专利名称：一种纳他霉素高效提取纯化方法
技术领域：
本发明涉及纳他霉素发酵提取纯化的工艺方法，属于工业微生物技术领域。
背景技术：
纳他霉素(Natamycin)也称游链霉素(Pimaricin)，是一种重要的多烯类抗菌素，该抗菌素是一种很强的抗真菌试剂，由于它能够专一性的抑制酵母菌和霉菌，阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成。1955年Struyk等人从南非Natal州Pietermaritzburg镇附近的土壤中分离得到纳塔尔链霉菌Str印tomyces natalensis，并从中首次分离得到了纳他霉素。现在可由 Str印tomyces natalensis禾口 StrePtomyces chatanoogensis等链霉菌发酵经微生物发酵生产。 纳他霉素外观白色(或奶油色)，为无色、无味的结晶粉末，分子量为665. 73，结构式如下图。纳他霉素是一种两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为6.5，熔点为28(TC。微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，难溶于大部分有机溶剂。室温下在水中的溶解度为30 100mg/L。在pH值高于9或低于3时，其溶解度会有所提高，在大多数食品的pH范围内非常稳定。纳他霉素具有一定的抗热处理能力，在干燥
状态下相对稳定，能耐受短暂高温(IO(TC )。
<formula>formula see original document page 3</formula> 纳他霉素结构式 Natamycin作为食品防腐剂、添加剂广泛应用于乳制品生产、果蔬汁生产、肉制品加工、焙烤类食品以及饲料加工等许多领域，因其抗真菌也广泛应用于医药领域，具有良好的应用前景。限制Natamycin广泛应用的主要问题是其较高的生产成本和昂贵的价格。
纳他霉素在通常条件下不溶于水，常用一些有机溶剂进行提取，如美国专利3， 892， 850、 W092/07998、 W092/1058中均采取有机溶剂提取的方法。这些方法需要使用甲醇、异丙醇等易燃、易挥发的有机溶剂，势必导致较高的溶剂损耗、回收费用以及较高的安全设施要求、高昂的环保费用。而且甲醇的使用，容易导致纳他霉素甲酯这种副产物的产生，从而影响产品的纯度。在中国国家专利CN101062934A中，公开了一种不使用有机溶剂从发酵液中提取纳他霉素的方法。该专利是利用纳他霉素在不同PH条件下的水溶液中溶解度不同的性质，来实现纳他霉素的提取。在其碱化过程中，发酵液的pH值均要求在ll以上，这样势必使用大量的碱液来调节原本显酸性的发酵液。该方法虽然避免了有机溶剂的使用，但大量酸碱的使用同样会带来不可预知的环保问题和酸碱的消耗、回收问题。另外，由于发酵液中纳他霉素的含量较低，这些方法在进行提取前都需要进行发酵液的浓縮处理，以提高提取得率及纯度，这样势必增加生产中的能耗。 常规的采用甲醇提取纳他霉素的步骤为浓縮发酵液一加入甲醇，升高pH值(10以上)一去除菌丝体一降低pH值(7.0左右)，蒸发甲醇一回收沉淀、干燥得产品。这种工艺是升高发酵液的pH值至碱性，再用甲醇溶解纳他霉素，去菌体后降低pH得到纳他霉素沉淀。虽然发酵液经过浓縮，但体积仍然较大，酸碱和甲醇的用量较大
发明内容
本发明的目的是提出一种污染小、能耗低、提取得率高的纳他霉素发酵培养生产
中提取纯化的工艺方法，从而实现纳他霉素的低成本、高产量、高品质的生产。
本发明的纳他霉素提取及纯化工艺如下 1.将纳他霉素发酵培养生产中产生的富含纳他霉素的发酵液，进行弱酸性分离沉淀。将发酵液用NaOH调节pH值至6. 0 (弱酸性)，并在5(TC保温10 12小时。离心去除上清，保留沉淀，或板框过滤去除部分水份。 2.稀释。测定上述保留的沉淀或滤渣中水分含量，用甲醇/水溶液悬浮沉淀，使甲醇与水(包括沉淀或滤渣中残存的水)的比例为65/35 (v/v)，降温至5 l(TC 。
3.酸性条件下溶解。将上述悬浮液用HCL调节pH值至3. 0，在5 l(TC条件下，搅拌30 50分钟，使纳他霉素完全溶解。 4.过滤取上清液。将第3步中的悬浮液离心或板框过滤，保留上清。将沉淀或滤渣用甲醇/水溶液(70/30， v/v)洗涤，保留上清，并与第一次上清合并，以提高纳他霉素得率。 5.调回到中性结晶。用Na0H将第4步中的上清液pH调节至7.0，并室温孵育16 20小时，使纳他霉素完全结晶，溶液残存纳他霉素应低于1. 5g/L。 6.分离干燥。离心或板框过滤收集纳他霉素晶体，水洗两次后真空干燥或其他方式去除水分，使水分含量低于9%，得到纳他霉素产品。纳他霉素一次提取得率到达85%，纯度达到90%。将5中的残液收集后二次提取，总得率达到90% ;二级纯化可使纯度达到95%。 本发明在利用高产菌株发酵，得到高含量纳他霉素发酵液的基础上，综合利用有机溶剂、pH值调节和温度控制的方法，并采用残液套用二次提取、二级纯化的方法，实现纳他霉素的高效提取和纯化，提取得率达到90%，纯度达到95%。本发明是先将原本酸性发酵液调节至弱酸性，使纳他霉素附着与菌体，收集菌体后在酸性环境下用甲醇溶解纳他霉素，这样避免了甲醇和酸碱的大量使用，而且提高了提取的得率和纯化的纯度。
具体实施实方式
实施例1 :10L发酵罐发酵、及纳他霉素提取纯化 将纳他霉素菌种分别在1L摇瓶、1L发酵罐、5L发酵罐进行种子液的逐级放大培养，各级培养时间分别为12小时、16小时和26小时，获种子液1L，种子液最终pH值为4. 7。在10L发酵罐中装入发酵培养基5L(大豆蛋白粉，38g/L ;酵母粉，8g/L ;葡萄糖，40/L)，接入种子液1L，发酵过程共流加60X葡萄糖2.6L。通过转速和通气量控制溶氧在20 % 30%之间，发酵周期144小时(6天)，最终发酵液体积7. 8L，生物量45. 3g/L，纳他霉素含量13. 8g/L。本发明采用的菌种是保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo. M208028的纟内他霉素高产菌株Str印tomyces gilvosporeus HBJ591。
将上述7. 8L发酵液按提取、纯化工艺进行提取， 一次性提取得到纳他霉素产品92.3g，提取得率为85.7X。经在酸性环境下重新溶解、结晶进行二级纯化后纯度为
93. 8%。 实施例2 :30L发酵罐发酵、及纳他霉素提取纯化 将纳他霉素菌种(采用菌种与实施例1相同)分别在1L摇瓶、5L发酵罐、10L发酵罐进行种子液的逐级放大培养，各级培养时间分别为12小时、18小时和24小时，获种子液4L，种子液最终pH值为4. 6。在30L发酵罐中装入发酵培养基20L(大豆蛋白粉，40g/L ;酵母粉，8g/L ;葡萄糖，45/L)，接入种子液4L，发酵过程共流加60%葡萄糖8. 2L。通过转速和通气量控制溶氧在20% 30%之间，发酵周期150小时，最终发酵液体积25. 3L，生物量46. lg/L，纳他霉素含量15. lg/L。 将25. 3L发酵液按上述提取、纯化工艺进行提取， 一次性提取得到纳他霉素产品330. 3g，提取得率为87. 5%。经在酸性环境下重新溶解、结晶进行二级纯化后纯度为
94. 5%。 实施例3 :100L发酵罐发酵、及纳他霉素提取纯化 将纳他霉素菌种(采用菌种与实施例1相同)分别在1L摇瓶、10L发酵罐、30L发酵罐进行种子液的逐级放大培养，各级培养时间分别为12小时、18小时和26小时，获种子液14L，种子液最终pH值为4. 6。在100L发酵罐中装入发酵培养基70L (大豆蛋白粉，38g/L ;酵母粉，8g/L ;葡萄糖，45/L)，接入种子液14L，发酵过程共流加60%葡萄糖26. 7L。通过转速和通气量控制溶氧在20% 30%之间，发酵周期158小时，最终发酵液体积87. 4L，生物量45. 8g/L，纳他霉素含量14. 8g/L。 将85L发酵液按上述提取、纯化工艺进行提取，一次性提取得到纳他霉素产品1093. 2g，提取得率为86.9%。经在酸性环境下重新溶解、结晶进行二级纯化后纯度为93. 6%。
权利要求
一种纳他霉素高效提取纯化工艺方法，其特征在于步骤为(1)将纳他霉素发酵培养生产中产生的富含纳他霉素的发酵液，进行弱酸性分离沉淀，将发酵液用NaOH调节pH值至6.0，并在50℃保温10～12小时；离心去除上清，保留沉淀，或板框过滤去除部分水份；(2)稀释，测定沉淀或滤渣中水分含量，用甲醇/水溶液悬浮沉淀，使甲醇与水的比例为65/35，v/v，降温至5～10℃；(3)酸性条件下溶解，将上述悬浮液用HCL调节pH值至3.0，在5～10℃条件下，搅拌30～50分钟，使纳他霉素完全溶解；(4)过滤取上清液，将第(3)步中的悬浮液离心或板框过滤，保留上清；将沉淀或滤渣用比例为70/30，v/v的甲醇/水溶液洗涤，保留上清，并与第一次上清合并，以提高纳他霉素得率；(5)调回到中性结晶，用NaOH将第(4)步中的上清液pH调节至7.0，并室温孵育16～20小时，使纳他霉素完全结晶，溶液残存纳他霉素应低于1.5g/L，残液收集后二次提取；(6)分离干燥，离心或板框过滤收集纳他霉素晶体，水洗两次后真空干燥或其他方式去除水分，使水分含量低于9％，得到纳他霉素产品。
全文摘要
本发明提出了一种纳他霉素发酵培养生产中的高效提取纯化工艺方法，其步骤为(1)将富含纳他霉素的发酵液，进行弱酸性分离沉淀；(2)对沉淀稀释；(3)在酸性条件下溶解；(4)过滤取上清液；(5)调回到中性结晶；(6)分离干燥，得到纳他霉素产品。本发明是先将原本酸性发酵液调节至弱酸性，使纳他霉素附着与菌体，收集菌体后在酸性环境下用甲醇溶解纳他霉素，这样避免了甲醇和酸碱的大量使用，而且提高了提取的得率和纯化的纯度。本发明综合利用有机溶剂、pH值调节和温度控制的方法，并采用残液套用二次提取、二级纯化的方法，实现纳他霉素的高效提取和纯化，提取得率达到90％，纯度达到95％。本发明能够实现纳他霉素的低成本、高产量、高品质的生产。
文档编号C07H1/08GK101709072SQ20091022279
公开日2010年5月19日 申请日期2008年3月11日 优先权日2008年3月11日
发明者宋慧婷, 江正兵, 马立新 申请人:湖北大学