专利名称：柠条中一个新的抗旱耐寒基因CaDHN1的制作方法
技术领域：
柠条中一个新的抗旱耐寒基因CaDHNl，涉及一种植物脱水素及其编码基因，其功 能是提高植物的抗旱耐寒性能，属于植物基因工程领域。
背景技术：
各种非生物胁迫包括干旱、盐渍、低温等非生物逆境胁迫，是制约农作物、林草和 蔬菜等生产发展的重要因素。我国的干旱、半干旱耕地共计5. 7亿亩，占全国耕地面积的 38%，我国每年因缺水造成粮食减产700-800亿公斤。培育和推广抗逆植物品种是提高其 产量与质量，保证国家粮食安全和改善生态环境的最有效途径。虽然利用植物自身抗病基 因和一些抗逆相关基因，在抗逆育种方面取得了一些进展。但目前可利用的抗逆相关基因 资源有限，并且存在着抗逆品种不理想等问题，难以满足目前生产与生态改良的需求。近 年来，有关植物抗逆反应机制特别是相关反应途径研究的进展以及基因工程技术的迅猛发 展，为运用基因工程手段提高植物抗病性与抗逆性展示出诱人的前景。植物在长期进化过程中发展了一系列应对生物胁迫和非生物逆境胁迫的反应 机制，以保证其生长发育。大量研究结果表明，植物能通过基因感知和识别逆境胁迫信 号，然后启动级联式的信号传导系统，进而诱导一系列下游的具有功能的抗逆基因表 达。生物体的细胞能够对外界环境条件的变化做出相应的反应，植物的这种耐旱机制 与胁迫条件下植物体内一系列基因的表达引起植物体内理化性质变化密切相关，其中 LEAdateembryogenesis abundant protein)基因是一类重要的抗旱基因]。认为在种子 成熟以及抗逆生理过程中具有重要作用，所以近年来关于脱水素的研究发展很快，特别是 逆境下脱水素对植物的保护作用引起了人们广泛的关注。脱水素基因的表达受到诸多因素 的影响，与植物所处的环境以及其自身的生理状况有密切的关系。在不同的条件下表达的 脱水素行使各自特定的功能，减小逆境和脱水过程对植物组织的伤害。脱水素K片段形成 的双亲性a螺旋能使脱水素与部分变性蛋白质的疏水位点相结合，起到了类似于分子伴侣 的作用，阻止蛋白质的进一步变性，对蛋白质起到保护作用。低温、干旱等逆境往往会破坏 植物细胞自由基代谢的平衡，增加活性氧自由基的产生，进而引发或加剧膜脂的过氧化，造 成细胞膜系统的损伤。有证据表明，脱水素能够清除植物细胞中的活性氧自由基，从而减轻 植物所受的伤害。关于脱水素的作用机理、基因表达的调控等方面的研究将为其在实际生 产中的应用奠定坚实的理论基础。结合转基因技术，将脱水素应用于提高作物的抗逆能力， 减小灾害对农业的影响等方面具有广阔的前景。已有报道证明，含有柑橘脱水素基因的转 基因烟草植株抵抗低温的能力明显高于一般植株。柠条是能在干旱盐碱和温差剧烈变化的 干旱沙漠地区生长的灌木建群树种，在我国“三北”地区广泛分布。作为天然的抗逆性极强 的典型植物，柠条的抗逆性已引起国际学术界的重视。研究、开发和利用柠条抗逆性基因资 源，对于深入植物抗逆性机理以及定向培育抗逆植物新品种具有重要的价值。
发明内容
本发明的目的是提供柠条中的一种与抗性相关的脱水素及其编码基因，该基因首 次在柠条中克隆，该基因的表达受干旱、寒冷诱导在抗寒和抗旱反应中具有调控作用。本发明的名称即又为柠条脱水素。本发明所提供的脱水素来源于柠条，是LEA蛋 白家族中的一个，是具有与序列表3氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列表3氨基酸残 基序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与序列表中的氨基酸残 基序列相同活性的由序列衍生的蛋白质序列，表中氨基酸残基序列是由243个氨基酸残基 组成的蛋白质，分子量约26. 84KD，等电点6. 7。基因全长1165bp，开放阅读框从106位到 837位计731bp，拥有序列1所示的全长DNA序列和序列2所示的完整读码框。本发明的主要创新之点在于(1)首次从柠条中克隆了脱水素基因；
(2)经过BLAST，该转录因子与豌豆脱水素的氨基酸相似性34%，该蛋白含有2个 Y结构域和一个K结构域，富含组氨酸和甘氨酸，是一个新脱水素基因。
具体实施例方式实施例1、拧条叶片全长cDNA文库的构建柠条植株栽培培养钵中，于温室内培养，培养60天，进行干旱处理，至全株出现萎 蔫取幼嫩叶片于液氮中速冻、研磨，TRIzole抽提总RNA，溶于水中。经mRNA纯化试剂盒处 理得到mRNA。取mRNA进行逆转录反应，然后再合成第二链。均一化后与pDNR-LIB载体 连接(具体步骤详见 Creator SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech Cat. No. 634903)并转化大肠杆菌。涂板得到单克隆，分别保藏。实施例2、cDNA文库的随机EST测序从文库中随机选取3000个单克隆进行5’端 EST测序，将测序成功的序列进行BLAST，选择与经验证抗旱相关基因相似的EST。实施例3选择经BLAST与脱水素相似的EST，将它们对应的克隆测通，得到候选抗 逆基因的全长DNA序列。如不能得到全长序列，则以该EST设计引物，通过5’或3’RACE得 到全长序列。实例4脱水素基因的干旱诱导表达的定量分析取干旱处理的柠条叶片提取RNA， 同时提取正常生长的叶片提取RNA为对照，分别反转录成cDNA，根据本发明的序列2设计 PCR 扩增引物引物 1 为5，CTCAACTTCCCTAAACTCCG 3，；引物 2 为 5，TCAGCCAAGCCTTCACAA 3，该引物对扩增出长度为237bp的核苷酸片段，以SYBR GREENI作为荧光染料，用Roche LightCycler 480实时荧光定量PCR仪进行基因表达的定量分析，采用2_Δα法发现干旱诱 导下本发明所涉及的基因的表达比对照提高5倍以上，足以证明其在抗旱中可发挥重要作 用。序列1 :Ca DHNl基因的全长CGGCCGGGGACTCACAACCGCATTAATTTTAGCAAGCAAGTTCTTACAAACTAAACCAACAACACCTTGCCATTTTCTCCTTTGTGCGCATTCTGTTTCGTTGCAATGGCACAATATCGGCAGGGTGGTCAATACAGTGATCAAATGCGCAGGACCGATGAGTATATTGACCAATATGGCAACCCAGTTCATCAATACGGTGATCAAATGCGCAGGACCGATGAGTATGGAAACCCTGTGAGCCAAGTTAACCAATATGGCAACCCGGTTCATCAATATGGTGATCAAATGCGCAGGACCAATGAGTACGACAACCCTGT
GTTGATAAGCAGGACCGATGAGTATGGAAACCCTGTGAGCCAAATTGACCAACATGGCAGCCCACTTCGTCAATACGGTGATCAAATGCGCAAGACCGATGAGTATGGAAACTCTGTGAGCCAAGTTAACCAATATGGCAACCCAGTTCATCAAGGTCACGGTCATGGTCATAGTCATGGTCATGGTCATCGTCATCGTCATGGTCATGGATCTGATCATCAGGGCACTGGTTATGGAACCCACACCGGTGGTGCCACAGGTTATGGTGGAACCACGTACACCGGTGGAGACACTGGTTATGGAACCACTACTGGAGAAGGAACAGGCATGGGGTATGGAAGAACTACTGGGGGCACAGAAGCAGGTTATGTTGGAACCGCAGGGCAACAGTACTATGGAACCACCGCTGGGGGTACTGGTCATCATGAACAATGTCATGGTGGGTATGGTTGTGAACAATATGAGAAGAGAGGGATCATGGATAAGATCAAGGATAAACTTCGTGAAAGATACTAAGATATTTATAATCGATGCATATATTCATTCATGCATATCGATAATAAATATGTATTGGTGTCTTTTTAAGCTTTTGAATAATTTGCTACATACTTTTAAATATGTAGTGGTGTCTTTTGCGACTAGTTTTAAGAAACTGTTTTCGCAACTTGTTCTGGAATCAGGCATATCATCGTTCGTGGGTTTCAACTTTCAATGTTTCTTATTATTTGACTTGAAATTTGCAATTTTGACTTTCAATGATCTTGGAATTGTTCCTCAGATAAAAAAAAAAGAAAAAAAGAATATAAAAAAAAATAAAAAAAGGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA序列2基因的编码区ATGGCACAATATCGGCAGGGTGGTCAATACAGTGATCAAATGCGCAGGACCGATGAGTATATTGACCAATATGGCAACCCAGTTCATCAATACGGTGATCAAATGCGCAGGACCGATGAGTATGGAAACCCTGTGAGCCAAGTTAACCAATATGGCAACCCGGTTCATCAATATGGTGATCAAATGCGCAGGACCAATGAGTACGACAACCCTGTGTTGATAAGCAGGACCGATGAGTATGGAAACCCTGTGAGCCAAATTGACCAACATGGCAGCCCACTTCGTCAATACGGTGATCAAATGCGCAAGACCGATGAGTATGGAAACTCTGTGAGCCAAGTTAACCAATATGGCAACCCAGTTCATCAAGGTCACGGTCATGGTCATAGTCATGGTCATGGTCATCGTCATCGTCATGGTCATGGATCTGATCATCAGGGCACTGGTTATGGAACCCACACCGGTGGTGCCACAGGTTATGGTGGAACCACGTACACCGGTGGAGACACTGGTTATGGAACCACTACTGGAGAAGGAACAGGCATGGGGTATGGAAGAACTACTGGGGGCACAGAAGCAGGTTATGTTGGAACCGCAGGGCAACAGTACTATGGAACCACCGCTGGGGGTACTGGTCATCATGAACAATGTCATGGTGGGTATGGTTGTGAACAATATGAGAAGAGAGGGATCATGGATAAGATCAAGGATAAACTTCGTGAAAGATACTAA序列3脱水素的氨基酸序列MAQYRQGGQYSDQMRRTDEYIDQYGNPVHQY⑶QMRRTDEYGNPVSQVNQYGNPVHQYiiDQMRRTNEYDNPVLISRTDEYGNPVSQIDQHGSPLRQY⑶QMRKTDEYGNSVSQVNQYGNPVHQGHGHGHSHGHGHRHRHGHGSDHQGTGYGTHTGGATGYGGTTYTGGDTGYGTTTGEGTGMGYGRTTGGTE
AGYVGTAGQQYYGTTAGGTGHHEQCHGGYGCEQYEKRGIMDKIKDKLRERY.
权利要求
柠条脱水素，它具有与序列表中序列3的氨基酸残基序列或将序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加且具有与序列3的氨基酸残基序列相同活性的由序列3衍生的蛋白质。
2.柠条脱水素的编码基因，序列表中序列1的DNA序列，包括该基因的全部序列及部分 序列均在权利要求之内。
3.序列表中序列2的DNA序列是基因的读码框，是权利要求的重点。
4.将序列表中序列1限定的DNA序列作适当突变或偏爱密码子改造后的基因，编码相 同功能蛋白质，亦在本专利权利要求之内。
5.权利要求2所述的基因，其开放阅读框是自5’端第106到第837位碱基。
6.含有权利要求3所述的基因的表达载体。
7.含有权利要求3所述的基因的细胞系。
8.权利要求2所述的基因在培育抗寒和抗旱植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了柠条(Caragana korshinskii)脱水素及其基因。该脱水素由243个氨基酸残基组成，具有两个Y结构区和一个K结构区，同其它脱水素不同的是本发明所涉及的脱水素富含组氨酸(H)和甘氨酸(G)。其基因全长1165bp，从5′端106到837位是一个731bp开放阅读框，在植物受到干旱和冷胁迫下强烈表达，使植物细胞减轻受害，提高抗旱、耐寒能力，是植物耐旱机制的关键元件。该基因与豌豆脱水素基因的氨基酸序列相似性为34％，是一个新基因，如构建该基因的植物表达载体，并将此耐旱基因导入各类植物中，将可以提高植物的抗旱耐寒性能。
文档编号C07K14/415GK101817874SQ20091025037
公开日2010年9月1日 申请日期2009年12月7日 优先权日2009年12月7日
发明者乔慧蕾, 孙国琴, 李晓东, 白晨, 郭九峰 申请人:内蒙古自治区农牧业科学院