽hESP98_112免疫后兔兔血清中anti-p印tide抗体效价。图 7A :ffestern-blot 验证兔 anti-p印tide 抗体交叉反应性，泳道 1，3 :rUU436 ； 泳道2,4 :rmESP-Pl ；泳道1，2 兔anti-p印tide抗体，1 2000 ；泳道3,4 兔免疫前血清， 1 2000。图7B :ffestern-blot验证兔anti-p印tide抗体交叉反应性，泳道1，2 人精子蛋 白提取物；泳道3，4 小鼠精子蛋白提取物；泳道1，3 兔anti-p印tide抗体，1 2000 ；泳 道2，4 兔免疫前血清，1 2000。图 8 :ffestern-blot 验证兔 anti_rUU436 抗体交叉反应性，泳道 1，4 :rUU436 ；泳 道2，5 :rmESP-Pl ；泳道3，6 小鼠精子蛋白提取物；泳道1,2,3 小鼠anti_rUU436抗体， 1 2000 ；泳道4，5，6 小鼠免疫前血清，1 2000。图9 竞争性ELISA验证共同抗原TGGFT为BCE。图10 间接免疫荧光技术检测兔anti-p印tide抗体与人精子免疫反应(标尺= 5 μ m)，A，B，C:兔抗-ρ印tide免疫后血清，1 50 ;A1，Bi，Cl 兔免疫前血清；FITC标记的 羊抗兔IgG(l 500)检测，激光扫描共聚焦显微镜观察；A，A1:荧光图像；B，B1:光镜图像；C，Cl 荧光与光镜复合图。图11 间接免疫荧光技术检测兔anti-p印tide抗体与小鼠精子免疫反应(标尺 =54!11)^，8，(兔抗- 印衍(16免疫后血清，1 50 ;A1，Bi，Cl 兔免疫前血清；FITC标记 的羊抗兔IgG(l 500)检测，激光扫描共聚焦显微镜观察；A，Al:荧光图像；B，Bi:光镜图 像；C，Cl:荧光与光镜复合图。图12 间接免疫荧光技术检测小鼠anti-rUU436抗体与小鼠精子免疫反应(标 尺=5μ )，A，B，C 小鼠anti-rUU436免疫后血清，1 50 ；Al, Bi，Cl 小鼠免疫前血清，
1 50 ;FITC标记的羊抗兔IgG(l 500)检测，激光扫描共聚焦显微镜观察；A，Al 荧光图 像；B, Bl 光镜图像；C, Cl 荧光与光镜复合图。图13 抗合成肽hESP98_112抗体及抗rUU436抗体对小鼠体外精-卵黏附影响。图14 抗合成肽hESP98_112抗体及抗rUU436抗体对小鼠体外精-卵融合影响。图15 兔抗合成肽抗体对小鼠体外精_卵相互作用影响，获能小鼠精子用兔抗合 成肽抗血清(1 10)预处理后，与小鼠去透明带卵子共孵育，经Hoechst33342(10yg/ml) 染色后；压片，置激光扫描共聚焦显微镜观察，左图荧光图像，右图相差图像。图16 兔免疫前血清对小鼠体外精-卵相互作用影响(对照)，获能小鼠精子用兔 免疫前血清(1 10)预处理后，与小鼠去透明带卵子共孵育，经ΗΟθ(ΛΜ33342(10μβ/πι1) 染色后；压片，置激光扫描共聚焦显微镜观察，左图荧光图像，右图相差图像。图 17 :Stv_Izumo (Izumo212_216, Izumo216_220, Izumo220_224)融合蛋白表达结果， Stv-Izumo (Izumo212_216，Izumo216_220, Izumo220_224)融合蛋白在 BL21 (DE3)细菌中获得表达，通 过15% SDS-PAGE电泳后，经考斯亮蓝染色分析。M 低分子量蛋白标准；1 Stv-Izumo220_224 ；
2:Stv-Izumo216_220 ；3 :Stv-Izumo212_216 ； 4 :Stv-3 8。图 18 =Western blot 分析 B 细胞表位，TO =Stv-β 8 不与 anti-PB 反应；Tl Stv-Izumo220_224 与 anti-PB 有弱反应；3 Stv-Izumo216_220 与与 anti—PB 有强反应；4 Stv_Izumo212_216 与 anti-PB 有弱反应。图19 目的基因片段 PCR 扩增结果，M =DNA 分子 ladder ；1 :UU474 (524bp)。图20 :UU474蛋白的表达和纯化结果，UU 474蛋白在BL21 (DE3)细菌中获得表达， 通过15% SDS-PAGE电泳后，经考斯亮蓝染色分析。M 低分子量蛋白标准；1 诱导前全菌； 2 诱导后全菌；3 经Ni2+-NTA His-柱纯化后蛋白。图21 抗血清效价滴度散点图，注抗原用96孔板包被，抗血清的效价用Anthos Zenyth 1100 Multimode酶标仪检测，Izumo212_227、UU474的抗血清在A485处吸光度的值明 显高于免疫前血清(control)。图22 =Western blot的方法验证精子蛋白Izumo与UU474蛋白之间存在 交叉反应，1 :anti-Izumo212_227IgG能够与PB蛋白发生较强的反应；2 :UU474蛋白与 anti-Izumo212_227IgG 有较弱的反应。图 23 =Western blot 验证 anti_UU474IgG 或 anti_Izumo212_227IgG 与人精子蛋白 的交叉反应，1 免疫前血清为一抗；2 :anti-Izumo212_227IgG为一抗；3 :anti_UU474IgG为一 抗。图24 人精子涂片间接免疫荧光定位，(a)anti-Izumo212_227IgG荧光染色定位；(c) 为a的自然光状态；(b)anti-⑶46IgG荧光染色定位；(d)为a和b的重叠状态(比例尺5 μ m) ο
图25 人精子涂片间接免疫荧光定位，(a)anti-UU474IgG荧光染色定位；(c)为a 的自然光状态；(b) anti-CD46IgG荧光染色定位；(d)为a和b的重叠状态(比例尺:5 μ m)。图26 人精子涂片间接免疫荧光定位(免疫前血清)(e)免疫前血清荧光染色定 位；(g)为a的自然光状态；(f)anti-⑶46IgG荧光染色定位；(h)为a和b的重叠状态(比 例尺5μπι)。图27:小鼠精卵结合与精子穿卵实验结果，获能的小鼠精子和用不同浓度稀释 的抗血清IgG及免疫前血清共孵育后，与去透明带的小鼠卵子孵育；(A)不同浓度稀释的 anti-Izumo212_227IgG的精-卵融合实验；⑶不同浓度稀释的anti_UU474IgG的精-卵融 合实验；以免疫前血清处理组为对照，精-卵融合率在共聚焦显微镜下观察。Bars代表标 准误。(N=每组卵子的数目)。 图28 ELISA检测免疫后不同时间小鼠血清中ant i-CP1抗体，以1 μ g/孔CP1包被 96孔聚苯乙烯板，免疫小鼠结束后1周及第5周、第8周自眼内眦静脉取血，血清1 100 稀释作为一抗，测450nm吸光值，设免疫前血清及对照组血清为阴性对照。图29 =ELISA检测免疫后兔血清抗CPl抗体，以1 μ g/孔CPl包被96孔聚苯乙烯 板，兔免疫后血清倍比稀释，检测兔血清中抗CPl抗体效价。图30 =ELISA检测CPl免疫后小鼠血清中各表位抗体，以0. 5 μ g/孔重组小鼠精子 蛋白rmESP-Pl、rmtNASP、rmIzumo包被96孔聚苯乙烯板，CPl免疫后血清作为一抗，1 500 稀释，测450nm吸光值，设免疫前血清为对照。结果显示CPl免疫后血清与rmESP-Pl， rmtNASP有明显免疫反应，与rmlzumo没有阳性反应。图31 :ffestern-blot分析兔抗CPl抗体与原重组原蛋白交叉反应，泳道1，4 rmlzumo ；泳道 2,5 :rmESP_Pl ；泳道 3,6 rmtNASP ；泳道 1,2,3 兔 anti-CPl 免疫后血清， 1 2000 ；泳道4，5，6 兔免疫前血清，1 2000。图32 Western-blot分析兔抗CPl抗体与精子蛋白提取物交叉反应，泳道1，3 人 精子蛋白提取物上样60 μ g/孔；泳道2，4 小鼠精子蛋白提取物上样50 μ g/孔；泳道1，2 兔anti-CPl血清，1 2000 ；泳道2,4 免疫前兔血清1 2000。图33 兔抗CPl抗体对小鼠体外精_卵黏附影响，Bars代表mean士SEM ；Bars上 方的数字代表每组平均卵子数；*P < 0. 05。图34 兔抗CPl抗体对小鼠体外精_卵融合影响，Bars代表mean士SEM ；Bars上 方的数字代表每组平均卵子数；*P < 0. 05。图35 兔抗CPl抗体对小鼠体外精-卵相互作用影响，获能小鼠精子用兔抗CPl抗 血清(1 10稀释)预处理后，与超排小鼠卵子共孵育，经Hoechst 33342(10yg/ml)染色 后；压片，置激光扫描共聚焦显微镜观察，左图荧光图像，右图相差图像。图36 兔免疫前血清对小鼠体外精-卵相互作用影响(对照)，获能小鼠精子用兔 免疫前血清(1 10稀释)预处理后，与超排小鼠卵子共孵育，经Hoechst33342(10yg/ml) 染色后；压片，置激光扫描共聚焦显微镜观察，左图荧光图像，右图相差图像。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作详细说明。
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实施例1ESP蛋白与溶脲脲原体交叉反应抗原对生育的影响一，材料1. 1实验动物及标本6月龄(体重约为2. 5kg)雌性新西兰大白兔，BALB/c小鼠(8 12W)由上海交通 大学医学院动科部购自中科院实验动物中心，正常人精液标本由上海交通大学医学院附属 仁济医院人类精子库门诊提供。1. 2主要试剂寡核苷酸序列及多肽由上海生工生物技术公司合成，钥孔血蓝蛋白(KLH)购自上 海生工生物技术公司。质粒PTSA18购自上海市计划生育科学技术研究所。2. 2. 1. 3 实验仪器 Mini Protean 3system SDS-PAGE 电泳仪和 MiniSemi-Dry Trans Blot 转膜仪(Bio-Rad)，LSM-5IO 激光共聚焦显微镜((CarlZeiss LSM-510, Jena, Germany) ；Centrifuge 5415R低温离心机(Eppendorf) ；CO2培养箱(SANYO)；全自动精液分 析仪(Hamilton-Thorn)。二，方法2. Iffestern blot 鉴定 ESP7_242 与 UU 交叉反应抗原1.化学合成寡核苷酸单链化学合成hESP蛋白中十五肽(包含共同五肽，下划线标识)编码寡核苷酸序列正 义链、反义链各 10D。ppl :QVLENLVRSVPSGEP(aa38~52)pp2 :STENDVLTNPISEET (aa84~98)pp3 :TTTFPTGGFTPEIGK(aa98-112)pp4 :NVSIVLHAEEPYIEN(aa!28~142)两端分别加上Sail和BamHI酶切位点黏性末端。2.退火正义链，反义链各取10μ 1，终浓度5yM，95°C 5min变性，自然恢复到室温退火。3.构建重组十五肽融合表达载体退火产物连接双酶切过的载体pTSA18_stv。反应体系如下pTSA18-stv Ιμ ，退 火产物 5 μ 1，Ligation Solution Buffer 1. 5 μ 1，T4DNA 连接酶 1 μ 1，dd H2O 6. 5 μ L· 总 反应体系为15 μ 1。16°C孵育8h。取连接产物5 μ 1转化Ε. coli DH5a感受态菌，取100 μ 1转化产物均勻涂布于含 Amp的LB固体培养基平皿。37°C培养12 14h。挑出单个菌落至5mlLB培养基(含Amp) 中。将试管在摇床中以250rpm，37°C摇菌过夜。取过夜菌1. 5ml用质粒小量抽提试剂盒进 行抽提质粒，即获得重组融合表达载体。4.诱导融合表达十五肽取1 μ 1小抽质粒转化BL21 (DE3)感受态菌，转化产物均勻涂布于含Amp的LB固 体培养基平皿。37°C培养12 14h。挑出单克隆菌落至已加入5ml LB培养基(含Amp)的试管中。将试管在摇床中以 250印111，371摇菌过夜。取过夜菌10(^接种到5ml LB培养基(含Amp)的试管中，280rpm， 37°C摇菌至OD值0.6 0.8，超净台中取出Iml菌液作为阴性对照。加入ImM IPTG 37°C继续摇菌4h诱导表达。设空载质粒为对照。取Iml诱导后菌液及诱导前菌液离心6000g 5min，浙干培养基获取沉淀即菌体， 加入400 μ 1 ddH20重悬细菌沉淀，取20μ 1全菌蛋白样品加入5μ 15Χ变性蛋白上样缓冲 液，经95°C，IOmin变性，；15% SDS-PAGE，120V恒压电泳约2h，直到染料走到胶底。考马斯亮蓝R-250染色，脱色液脱色至条带清晰，观察诱导表达结果。5. Western blot分析融合表达十五肽与抗mESP-Pl抗体交叉反应性取2μ1全菌蛋白样品进行15% SDS-PAGE，按前述实验方法转PVDF膜，进行 Western blot分析。以抗mESP蛋白重组片段Pl抗体(anti-mESP-Pl)为一抗，设空载质粒 诱导表达产物及诱导前全菌蛋白为阴性对照。检测抗anti-mESP-Pl抗体与上述十五肽的 交叉反应情况。2. 2合成短肽十五肽TTTFPTGGFTPEIGK(hESP98_112)由上海生工生物技术公司合成。部分耦联KLH 作为抗原免疫动物，少量不耦联KLH作为抗原用于EILSA检测抗体效价。2. 3克隆、表达rUU436蛋白取血清-8型UU培养产物，用水煮法(95°C，10min)获得其总DNA作为模板。由于 TGGFT位于UU436蛋白aa90_94，截短蛋白片段克隆表达aa78_246 (UU43678_246)，包含TGGFT， UU43678_246 的 PCR扩增弓丨物 sense 5，GC~GGATCCattaaaaattttgttatagctgat3，，antisense 5’GC-CTCGAGttcatRcttttRtaaaaatatcat 3，，目标片段长 507bp。GGATCC 为 BamH I 酶切位 点，CTCGAG为Xho I酶切位点。克隆、构建、扩增带有His标签的重组表达载体pET-28a(+)。 重组表达载体pET-28a(+)转化E. coli BL21 (DE3)，15% SDS-PAGE电泳分析确认目标蛋白 是否表达。通过Western blot分析rUU43678_246蛋白片段与anti-mESP-Pl的交叉反应性。rUU43678_246蛋白大量表达及Ni2+-NTA-His亲和层析纯化实验操作步骤按Ni-NTA 柱亲和层析试剂盒说明书对表达的重组目的蛋白进行纯化。将菌液离心lOOOOrpmX lOmin， 收取菌体沉淀。用双蒸水重悬沉淀，冰上超声破菌，再次离心IOOOOrpmX lOmin，弃上清。每 克沉淀加Lysis Buffer B 5ml，将沉淀重悬于Buffer B裂解，吸出上清备用。裂解产物上 清过Ni-NTA柱，弃滤液。Wash Buffer C洗脱柱中杂蛋白，4ml X 3次，收集每次的流出液。 Elution Buffer D洗脱柱中目的蛋白，1. 5ml X 4次，收集每次的流出液。BufferE洗脱柱中 目的蛋白，1.5mlX4次，收集每次的流出液。10ml Buffer B平衡柱子，柱子放4°C保存，可 重复使用。15% SDS-PAGE鉴定流出液中是否含有目的蛋白。2. 4抗血清制备用耦联KLH的合成肽hESP98_112作为免疫原，免疫新西兰雌性大白兔，按前述实验 方法进行，免疫接种三次，每次接种抗原量约0. Smg0第一次接种后第35天自颈动脉放血获 取免疫后血清。2. 5小鼠交配实验经过生育能力验证的BALB/c雌、雄小鼠(10 12W)用于本实验，随机分组。耦联 KLH的合成肽hESP98_112和纯化的rUU436蛋白作为免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠。每次接 种抗原量约100 μ g，共三次。具体步骤见第一章。第一次接种后第35天自眼内眦静脉取血 获取免疫后血清，并合笼交配，雌雄比例为2 1，合笼一周。定期称量雌鼠体重监测怀孕情 况，计数孕鼠产仔数。
2. 6 竞争性 ELISA参考其他实验，anti-mESP-Pl抗体1 1000稀释，与不同浓度(0. 1 ImM)合成 肽hESP98_112共孵育，37°C lh。将吸收处理后的抗体作为一抗，与预先包被重组mESP-Pl的 96孔聚苯乙烯板反应，按前述ELISA实验步骤操作。另设两组对照一组同样稀释度但未 经处理的anti-mESP-Pl抗体作为阳性对照；另一组anti-mESP-Pl抗体以不同浓度(0. 1 ImM)的重组mESP-Pl片段同样孵育吸收后作为一抗进行ELISA，测定吸光值。计算未被吸 收的残余抗体百分率。2. 7Western blot 分析重组rUU436蛋白和mESP-Pl片段及精子全蛋白提取物进行SDS-PAGE，以抗合成肽 hESP98_112(anti-p印tide)血清及抗rUU436 (anti_rUU436)血清作为一抗，按前述方法进行 Western blot,分析anti-p印tide抗体及anti_rUU436抗体的特异性及交叉反应性。2. 8人和小鼠精子涂片间接免疫荧光染色将正常人精液标本37°C，30min液化后，离心(1000g，15min)弃精浆。用45 % Percoll上层离心法分离精子，lOOOg，15min。最后用PBS重悬洗涤两次，用于制作精子涂 片。小鼠附睾尾部精子涂片制作方法如下顶体反应后精子制备10 12周龄BALB/c雄 性小鼠颈椎脱白处死，取出附睾尾部，置于预热的M16 (含3 % BSA)中，用手术剪将组织稍 微剪切后，于37°C，5% CO2培养箱中静置30min后(精子会从附睾尾部组织中自动游出)， 随后加入A23187 (5 μ Μ)继续于37°C ,5% CO2培养箱中孵育1. 5h诱导顶体反应。将上述不 同的精子即附睾尾部精子和顶体反应后精子分别涂片，室温晾干。以anti-peptide抗体及 anti-rUU436抗体为一抗，1 50稀释，以FITC标记羊抗兔IgG为二抗，进行人和小鼠精子 间接免疫荧光染色，以免疫前血清为阴性对照，实验方法预冷的丙酮固定15min。PBS柔和 冲洗。用含5% BSA的PBS于室温封闭lh。以抗P1/P2/P3兔血清为一抗，1 500稀释， 4°C孵育过夜。兔免疫前血清作为阴性对照，不加一抗的样品作为空白对照。PBS柔和冲洗， 以FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，1 500稀释，37°C孵育lh。柔和冲洗后PBS封片，激光 扫描共聚焦显微镜下观察。2. 9小鼠精子体外穿卵实验小鼠超排卵、配子准备及体外穿卵实验步骤1.卵子获取8 10周龄BALB/c雌性小鼠腹腔注射10IU孕马血清(PMSG)，48h后注射等剂量 的hCG，15 16h后从输卵管壶腹部取卵。2.精子获取及抗体处理10 12周龄BALB/c雄性小鼠颈椎脱臼处死，取出附睾尾部，置于预热M16 (含3 % BSA)中，用手术剪将附睾组织稍微剪切后，于37°C，5% CO2培养箱中静置lOmin，用上游法 制备精子悬液，调精子密度为1.0X106/ml，于37°C，5% CO2培养箱中孵育lh，加入Ca2+诱 导A23187溶液，使终浓度为5ymol/L，继续孵育20min。分别用不同稀释浓度的anti-Pi、 anti-P2、anti-P3抗血清及免疫前血清与获能精子共孵育30min。血清使用前用56°C， 30min灭活补体。3.小鼠精子体外穿卵实验将去透明带卵细胞与不同处理的精子悬液于37°C，5% 0)2培养箱中共孵育3_4h后，吸出卵细胞，去除松散地附着在卵细胞上的精子，2%多聚甲醛固定20min，PBS洗涤后 Hoechst 33342(10yg/ml)染色，37°C，15 20min ;PBS洗涤后置载玻片压片，激光扫描共 聚焦显微镜观察。倒置相差显微镜下计数黏附于卵膜的精子数，荧光镜下观察精卵融合，判 断精卵融合的标准为卵细胞内看到膨胀的精子头部或原核。实验共重复3次。抗合成肽血清及抗rUU436血清56°C 30min灭活补体，以不同稀释度1 10， 1 20,1 100与精子共孵30min。处理后精子再与去透明带小鼠卵子共孵育37°C，5 % C02，3-4h。去除松散地附着在卵细胞上的精子，2%多聚甲醛固定20min，PBS洗涤后Hoechst 33342(10μ g/ml)染色15 20min ；PBS洗涤后置载玻片压片，激光扫描共聚焦显微镜观 察。倒置相差显微镜下计数黏附于卵膜的精子数，荧光镜下观察精卵融合，判断精卵融合的 标准为卵细胞内看到膨胀的精子头部或原核。实验共重复3次。2. 10统计学分析体外实验重复三次以上，各组结果以均数士标准误(mean士SEM)表示。小鼠交配 实验产仔数以均数士标准差(mean士SD)表示。实验组与对照组差异采用团体t检验，运 用SAS6. 12软件进行统计学分析，ρ < 0. 05认为有统计学意义。三，结果IhESP与UU蛋白的共同五肽及与小鼠ESP(mESP)序列同源性比较生物信息学技术搜索Swi ss-prot数据库，分析发现hESP蛋白的N-端(aa7_243) 与UU蛋白有五个共同五肽，与对应位置的mESP序列有程度不等的同源性。hESP蛋白 aa41-45 与 UU488aal35-139 有共同五肽 ENLVR ；对应于 mESP 的 QNLIM，40% —致性，20%相 似性。hESP 的 aa87-91 与 UUO 19aal80_184有共同五肽NDVLT ；对应于mESP 的 SDVLI,60% — 致性，20%相似性。hESP的aal03-107与UU436aa90_94有共同五肽TGGFT ；对应于mESP的 TRGFT，80% —致性。hESP 的 aal23_127 与 UU301aa79_83 有共同五肽 SIKPN0 人的 CASC5 蛋 白(Cancer susceptibility candidate gene 5protein)也有五妝 SIKPN(aal582_1586), mESP为SIRPN，80 % 一致性，20 %相似性。CASC5高表达于睾丸内的精子细胞，也可在其 他组织检测到表达，因此不适合作为免疫避孕研究。hESPaal29-133与UU513aa44_48 有共同五肽VSIVL ；对应于mESP的ISVVL，60 % —致性，40 %相似性。人PKDREJ蛋白 (Polycystic kidney disease and receptorfor egg jelly-related protein)也有五月太 VSIVL(aal077-1081)。PKDREJ蛋白只表达于睾丸，可能通过形成钙离子通道启动顶体反应 而在受精过程中发挥重要作用。2交叉反应抗原鉴定化学合成包含共同五肽的十五肽PPl (含ENLVR)，PP2 (含NDVLT)，PP3 (含TGGFT)， PP4(含VSIVL)的寡核苷酸链，变性、退火后形成双链，通过酶切位点黏性末端与载体 PTSA18连接构建重组表达载体。经克隆扩增、IPTG诱导，十五肽与链霉亲和素(stv)融合 表达表达，SDS-PAGE分析诱导前后全菌蛋白显示近IlkDa处有新条带(图1)。以抗重组 mESP的Pl肽段的抗体(anti-rmESP-Pl)为一抗，以融合表达十五肽为抗原，通过Western blot分析二者的交叉反应性。结果显示PP3与anti-rmESP-Pl抗体免疫反应最强，PP3包 含hESP的aal03-107与UU436的aa90_94之间的共同五肽TGGFT ；提示共同五肽TGGFT为 交叉反应抗原(图2)。3UU436蛋白克隆表达
10
SDS-PAGE分析UU436蛋白表达，分子量19kDa，由于重组蛋白带有His标签，故实 际分子量略大于理论分子量。与诱导前细菌相比，诱导后全菌裂解物在预计位置有蛋白 表达条带，但表达量不够高，经亲和层析纯化获得目标蛋白(图3)。Western blot分析 anti-rmESP-Pl抗体与rUU436蛋白的交叉反应性，包含TGGFT的rUU436片段出现免疫反应 条带，诱导前菌总蛋白、免疫前血清对照无免疫反应条带(图4)。这个结果说明rUU436蛋 白可以与anti-rmESP-Pl抗体发生交叉反应。4合成十五肽hESP98_112及rUU436蛋白免疫后血清抗体效价检测利用化学方法合成十五肽hESP98_112，首先要预测合成肽的亲水性、抗原性及表面 可及性。为此我们用DNAstar分析软件对hESP的N-端进行分析，显示hESP98_112具备良好 的亲水性、抗原性及表面可及性。合成肽耦联KLH以增强免疫原性，免疫兔及小鼠后获得 的血清抗体经ELISA测定效价。以免疫前血清作对照，以rUU436和未耦联KLH的十五肽 hESP98_112作为抗原包被96孔ELISA板。免疫后小鼠及兔血清均产生特异性抗体，兔血清抗 体效价约1 10000 (图5，6)。5抗合成肽hESP98_112抗体及抗rUU436抗体的交叉反应性以抗合成肽hESP98_112兔血清为一抗，以rmESP-Pl、人及小鼠精子蛋白提取物为抗 原，进行Western blot分析，在目标蛋白位置处有阳性反应条带，rmESP_Pl、rUU436分子量 分别约为25kDa，24kDa，hESP和mESP理论分子量分别为38kDa，45kDa (图7A，图7B)。说明 合成肽hESP98_112产生的抗体有特异性，能识别原重组和天然蛋白mESP。以抗rUU436血清为一抗，以rUU436、rmESP-Pl及小鼠精子蛋白提取物为抗原，进 行Western blot分析，在目标蛋白位置处有阳性反应条带，rmESP-Pl、rUU436分子量分别 约为25kDa，24kDa，mESP理论分子量为45kDa(图8)。结果说明anti_rUU436抗体即能识 别rUU436蛋白，也与mESP具有交叉反应性。6交叉反应抗原TGGFT为BCE为了进一步验证UU436蛋白和hESP蛋白的交叉反应抗原TGGFT是否为BCE，以 rmESP-Pl包被ELISA板作为抗原，将不同浓度的合成肽与anti-rmESP-Pl孵育吸收后作为 一抗。另一组以同样浓度的rmESP-Pl孵育吸收抗体作为对照。测吸光值与未经吸收抗体 免疫反应的吸光值之比值计算残余抗体百分率(图9)。竞争性ELISA显示合成肽能部分 中和anti-rmESP-Pl抗体，说明合成肽具有模拟表位功能，能与anti-rmESP-Pl发生免疫反 应，TGGFT为线性BCE。7间接免疫荧光检测人射出精子和小鼠附睾尾精子涂片后，以兔anti-p印tide抗体及小鼠 anti-rUU436抗体为一抗，进行间接免疫荧光染色。结果显示人和小鼠精子赤道段有特异性 荧光信号，分别与hESP和mESP蛋白定位一致。尾部和头部其他区域没有荧光信号，免疫前 血清对照结果也是阴性的(图10，11，12)。说明合成肽hESP98_112产生的抗体能识别人和小 鼠精子内天然ESP蛋白。anti-rUU436抗体与小鼠精子蛋白ESP也具有交叉反应，但与人精 子提取物无特异性反应条带。8抗合成肽hESP98_112抗体对小鼠精_卵相互作用影响用不同浓度稀释anti-p印tide、anti-rUU36抗血清及免疫前血清处理获能小鼠 精子后，与去透明带的小鼠卵子孵育，观察经上述处理后的精子黏附卵子的能力及穿卵能 力的变化。与免疫前血清相比，1 10稀释的抗血清处理精子后，每个卵子的平均结合和融合精子数明显减少。1 20稀释的anti-p印tide抗血清也能抑制精卵融合。当稀释度增 大时，对精子与卵子的黏附和融合无显著影响(图13，14，15，16)。这一结果表明抗体抑制 作用呈浓度依赖性。不同浓度稀释的抗血清及免疫前血清处理后的精子与对照组比较，精 子活力和运动参数没有明显的变化，也没有发生精子凝集现象。9合成肽hESP98_112、UU436免疫小鼠后对生育功能影响合成肽hESP98_112免疫组雌鼠33. 3% (3/9)不育，rUU436免疫组不育率为44. 4% (4/9)，而对照组均生育。免疫组的孕鼠平均产仔数也显著低于对照组(表1)。说明合成肽 hESP98_112和rUU436蛋白免疫动物后产生了抗生育作用。表1合成肽hESP98_112及重组蛋白rUU436免疫BALB/c雌鼠后对生育影响*ρ<0·05 实施例2UU的UU474蛋白与人精子蛋白IZUMO之间交叉反应抗原的鉴定1.实验动物及取材小鼠体内、体外生殖实验都使用性成熟的且有生育史的雄性和雌性BALB/c小鼠 (由中科院上海实验动物中心提供)。6月龄(体重2. 5kg左右)雄性新西兰大白兔，购自上海交通大学医学院动物科学 部。2.主要试剂UU液体培养基和固体培养基(上海同济医院铁道部性病重点实验室)；限制 性内切酶BamHI、Hind III、EcoR I、T4DNA连接酶、凝胶回收DNA试剂盒、逆转录试剂 盒、La Taq酶(大连宝生物公司)；预染低分子量标准蛋白质Marker、低分子量标准蛋 白质Marker (Fermentas) ；Agorose (Promega)；质粒小量抽提试剂盒(上海华舜公司)； Ni2+-His柱(Qiagen) ；BCA法蛋白定量试剂盒(Pierce) ；ECL荧光染色剂、PVDF膜、抗体 纯化PROSEP-A Kit(Millipore)；完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂、anti_hCD46单克隆抗 体、Rhodamine (TRITC)羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG、FITC标记 羊抗兔IgG、孕马血清(PMSG)、M16液、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、透明质酸酶、蛋白酶K、 Hoechst33342、A23187 (Sigma)；丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Tween-20、TEMED, Tris, BSA、氯化 钠、抗生素等一般化学试剂购自上海化学试剂有限公司。3.主要仪器ND-1000紫外分光光度计(NanoDrop) ,Mastercycler 印系列PCR仪(Eppendorf)， Anthos Zenyth 1100 Multimode 酶标仪(Anthos)，凝胶图像分析系统，Mini Protean 3system SDS-PAGE 电泳仪和 Mini Semi-Dry TransBlot 转膜仪、1000/500 型电泳仪和转 移仪(Bio-Rad)，J2-21型高速离心机(Beckman)，LSM-510激光共聚焦正置双光子显微镜(Carl Zeiss)。2. 2. 2实验方法2. 2. 2. IUU 培养①将在-20 V冻存的UU标本在37 °C水浴锅中复苏。②取100 μ 1接种于pH 5. 5 6.5含有酚红和0.1%尿素的Iml UU液体培养 基中，37°C培养16 24h，观察颜色变化，指示剂由橘黄色变为橙红色，并且培养基澄清，表 明UU生长。③取100 μ 1 UU悬液转种于固体培养基中，95%空气和5% CO2, 37°C恒温箱内培 养36 72h后，在低倍镜下观察菌落呈“油煎蛋”状。④经液体培养基37°C，16 24h培养阳性后，在液体培养基中传代三次扩增。2. 2. 2. 2重组Izumo蛋白的Ig-Iike结构域(PB)蛋白的质谱鉴定①纯化的重组PB蛋白进行SDS-PAGE电泳。②考马斯亮蓝染色，脱色。③进行MALDI-T0F/T0F 质谱鉴定(Finnigan LCQ Mass spectrometer 4700Proteomics Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA)。2. 2. 2. 3用Western blot的方法鉴定Izumo与UU之间的交叉反应抗原是否是B 细胞表位①根据3 个交叉反应抗原 Izumo212_216 (KGKEA)、Izumo216_22。(ATLTK)、 Izumo220^224 (KPMVG)的肽序列设计3对互补的核苷酸基因序列，分别设计EcoRI/Hindlll的 粘性末端，3对互补的核苷酸基因序列如下Izumo212_216 (KGKEA)正义链aattcg-AAGGGTAAGGAGGCCTAA_ta反义链:agctta-TTAGGCCTCCTTACCCTT-cgIzumo216_22(l (ATLTK)正义链aattcg-GCCACCCTTACCAAGTAA_ta反义链agctta-TTACTTGGTAAGGGTGGC-cgIzumo220_224 (KPMVG)正义链aattcg-AAGCCAATGGTTGGTTAA_ta反义链agctta-TTAACCAACCATTGGCTT-cg②pTSA18_Stv 质粒双酶切反应体系10 X Buffer M 1.5 μ 1，EcoRI 1 μ 1, Hind III 1μ 1，pTSA18_Stv质粒11. 5μ 1总反应体系为15 μ 1 ；反应程序37°C孵育2h ；酶切产 物经1. 2%琼脂糖凝胶电泳验证；目的片段用胶回收试剂盒回收。③合成的3对核苷酸引物退火正义链与反义链用去离子水分别稀释成5 μ mol/ 1 ；退火反应20μ 1正义链引物、20 μ 1反义链引物，99°C孵育5min，自然降温到室温。④退火产物与双酶切的pTSA18_Stv质粒连接双酶切的pTSA18_Stv质粒1 μ 1， 退火产物 2 μ 1，Ligation Solution Buffer 1· 5 μ 1，T4DNA 连接酶 1 μ 1，dd H2O 9· 5 μ 1 ； 总反应体系为15 μ 1 ；反应程序16°C过夜。⑤转化入E. coli DH5a感受态菌连接产物转化DH5a感受态菌，转化产物均勻涂 布于含Kan的LB培养板上；37°C培养12 14h ；挑出阳性克隆至5ml LB培养基(已加Kan) 中；将试管在摇床中以300rpm，37°C孵育过夜；扩增的质粒用质粒小量抽提试剂盒进行抽提。⑥转化入E. coli BL21 (DE3)感受态菌取1 μ 1小抽质粒转化入BL21 (DE3)感受
13态菌中，转化产物均勻涂布于含Kan的LB培皿；37°C培养12 14h ；在超净工作台中，挑 出阳性单克隆菌至已加入5mlLB培养基(已加Kan)的试管中；将试管在摇床中以300rpm， 37°C孵育5h ；扩增的质粒用质粒小量抽提试剂盒进行抽提；小抽质粒经PCR验证后，送上海 华大基因公司测序。⑦诱导表达 Stv-Izumo (Izumo212_216，Izumo216_220, Izumo220_224)融合蛋白取经测序 验证的各菌液100 μ 1分别加入5ml LB培养基(已加Kan)的试管中；将试管在摇床中以 300rpm，37°C孵育3h，测得OD值为0. 5，在超净工作台中取出Iml菌液为诱导前对照；在剩 余的菌液中加入4 μ 1 IPTG，在摇床中以280rpm，37°C孵育4h后取诱导后菌液Iml ；诱导前 与诱导后菌液离心13000rpm，30sec ；离心后弃上清，加300 μ 1 dd H2O重悬；取诱导前全菌 液、诱导后全菌液各80 μ 1，加5X sample buffer 20 μ 1，95°C孵育IOmin变性，上样，进行 SDS-PAGE电泳(120V电压)，直到染料走到胶底；电泳结束后考马斯亮蓝R250染色，脱色液 脱色，当蓝色条带清晰后，依据蛋白分子量Marker观察诱导效果。( ) Western blot 以 Stv-Izumo (Izumo212_216, Izumo216—220，Izumo220_224) 融合蛋白为 样品，进行SDS-PAGE电泳；电泳后，取下凝胶，去除浓缩胶，湿转转膜buffer中浸泡15min ； 将PVDF膜在甲醇中浸润15sec，ddH20漂洗两次，浸入湿转转膜buffer平衡IOmin ；用湿转 法转膜，80V恒压转膜2h;用5% (W/V)脱脂奶粉在室温封闭PVDF膜2h;以anti-PB IgG为 一抗(按比例1 2000用脱脂奶粉配)，4°C孵育过夜。用TBST洗涤3次，每次IOmin ； 二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(l 20000)，室温孵育Ih ；用TBST洗涤3 次，每次IOmin ；ECL显色剂显色，曝光后自动洗片仪洗片。2. 2. 2. 4人工合成肽在上海生工合成肽Izumo212_227 (包含ATLTK)，用血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin, KLH)偶联增强其抗原性。2. 2. 2. 5克隆表达UU474蛋白并制备其多克隆抗血清①设计克隆UU474第465 638蛋白(包含交叉反应抗原ATLTK)，根据GenBank 中 Ureaplasma parvum serovar 3str. (gi 13357558)基因序列设计弓丨物。UU474蛋白引物序列如下UU474 蛋白正义链引物5，GC GGATCC AAT CGT TTG GGA ACT GCT 3，下划线部分是BamH I酶切位点负义链引物5，GCAAGCTT GCT TCT GAT GCG TCA TAA AT 3，下划线部分是Hind III酶切位点预期扩增片段为524bp ；②PCR 将UU煮沸IOmin后释放的总DNA作为模板；PCR体系如下UUDNA 5 μ 1， 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，上游引物 1 μ 1，下游引物 1 μ 1，dNTPMixtrue (200mM) 0. 5 μ 1, dd H2O 14μ l，Taq酶1μ 1 ；总反应体系为25 μ 1 ；PCR反应程序94°C预变性5min ；94°C Imin, 570C lmin，72°C lmin，循环 30cycles ；72°C延伸 10min，4°C IOmin ；PCR产物经 1. 2%琼脂糖 凝胶电泳验证后，用凝胶回收DNA纯化试剂盒回收。③克隆TA克隆连接体系pMD-18T Vector 1 μ 1，回收 DNA 4 μ 1，SolutionI 5 μ 1，总反应体系为10 μ 1，反应程序16°C孵育8h ；连接产物转化入DH5a感受态细胞；通 过X-gal筛选和挑取阳性克隆，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒；质粒双酶切10XBufferK 1. 5μ 1, BamH I 1 μ 1，HindIIIl μ 1，小抽质粒 11. 5 μ 1 (pMD_18T_UU474)，总反应体系为 15 μ 1 ；酶切目的片段胶回收产物与pET-28a(+) Vector连接，构建表达载体:pET-28a(+) Vector 1 μ 1，酶切胶回收产物 8 μ 1，Ligation Solution Buffer 1· 5 μ 1，T4DNA 连接酶 1μ 1, dd H2O 3. 5μ 1，总反应体系为15μ 1，16°C过夜；连接产物转化入Ε. coli DH5a感受 态细胞；扩增的质粒用质粒小量抽提试剂盒进行抽提；小抽质粒经PCR验证后，送上海华大 基因公司测序。④表达将pET-28a(+)_UU474 转化入 E. coli BL21 (DE3)感受态细胞；用 IPTG， 在摇床中以280rpm，37°C孵育4h诱导表达目的蛋白，取诱导前全菌液、诱导后全菌液加 5 X sample buffer 20 μ 1，95°C孵育 IOmin 变性，上样，进行 SDS-PAGE 电泳(120V 电压)，电 泳结束后考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色，当蓝色条带清晰后，依据蛋白分子量Marker 观察诱导效果；按照以上诱导表达过程，诱导250ml菌液表达目的蛋白，用Pierce公司 Ni2+-NTA柱经亲和层析方法对表达的目的蛋白进行纯化；纯化后蛋白用BCA法定量。⑤制备多克隆抗体纯化的重组UU474蛋白和合成肽Izumo212_227分别免疫一只6 月龄(体重为2. 5kg)雄性新西兰大白兔，按每只兔子每次0. 5 1. Omg的蛋白量来确定 免疫蛋白注射体积，方法参照文献；用ELISA法(酶联免疫吸附法)检测兔抗血清效价；用 PROSEP-A试剂盒进行抗体纯化。2. 2. 2. 6精子蛋白Izumo与UU474蛋白之间存在交叉反应抗原的生物学验证①以重组PB蛋白(小鼠Izumo蛋白Ig-Iike结构域)和重组UU474蛋白为样品，进 行SDS-PAGE电泳；电泳后，取下凝胶，去除浓缩胶，湿转转膜buffer中浸泡15min ；将PVDF 膜在甲醇中浸润15sec，ddH20漂洗两次，浸入湿转转膜buffer平衡IOmin ；用湿转法转膜， 80V恒压转膜2h ；用5% (W/V)脱脂奶粉在室温封闭PVDF膜Ih ；以anti-Izumo212_227IgG为 一抗(按比例1 2000用脱脂奶粉配)，4°C孵育过夜。用TBST洗涤3次，每次IOmin ； 二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(l 35000)，室温孵育Ih ；用TBST洗涤3 次，每次IOmin ；ECL显色剂显色，曝光后自动洗片仪洗片。②以人精子蛋白(人精子蛋白提取方法同小鼠精子蛋白)为样品进行SDS-PAGE 电泳，电泳后，取下凝胶，去除浓缩胶，湿转转膜buffer中浸泡15min ；将PVDF膜在甲醇 中浸润15sec，ddH20漂洗两次，浸入湿转转膜buffer平衡IOmin ；用湿转法转膜，80V恒 压转膜2h ；用5% (W/V)脱脂奶粉在室温封闭PVDF膜Ih ；分另Ij以anti-Izumo212_227IgG和 anti-UU474IgG为一抗(按比例1 2000用1 %脱脂奶粉配)，4°C孵育过夜。用TBST洗 涤3次，每次IOmin ；二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG (1 35000)，室温孵育 Ih ；用TBST洗涤3次，每次IOmin ；ECL显色剂显色，曝光后自动洗片仪洗片。2. 2. 2. 7人精子双标免疫荧光定位①正常人精子由仁济医院人类精子库提供，按Mandal的方法通过上游法收集精子。②收集好的精子悬液置于37°C，5% CO2培养箱中孵育1. 5h获能，然后加入5μ M 的Ca2+诱导剂Α23187继续孵育Ih诱导精子的顶体反应。③顶体反应后的精子被点到涂了多聚赖氨酸的玻片上，自然干燥后，用PBS洗一 次。④用5 % BSA室温封闭Ih.。
⑤anti-Izumo212_227IgG (或 anti-UU474IgG)和 anti-hCD46 分别以 1 50 的稀释 度孵育，阴性对照用免疫前血清孵育，在4°C过夜。⑥用PBS洗三次后，分别以用1 200稀释的FITC标记的羊抗兔IgG和 Rhodamine (TRITC)羊抗小鼠IgG在暗盒中孵育2h，再用PBS洗三次后，用50 %甘油封片，用 激光共聚焦显微镜观察。2. 2. 2. 8anti-UU474IgG 与 anti_Izumo212_227IgG 的体外抗生育实验①卵子制备8 10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射IOIU孕马血清(PMSG)，48 72h后注射等剂量的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，12 16h后从输卵管壶腹部取卵。卵细胞 周围颗粒细胞层用0. 透明质酸酶消化，卵透明带用0.6%蛋白酶K去除。②精子获能及抗体处理10周龄以上的雄性BALB/c小鼠，颈椎脱臼处死后取出附 睾尾精子置于含0. 3% BSA的M16液中，用上游法制备精子悬液，调精子密度为1. OX IO6/ ml,于37°C，5% CO2培养箱中孵育1. 5 2h，加入Ca2+诱导剂A23187溶液，使终浓度为 5 μ mol/L,继续孵育lh，分别用不同稀释浓度的anti-UU474IgG或anti_Izumo212_227IgG及 免疫前血清与获能精子共孵育30min。③受精将无透明带卵细胞与不同处理的精子悬液于37°C，5% CO2培养箱中共孵 育3h后，吸出卵细胞，去除松散地附着于卵细胞的精子，移至载玻片上，压片后置相差显微 镜下观察。精卵的融合通过H0echst33342染色后，激光共聚焦显微镜观察。判断受精的标 准为看到雄原核或膨胀的精子头部及相应的尾。受精实验均包括一个实验组和一个对照 组，共重复3次。2. 2. 2. 9抗Izumo212_227抗体对小鼠精子运动功能的影响①用50 μ g/ml纯化的抗Izumo212_227IgG或纯化的正常兔血清IgG与小鼠精子共孵 育lh。②取样经精液自动分析仪检测，精子运动参数分别选定活动精子百分率(％ Motile)、曲线速度(curvilinear velocity，VCL)、直线速度(straight-line，VSL)。2. 2. 2. 10UU474蛋白和合成肽Izumo212_227的体内抗生育实验①选择24只雌性BALB/c小鼠和12只雄性BALB/c小鼠，都经验证具有生育能力。 随机分成3组，2个是实验组(UU474蛋白免疫组、合成肽Izumo212_227免疫组)，1个对照组。②分别在第1天、第3天、第28天免疫小鼠，每次每只小鼠免疫100 μ g的蛋白量。③在免疫第35天，实验组与对照组的雌性和雄性小鼠合笼，两组合笼都采用两雌 配一雄的组合。④合笼后的第7天，第14天，第21天对两组的雌性小鼠的体重进行称量。观察雌 性小鼠体重的变化，判断雌性小鼠是否怀孕；⑤并分别计算孕鼠的产仔数。2. 3 结果2. 3. 1人与小鼠Izumo蛋白Ig-Iike结构域的序列比对与分析为了进一步研究Izumo Ig-Iike结构域的理化特性及其生物学功能，首先将人与 小鼠Izumo蛋白Ig-Iike结构域的序列通过DNAssist 2. 0软件进行了比对和分析。人与 小鼠Izumo蛋白Ig-Iike结构域的氨基酸序列有64. 84%完全一致，有15. 38%相似，表明 Izumo蛋白Ig-Iike结构域在种属之间的保守性是很高的。小鼠可以作为研究人精子蛋白
16Izumo与UU之间交叉反应抗原的理想动物模型。我们通过生物信息学技术发现人精子蛋白 Izumo与UU之间存在交叉反应抗原KGKEA、ATLTK、KPMVG都在human Izumo蛋白的Ig-Iike 结构域中。结果也表明小鼠Izumo蛋白Ig-Iike结构域有较强的抗原性和较好的亲水性。2. 3. 2小鼠重组Izumo蛋白Ig-Iike结构域(PB)的质谱鉴定经质谱鉴定PB蛋白的确是小鼠Izumo蛋白Ig-Iike结构域2. 3. 3用Western blot的方法鉴定Izumo与UU之间的交叉反应抗原pTSA18-Stv-Izumo (Izumo212_216, Izumo216_220, Izumo220_224)融合蛋白在 IlkDa 处获得 表达(图17)。对照蛋白为Stv-i38融合蛋白，β8是β-hCG中的一个由12个氨基酸组成 的表位肽，在电泳中，其融合蛋白分子量较大。human Izumo 的第 212 216 氨基酸(Izumo212_216)KGKEA，对应的 mouse Izumo 氨基酸序列为KGKEP，其中A和P是相似氨基酸；human Izumo的第216 220氨基酸 (Izumo216_22Q)ATLTK，对应的mouselzumo氨基酸序列为PYLTK，其中T和Y也是相似氨基酸； human Izumo 的第 220 224 氨基酸(Izumo22Q_224)为 KPMVG，对应的 mouselzumo 氨基酸序 列为KSMVG0通过(图18)我们发现anti-PB(小鼠Izumo蛋白Ig-Iike结构域)IgG可以 与Stv-Izumo216_22。融合蛋白很强地识别，而与Stv-Izumo22。_224和Stv_Izumo212_216融合蛋白 发生较弱的识别。因此(Izumo216,)ATLTK是一个比较强的B细胞表位。UU474蛋白的第 518 522氨基酸与人Izumo216_22(1氨基酸序列一致，皆为ATLTK。2. 3. 4克隆表达UU474蛋白并制备其多克隆抗血清UU474蛋白基因的PCR产物作1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，显示出现一条特异性区 带，位于相对分子质量(M) 500 600bp之间，与预期大小524bp相符(图19)。在IPTG (工作浓度为200 μ g/ml)诱导下，pET_28a(+)表达质粒在具有T7RNA聚 合酶的E. coli BL21 (DE3)中经过37°C 4h的培养后，进行超声破菌。经SDS-PAGE电泳分离 并用考马斯亮蓝染色，结果显示诱导后全菌裂解物在23kDa (图20)处出现与预期目的蛋白 大小一致的条带，且该表达蛋白在超声破菌后的沉淀里。诱导前全菌裂解物无目的蛋白表 达。用Ni2+-NTA柱对诱导后菌液进行亲和层。洗脱液经SDS-PAGE电泳后，在23kDa处 出现了明显的条带，为纯化后的UU 474蛋白(图20)。2. 3. 5ELISA 法检测 anti_Izumo212_227、anti_UU474 兔抗血清效价结果用ELISA法检测获得的抗体效价，分别以免疫前、后兔血清为一抗，辣根过氧化物 酶(HRP)标记的羊抗兔IgG为二抗，用DAB显色反应后，终止反应，用酶标仪在A485检测。 结果显示anti-Izumo212_227、anti_UU474的IgG效价均大于1 25600 (表2)，表明所获得 的抗体是高效价的(图21)。表2抗血清效价滴度表
17 2. 3. 6精子蛋白Izumo与UU474蛋白之间存在交叉反应抗原的生物学验证通过Western blot的方法验证精子蛋白Izumo与UU474蛋白之间存在交叉反，合 成肽Izumo212_227的抗体能够识别重组PB蛋白(小鼠Izumo蛋白Ig-Iike结构域)和重组 UU474 蛋白(图 22) ；anti-UU474IgG 或 anti_Izumo212_227IgG 也都能在 37kDa 处识别人精子 Izumo 蛋白(图 23)。2. 3. 7人精子双标免疫荧光定位通过用纯化的ant i-Izumo212_227IgG进行人精子的双标间接免疫荧光定位分析，我 们发现免疫荧光定位在顶体反应后人精子的顶体内膜上，与阳性对照的抗体CD46单克隆 抗体的定位一致(图24)。anti-UU474IgG也能识别人精子的顶体内膜(图25。以免疫前 血清为一抗的对照组，在激光共聚焦显微镜下未见荧光反应(图26)。2. 3. 8ant i_UU474IgG 与 anti_Izumo212_227IgG 的体外抗生育实验用不同浓度稀释的纯化后anti_UU474IgG、anti_Izumo212_227IgG及免疫前血清 与获能小鼠精子共孵育后，与去透明带的小鼠卵子孵育，观察经上述处理后的精子与卵 子融合能力的变化。经过Hoechst 33342染色并在激光共聚焦显微镜下观察，结果发现 50 μ g/ml anti-IZumo212_227IgG使小鼠精-卵融合能力都有较明显的下降；相同浓度稀释 的anti-UU474IgG对小鼠精-卵融合能力没有明显影响(图27)。然而25 μ g/ml、10 μ g/ ml浓度稀释的anti-IZumo212_227IgG对小鼠精-卵融合能力也没有明显的影响。结果表明 anti-IZUmo212_227IgG在体外具有一定的抑制精-卵融合的作用。2. 3. 9抗体对小鼠精子运动功能的影响用纯化的anti-IZUmo212_227IgG或纯化的正常兔IgG与小鼠精子共孵育Ih后，取样 经精液自动分析仪检测，与对照相比，实验组中小鼠精子活动百分率、曲线速度(VCL)及直 线速度(VSL)均无显著性差异，表明anti-IZumo212_227IgG对小鼠精子运动功能无影响(表 3)。表3ant i_Izumo212_227IgG对小鼠精子运动的影响
2. 3. 10合成肽Izumo212_227和重组蛋白UU474体内抗生育实验为了观察合成肽Izumo212_227和重组蛋白UU474在体内对生殖的影响，分别用合成 肽IZUmo212_227和重组蛋白UU474免疫雌鼠，在第六周可以取得较高效价的抗体，然后与已证 实具备生育能力的雄鼠交配，抗体可以持续到第十周。合成肽Izumo212_227免疫组(表4)与 其它组比较，雌鼠的产仔数有较明显下降。表4Izumo212_227、UU474免疫对雌鼠受精的影响 注*p < 0. 05.实施例3嵌合肽免疫避孕疫苗功能研究一，材料合成肽CPl由上海生工生物技术公司合成。完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、FITC 标记的羊抗兔IgG、Anti-His单克隆抗体(Sigma公司)PVDF膜(Millipore)，ECL生物发光 显色剂(Millipore)。6月龄(体重约为2. 5kg)雌性新西兰大白兔，成熟BALB/c小鼠(8-12W)由上海交 通大学医学院动科部购自中科院实验动物中心。二，方法1.设计、合成嵌合肽精子蛋白Izumo，tNASP，ESP中的交叉反应抗原分别为ATLTK，IERLT, TGGFTjf 三个短肽 hESP1Q3_112(TGGFTPEIGK)、tNASP396_4(l5 (TSIERLTETK)、Izumo212^221(KGKEATLTKP)(包 含交叉反应抗原)串联起来，在其N-端连接广谱T细胞表位牛核糖核酸酶aa94-104 NCAYKTTQANK，用于构建抗精子的嵌合肽疫苗。嵌合肽CPl :NCAYKTTQANK GGG TGGFTPEIGK GGG TSIERLTETK GGG KGKEATLTKP。由上海生工生物技术公司应用固相化学合成法合成上 述50肽。2.重组 mlzumo，mtNASP, mESP-Pl 蛋白表达纯化mESP三个片段P1/P2/P3克隆用提取的BALB/c小鼠睾丸总RNA作为模板，RT-PCR的产物作1. 0 %琼脂糖凝 胶电泳检测，显示出现三条特异性区带，分别与P1/P2/P3片段的预期大小516bp、543bp、474bp相符。目标片段与pET-28a(+)载体连接，构建重组表达载体，并再次经DNA测序。在 IPTG(工作浓度为200 μ g/ml)诱导下，pET_28a(+)表达质粒在E. coli BL21 (DE3)中经过 37°C4h的培养后，结果显示诱导后菌液在蛋白分子量约25kDa，36kDa，21kDa处大量表达出 新的条带，对应于P1/P2/P3. P1、P2、P3的理论分子量分别为20kDa，21kDa, 17kDa,考虑到重 组蛋白带有载体的标签序列，实际显示的分子量会比理论分子量略大，故Pl和P3判断为 目标蛋白。P2显示分子量偏大，进一步经质谱分析验证为目的片段.在本实验的表达条件 下，诱导后His标签重组蛋白以包涵体形式表达，因此用Ni-NTA柱对诱导后菌液进行亲和 层析。洗脱液经SDS-PAGE电泳后，结果显示在预计蛋白分子量处获得了纯化后目的蛋白。Izumo蛋白Ig-Iike domain与mtNASP的克隆表达与纯化1 引物:Izumo基因Ig-Iike结构域(PB)上、下游引物。正义链引物5，GCGGATCC AAG CAG TTG CAC ATT TGT C 3，包含酶切位点 BamH I (下划线部分)。负义链引物5，GCAAGCTT GTT CGG TGG TTG GTT TTC 3，包含酶切位点 Hind III(下划线部分)。预期扩增片段为336bp ；mtNASP上、下游引物。上游引物5，GCGGATCCATGGAACTGCTAGGGCAAGA’ 3 包含酶切位点 BamH I (下划线部 分)。下游引物5，GCAAGCTT TTTGTCTTCAGGTGCTTTCT，3 包含酶切位点 Hind III (下划 线部分)。目的片段长339bp。2 ① PCR:PCR 体系如下小鼠睾丸 cDNA 5 μ 1，IOXPCR Buffer 2. 5 μ 1，上游引物 1 μ 1，下游引物 1 μ l，dNTP Mixtrue(200mM)0. 5μ l，dd Η2014μ l，Taq 酶 1μ 1 ；总反应体系 为 25 μ 1。②克隆ΤΑ克隆连接体系pMD_18T Vector Ιμ ，回收 DNA 4 μ 1，SolutionI 5 μ 1，总反应体系为10 μ 1，反应程序16°C孵育8h ；连接产物转化入DH5a感受态细胞；通 过X-gal筛选和挑取阳性克隆，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒；质粒双酶切=IOXBuffer K 1. 5μ 1, BamHI 1 μ 1, Hind IIIl μ 1，小抽质粒 11. 5 μ 1 (pMD_18T_DNA)，总反应体系为 15 μ 1 ；酶切目的片段胶回收产物与pET-28a(+) Vector连接，构建表达载体pET-28a(+) Vector 1 μ 1，酶切胶回收产物 8 μ 1，Ligation Solution Buffer 1· 5 μ 1，T4DNA 连接酶 1μ 1, dd H2O 3. 5 μ 1，总反应体系为15 μ 1，16°C过夜；连接产物转化入Ε. coli DH5a感受 态细胞；扩增的质粒用质粒小量抽提试剂盒进行抽提；小抽质粒经PCR验证后，送上海华大 基因公司测序。③表达将pET_28a(+)-DNA 转化入 E. coli BL21 (DE3)感受态细胞；用 IPTG， 在摇床中以280rpm，37°C孵育4h诱导表达目的蛋白，取诱导前全菌液、诱导后全菌液加 5 X sample buffer 20 μ 1，95°C孵育 IOmin 变性，上样，进行 SDS-PAGE 电泳(120V 电压)，电 泳结束后考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色，当蓝色条带清晰后，依据蛋白分子量Marker 观察诱导效果；按照以上诱导表达过程，诱导250ml菌液表达目的蛋白，用Pierce公司Ni2+-NTA柱经亲和层析方法对表达的目的蛋白进行纯化；纯化后蛋白用BCA法定量。3.免疫接种经过生育能力验证的BALB/c雌、雄小鼠用于本实验。合成CPl作为免疫原，按第 一章实验方法免疫雌性BALB/c小鼠，每次免疫抗原用量100 μ g。以PBS加佐剂按同样方法 免疫小鼠作为对照。免疫结束后1周第一次合笼交配，第8周再次合笼交配。合笼1周后 分开，定期称量体重判断小鼠是否受孕，计数孕鼠产仔数。同时免疫一只雌性新西兰大白兔 制备抗CPl抗体用于后续体外穿卵实验。4. ELISA免疫结束后1周第一次合笼交配前自眼内眦静脉取血，免疫结束后第5周及第8 周再次取血。用CPl包被96孔板，每孔1 μ g，按前述实验方法进行，以免疫前血清及对照 组血清为对照，测定抗血清效价。以重组蛋白rmESP-Pl，rmtNASP, rmlzumo分别包被96孔 板，每孔0.5yg，l 100稀释血清作为一抗，测定CPl中各组成表位的抗体反应。5.人和小鼠精子蛋白提取取4份正常人精液标本分离获取精子样品，取5只成年BALB/c雄鼠按前述方法获 取附睾尾部精子样品。提取蛋白实验方法见第二章。6. Western blot 分析 以重组mlzumo，mtNASP, mESP-Pl蛋白及精子全蛋白提取物作为抗原进行 SDS-PAGE，以兔抗CPl抗体作为一抗，1 2000稀释，按第一章实验方法进行Western blot 分析CPl诱导产生的抗体与原蛋白的交叉反应。7.小鼠精子体外穿卵实验配子制备同前，以1 10，1 20，1 100稀释CPl免疫后兔抗血清预处理精子， 与去透明带小鼠卵子共孵育，观察精卵黏附、融合情况。(1)卵子获取8 10周龄BALB/c雌性小鼠腹腔注射IOIU孕马血清(PMSG)，48h后注射等剂量 的hCG，15 16h后从输卵管壶腹部取卵。(2)精子获取及抗体处理10 12周龄BALB/c雄性小鼠颈椎脱臼处死，取出附睾尾部，置于预热M16 (含3 % BSA)中，用手术剪将附睾组织稍微剪切后，于37°C，5% CO2培养箱中静置lOmin，用上游法 制备精子悬液，调精子密度为1.0X106/ml，于37°C，5% CO2培养箱中孵育lh，加入Ca2+诱 导A23187溶液，使终浓度为5ymol/L，继续孵育20min。分别用不同稀释浓度的anti-Pi、 anti-P2、anti-P3抗血清及免疫前血清与获能精子共孵育30min。血清使用前用56°C， 30min灭活补体。(3)小鼠精子体外穿卵实验将去透明带卵细胞与不同处理的精子悬液于37°C，5% CO2培养箱中共孵育3_4h 后，吸出卵细胞，去除松散地附着在卵细胞上的精子，2%多聚甲醛固定20min，PBS洗涤后 Hoechst 33342(10yg/ml)染色，37°C，15 20min ;PBS洗涤后置载玻片压片，激光扫描共 聚焦显微镜观察。倒置相差显微镜下计数黏附于卵膜的精子数，荧光镜下观察精卵融合，判 断精卵融合的标准为卵细胞内看到膨胀的精子头部或原核。实验共重复3次。抗合成肽血清及抗rUU436血清56°C 30min灭活补体，以不同稀释度1 10，
211 20,1 100与精子共孵30min。处理后精子再与去透明带小鼠卵子共孵育37°C，5 % C02，3-4h。去除松散地附着在卵细胞上的精子，2%多聚甲醛固定20min，PBS洗涤后Hoechst 33342(10μ g/ml)染色15 20min ；PBS洗涤后置载玻片压片，激光扫描共聚焦显微镜观 察。倒置相差显微镜下计数黏附于卵膜的精子数，荧光镜下观察精卵融合，判断精卵融合的 标准为卵细胞内看到膨胀的精子头部或原核。实验共重复3次。8统计学分析体外实验重复三次以上，各组结果以均数士标准误(mean士SEM)表示。小鼠交配 实验产仔数以均数士标准差(mean士SD)表示。实验组与对照组差异采用团体t检验，运 用SAS6. 12软件进行统计学分析，ρ < 0. 05认为有统计学意义。三，结果1化学合成肽CPl经DNAstar软件优化排列BCE顺序，分析其疏水性、抗原性及表面可及性均较 强，CPl经HPLC纯化，纯度大于90%，经质谱仪鉴定荷质比与理论值一致。2CP1免疫小鼠对生育功能影响CPl免疫结束后1周第一次合笼交配，81. 8% (9/11)雌鼠不育，而对照组均生育。 第8-9周第二次合笼交配，实验组不育的雌鼠均恢复生育，孕鼠平均产仔数与对照组无显 著差另U (P > 0. 05)(表 5)。表5CP1免疫BALB/c雌鼠对生育影响 3CP1抗体产生用ELISA测定CPl免疫小鼠的免疫前及免疫后血清吸光值，用CPl包被96孔板， 1 100小鼠稀释血清作为一抗，显示免疫后小鼠血清中有特异性抗体产生。免疫前血清和 对照组血清无免疫反应。免疫结束后第1周，第5周，第8周所取小鼠血清中IgG抗体的水 平差异无显著性(图28)。小鼠抗CPl抗体水平的个体之间差异不太大。血清抗体水平与 其生育状态并不平行，第1和9号小鼠分别产5只和7只仔，其余小鼠不育，但第1和9号小 鼠血清抗体水平并非比其他小鼠明显低。兔免疫后血清抗CPl抗体效价达1 10000(图
29)。4CP1诱导产生的抗体与重组蛋白及精子中的原蛋白具有交叉反应性以重组蛋白rmESP-Pl, rmtNASP, rmlzumo分别包被包被96孔板，每孔0. 5 μ g， 1 100稀释血清作为一抗。结果兔及所有小鼠免疫后血清与rmESP-Pl ,rmtNASP蛋白有免 疫反应，与rmlzumo无免疫反应。免疫前血清及对照组小鼠血清与上述蛋白无交叉反应(图
30)。进一步以兔抗血清为一抗，通过Westernblot分析抗CPl抗体能否识别重组蛋白。结 果在rmESP-Pl ,rmtNASP蛋白目标分子量处见阳性条带，分别为25kDa和18kDa，在rmlzumo 位置处没有免疫反应条带(图31)。人和小鼠精子中tNASP的理论分子量分别为85kDa和83kDa,人和小鼠精子中ESP蛋白的理论分子量分别为38kDa和45kDa，人精子和小鼠附睾尾 成熟精子的蛋白提取物中显示的免疫反应条带位置与tNASP、ESP的理论分子量一致。免疫 前血清与上述蛋白无交叉反应(图32)。说明组成CPl成分中的tNASP和ESP蛋白的BCE， 能诱导产生特异性抗体，识别精子中原蛋白tNASP和ESP。在人和小鼠天然Izumo蛋白及 rmlzumo的目标位置处没有免疫反应条带，说明抗体不能识别原蛋白或Izumo的BCE没有诱 导产生特异性抗体。5CP1诱导产生的抗体抑制小鼠体外精_卵相互作用用不同浓度稀释的兔抗CPl血清及免疫前血清处理获能小鼠精子后，与去透明带 的小鼠卵子孵育，观察经上述处理后的精子黏附卵子的能力及穿卵能力的变化。与免疫前 血清相比，1 10稀释的抗CPl血清处理精子后，每个卵子的平均结合和融合精子明显减 少。当稀释度增大到1 20时，小鼠精卵黏附及融合数与对照组比较有差异，但无统计学意 义(P > 0. 05)。当稀释度增大到1 100时，对精子与卵子的黏附和融合无显著影响(图 33，34，35，36)。这一结果表明抗CPl抗体抑制作用呈浓度依赖性。不同浓度稀释的抗CPl 抗体及免疫前血清处理后的精子与对照组比较，精子活力和运动参数没有明显的变化，也 没有发生精子凝集现象。本实验将经验证的三个精子蛋白(hlzumo、tNASP、hESP)与UU的交叉反应抗原组 合起来，线性排列并在N-端连接广谱T细胞表位构成嵌合肽，免疫雌性BALB/c小鼠后，免 疫组小鼠生育率下降81.8%。这三个交叉反应抗原已被验证为线性BCE，具有足够的抗原 性，合成表位肽耦联KLH单独免疫均能诱导机体产生特异性抗体识别原蛋白，并产生一定 的抗生育作用。将这三个BCE串联起来构成一种新形式的疫苗，免疫避孕效果增强。CPl产 生的抗体能与重组和天然tNASP，ESP蛋白发生交叉反应。说明CPl组成成分中的BCE诱 导机体产生了特异性的抗体，重要的是该抗体能识别原天然蛋白。众所周知，多肽疫苗诱导 产生的抗体必需能与原天然蛋白交叉反应才有功能意义。有观点认为嵌合肽中同时包括几 个抗原靶点能协同增强其中单个成分BCE的免疫效果。本实验中多肽疫苗基于的三个精子 抗原都是精子特异性表达，与受精有关。ESP定位于精子顶体赤道段，参与受精过程中精卵 相互作用。tNASP是精子特异的核自身抗原，在受精过程中的作用不清楚，但免疫攻击小鼠 tNASP蛋白后能导致免疫性不育。Izumo定位于顶体内膜，参与精卵融合，基因敲除后导致 完全不育，免疫后也可致部分不育。可以推测，本实验中CPl免疫后，小鼠参与受精过程中 的两个靶点tNASP和ESP受到免疫攻击，这可能是其能有效诱导小鼠不育的原因。CPl组成成分中的mlzumo的BCE耦联KLH单独免疫时能产生特异性抗体，识别重 组和天然mlzumo，说明该表位抗原性强。本实验中抗CPl抗体不能与mlzumo发生交叉反 应，一种可能原因是该BCE位于CPl的C-末端，易被机体内肽酶或蛋白酶水解；另一种可 能是CPl形成了新的构象，形成了二级结构或产生了新的表位不能识别原蛋白。其他实验 中也报道串联多个不同BCE时，有的BCE不能诱导产生相应抗体。Hardy等构建多表位疫 苗，包括PLF、SP56、ZPl和ZP3的免疫显性BCE，免疫小鼠后可以致50%不育，但只诱导产 生与SP56和ZPl反应的抗体。将几个表位肽简单混合起来作为多价免疫原，抗原肽成分 往往不能激发机体产生免疫反应。设计构建多表位嵌合肽首要目的是以其为免疫原，嵌入 各BCE均能产生抗体。多价疫苗理想的状况是疫苗中各组分都具有足够的免疫原性，产生 识别原蛋白的抗体。目前尚不能准确预测多肽疫苗的免疫原性，即肽以何种构象能激起与原蛋白交叉反应的抗体。将多个不同表位组合起来构建线性多肽疫苗，不同表位之间尝试 用GGG或GPSL序列分隔开，可以提高各个表位的柔韧性以利于其诱导免疫反应。最好以软 件EpiSort优化表位间隔，以提高多肽的免疫原性。另有报道分支肽能提高免疫原性。各 BCE抗体的产生可能与BCE和TCE之间的位置有关，因为一对BCE和TCE组合的化学合成嵌 合肽研究表明，BCE安排在TCE的C-端产生抗BCE抗体，反之产生抗TCE抗体。当然，若组 合更多BCE和TCE，情况肯定复杂得多。另外，嵌入表位能否诱导抗体产生可能还与插入的 BCE肽段长短有关。由于目前化学合成多肽受序列长度限制，因此设计嵌合肽时，使之适合 生物系统表达，也是生物合成多表位多肽疫苗研究的新课题。我们也正在尝试不同方法增 强嵌合肽的免疫原性，如变动三个BCE的位置、增加表位拷贝数、利用原核表达系统获得多 肽，以进一步研究其各表位抗体产生情况及免疫避孕效果。与其他作者报道一样，嵌合肽诱导产生的不育是可逆的，在最后一次免疫结束后 第8-9周再次合笼交配，所有诱导不育的雌鼠均恢复生育能力，产仔数与对照组差别无显 著性意义。检测免疫结束后第1周、第5周及第8周小鼠血清，IgG抗体效价并无显著下 降。推测实验小鼠组生育功能恢复，可能是由于生殖道局部免疫反应降低所致，血清抗体水 平与小鼠生育状况无相关性。免疫后生殖道内的抗体水平和/或T细胞反应状况可能与生 育状态密切相关，但准确检测小鼠子宫、输卵管内的抗体水平有难度。因此若要确切评价一 个免疫避孕疫苗的避孕效果时，首先需要解决的一个问题是准确评价其在生殖道局部产生 的免疫反应。目前可以在免疫后灵长类动物输卵管液内检测到特异性IgA和IgG抗体。由于多肽疫苗普遍免疫原性弱，需要更好的载体与佐剂来提高免疫原性，增加免 疫反应的深度和广度。不同来源的广谱TCE被尝试用于构建多肽疫苗，因此还需要可靠而 简便的评价T细胞反应的方法。在动物实验中常用的是福氏佐剂，本实验中可见被免疫动 物局部硬结、脱毛明显，说明局部副作用大，不可能适合于人类使用。如用于人体实验除了 要设计特异的多肽免疫原，尚需探索更高效的疫苗接种方式。如将多肽抗原以生物可降解 的微粒包裹后接种，设计脂类分子内佐剂等提高免疫原性。本实验首次研究了由精子蛋白ESP、Izumo和tNASP与UU的交叉反应抗原组成的 嵌合肽，免疫小鼠后可以产生较强的可逆性的抗生育效果，是探索新的抗精子多价免疫节 育抗原的有益尝试。<110>上海交通大学医学院<120> 一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用<160>7<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>50<212>PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400>1Asn Cys Ala Tyr Lys Thr Thr Gln15Gly Phe Thr Pro Glu lie Gly Lys
Ala Asn Lys Gly Gly Gly Thr Gly
1015
Gly Gly Gly Thr Ser lie Glu Arg
24
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2权利要求
一种免疫避孕的嵌合肽，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQID1所示。
2.一种免疫避孕的合成肽hESP1(13_1(17，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID 2 所示。
3.一种免疫避孕的合成肽hIZUmo216_22(1，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID :3所示。
4.根据权利要求2所述的免疫避孕的合成肽hESP1(l3_112，其特征在于氨基酸序列如序 列表中SEQID :4所示。
5.根据权利要求2所述的免疫避孕的合成肽hESP98_112，其特征在于氨基酸序列如序 列表中SEQID :5所示。
6.根据权利要求3所述的免疫避孕的合成肽hIZumo212_221，其特征在于氨基酸序列如 序列表中SEQ ID :6所示。
7.根据权利要求3所述的免疫避孕的合成肽hIZumo212_227，其特征在于氨基酸序列如 序列表中SEQ ID :7所示。
8.根据权利要求1所述的免疫避孕的嵌合肽用途，其特征在于用于制备避孕疫苗。
9.根据权利要求2或4或5所述的免疫避孕的合成肽hESP1(l3_1(l7用途，其特征在于用 于制备避孕疫苗。
10.根据权利要求3或6或7所述的免疫避孕的合成肽hIZUmo216_22(l用途，其特征在于 用于制备避孕疫苗。全文摘要
本发明涉及一种免疫避孕的合成肽，所述的免疫避孕的嵌合肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID1所示。免疫避孕的合成肽hESP103-107，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID2所示。免疫避孕的合成肽hIzumo216-220，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID3所示。本发明还提供了嵌合肽、合成肽hESP103-107或合成肽hIzumo216-220作为免疫避孕疫苗，观察了它们在避孕中的应用。本发明首次研究了由精子蛋白hESP、hIzumo和tNASP与UU的交叉反应抗原组成的嵌合肽，免疫小鼠后可以产生较强的可逆性的抗生育效果。
文档编号C07K19/00GK101906163SQ20091005259
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月5日 优先权日2009年6月5日
发明者吕正梅, 徐晨, 王旻 申请人:上海交通大学医学院