专利名称：禽流感疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于禽流感疫苗的肽和肽结合的脂质体、以及它们的应用。
背景技术：
流感病毒通过遗传漂变而改变其表面抗原性，每年引起流行。此外，在约10年至 40年的周期中，由于转变已出现了抗原性谱(profile)与其完全不同的新型病毒，这在对该新型病毒缺乏免疫性的人类中引起了世界大流行(下文称为“流行病”)。据称，过去的西班牙流感、香港流感和其它流行病有可能是禽流感病毒引起的；存在将来500万至1亿5000万人将有可能死于禽流感的估计。目前，引起高死亡率的高致病性禽流感(H5N1)的感染在世界各地被报告；迫切需要有效的对策。通常地，包括禽流感病毒在内的流感病毒很可能在增殖过程中经历突变。而且，如果感染了人的病毒在体内与人流感病毒重排列，则可能出现在人之间有高感染性、同时保持高致病性的病毒。病毒本身的这些频繁变化是上述重复流行病的原因。点突变(抗原遗传漂变)在编码病毒表面糖蛋白[血凝素(HA)和神经氨酸酶 (NA)]的基因中发生，而抗原转变产生两个基因都在免疫学上改变的新毒株。常规疫苗诱导与流感病毒表面蛋白特异性结合的抗体的产生，并且通过该抗体的作用使病毒丧失感染潜力。但是，如上所述，表面蛋白很可能经历突变，从而使得上述疫苗诱导的抗体不总是有效。目前，根据预期流行的病毒类型储备疫苗，但该预期可能是令人失望的，引起损害扩大。同时，流感病毒的内部蛋白即使在遗传漂变突变体和转变突变体中也相对地高度保守，难以通过从病毒外部结合抗体而使该蛋白失活，从而使得内部蛋白尚未被积极地用作常规疫苗的靶。病毒-感染的细胞在其表面上暴露掺入病毒内部蛋白的氨基酸序列的一部分的主要组织相容性抗原复合体(MHC)。如果可以制备能够特异性地杀伤表现这些特征的病毒-感染的细胞的细胞毒性T淋巴细胞，那么就可能有效地防止病毒的复制并从而防止其增殖和扩散，而不受突变的影响。专利文献1公开了制备T细胞激活剂的方法，所述T细胞激活剂能够有效地和特异性地增加用于杀伤病原体-感染的细胞或癌细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CD8+ T细胞， 细胞毒性淋巴细胞CTL)，其应用抗原结合的脂质体，并且所述T细胞激活剂用于传染病和癌症的预防或治疗。但是，完全不清楚的是，该方法是否可在实际上有效地预防禽流感病毒感染，和哪类抗原可用于制备有效的细胞毒性T淋巴细胞。现有技术文献专利文献
专利文献 1: JP-A-2008-37831 发明概述
本发明要解决的问题本发明的一个目的是提供不太可能受病毒突变影响的、用于有效地预防高致病性禽流感病毒感染的疫苗。解决问题的手段
本发明人勤勉地进行研究而完成上述目的，并在高致病性禽流感病毒的高度保守的内部蛋白序列中发现了在制备上述细胞毒性T淋巴细胞中尤其有效的抗原表位。而且，本发明人发现，通过用结合了包含该表位的肽的脂质体进行接种疫苗，抗原-特异性细胞毒性T 淋巴细胞可以被非常有力地诱导，并开发了本发明。因此，本发明如下。[1]能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞的肽， 所述肽包含
(1)SEQ ID N0:7、3或8中的任一个所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:7、3或8中的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取
代，
并具有9至11个氨基酸的长度。[2]根据[1]的肽，其中 HLA 是 HLA_A*0201 或 HLA_AM402。[3]肽结合的脂质体，其中所述肽包括
(1)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代， 具有9至11个氨基酸的长度，并且
能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞；
其中所述脂质体包括具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至 24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，和脂质体稳定剂；并且其中所述肽与所述脂质体的表面结合。[4]根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述HLA是HLA_A*0201或HLA_AM402。[5]根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述磷脂是具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基的磷脂。[6]根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述酰基是油酰基。[7]根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述磷脂是选自下列的至少一种二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、琥珀酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺。[8]根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述脂质体稳定剂是胆固醇。[9]根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述肽与构成脂质体的磷脂膜中含有的、 具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基或带有14至M个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂结合。[10]根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述脂质体具有下列组成
(A)具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至M个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂 1至99. 8 mol% ；
(B)脂质体稳定剂0.2至75 mol%。
[11]根据[3]的肽结合的脂质体，其中所述脂质体具有下列组成
(I)具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至M个碳原子和一个不饱和键的烃基的酸性磷脂 1至85 mol% ；
(II)具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至M个碳原子和一个不饱和键的烃基的中性磷脂 0. 01至80 mol% ；
(III)具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至M个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，带有与其结合的肽0. 2至80 mol% ；
(IV)脂质体稳定剂0.2至75 mol%0[12]细胞毒性T淋巴细胞激活剂，包括肽， 其中所述肽包括
(1)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代， 具有9至11个氨基酸的长度，并且
能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。[13]细胞毒性T淋巴细胞激活剂，其包括根据[3]的肽结合的脂质体。[14]根据[12]或[13]的细胞毒性T淋巴细胞激活剂，其进一步包括CpG_DNA。[15]禽流感病毒疫苗，其包括肽， 其中所述肽包括
(1)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代， 具有9至11个氨基酸的长度，并且
能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。[16]禽流感病毒疫苗，其包括根据[3]的肽结合的脂质体。[17]根据[15]或[16]的禽流感病毒疫苗，其进一步包括CpG_DNA。[18]用于细胞毒性T细胞的活化的肽， 其中所述肽包括
(1)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代， 具有9至11个氨基酸的长度，并且
能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。[19]根据[3]的肽结合的脂质体，其用于细胞毒性T细胞的活化。[20]药物组合物，其用于细胞毒性T细胞的活化，其包括根据[3]的肽结合的脂质体和CpG-DNA。[21]肽，其用于针对禽流感的接种疫苗， 其中所述肽包括
(1)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或
(2)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代， 具有9至11个氨基酸的长度，并且
能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。
[22]根据[3]的肽结合的脂质体，其用于针对禽流感的接种疫苗。[23]药物组合物，其用于针对禽流感的接种疫苗，其包括根据[3]的肽结合的脂质体和CpG-DNA。本发明的效果
应用本发明的肽和肽结合的脂质体，可以从衍生自禽流感病毒的高度保守内部蛋白的抗原制备禽流感疫苗。根据本发明，可能提供高度通用的禽流感疫苗，其不同于常规禽流感疫苗且不太可能受到病毒表面蛋白突变的影响，从而消除了对预期要流行的病毒毒株(型或亚型)进行正确估计的需要。实施本发明的方式
本发明提供了能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞的肽，其包括(1) SEQ ID NO: 1至9的任一个所示的氨基酸序列，或O) SEQ ID NO: 1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代，并且具有9至11个氨基酸的长度(本发明的肽)。本发明已基于高致病性禽流感病毒抗原中下列优异表位序列(本发明的表位序列)的发现而开发
-SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，
-SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代(此处，由该氨基酸序列构成的肽能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞)。SEQ ID NO: 1至9所示的氨基酸序列相当于高致病性禽流感病毒A/Hong_ Kong/483/97 (H5N1)的内部蛋白 PA(SEQ ID NO: 2 和 3)、PBl (SEQ ID NO: 1、4、5、6 和 9)和 PB2 (SEQ ID N0:7和8)的氨基酸序列中存在的部分序列。对O)中的取代方式没有特别限制，只要由该氨基酸序列构成的肽能够诱导 HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞即可；反映在不同的禽流感病毒毒株(型或亚型)的相同抗原中的对应表位序列中已发生的已知氨基酸突变的取代方式可作为优选方式而提到。可提到下列作为此种取代的实例。
权利要求
1.能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞的肽， 所述肽包含(1)SEQ ID N0:7、3或8中的任一个所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:7、3或8中的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代，并具有9至11个氨基酸的长度。
2.权利要求1所述的肽，其中所述HLA是HLA-A*0201或HLA_AM402。
3.肽结合的脂质体，其中所述肽包括(1)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代， 具有9至11个氨基酸的长度，并且能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞；其中所述脂质体包括具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至 24个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，和脂质体稳定剂；并且其中所述肽与所述脂质体的表面结合。
4.权利要求3所述的肽结合的脂质体，其中所述HLA是HLA-A*0201或HLA_AM402。
5.权利要求3所述的肽结合的脂质体，其中所述磷脂是具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基的磷脂。
6.权利要求3所述的肽结合的脂质体，其中所述酰基是油酰基。
7.权利要求3所述的肽结合的脂质体，其中所述磷脂是选自下列的至少一种二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、琥珀酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺。
8.权利要求3所述的肽结合的脂质体，其中所述脂质体稳定剂是胆固醇。
9.权利要求3所述的肽结合的脂质体，其中所述肽与构成所述脂质体的磷脂膜中含有的、具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基或带有14至M个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂结合。
10.权利要求3所述的肽结合的脂质体，其中所述脂质体具有下列组成(A)具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至M个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂 1至99. 8 mol% ；(B)脂质体稳定剂0.2至75 mol%0
11.权利要求3所述的肽结合的脂质体，其中所述脂质体具有下列组成(I)具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至M个碳原子和一个不饱和键的烃基的酸性磷脂 1至85 mol% ；(II)具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至M个碳原子和一个不饱和键的烃基的中性磷脂 0. 01至80 mol% ；(III)具有带有14至M个碳原子和一个不饱和键的酰基、或带有14至M个碳原子和一个不饱和键的烃基的磷脂，带有与其结合的肽0. 2至80 mol% ；(IV)脂质体稳定剂0.2至75 mol%0
12.细胞毒性T淋巴细胞激活剂，包括肽， 其中所述肽包括(1)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代， 具有9至11个氨基酸的长度，并且能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。
13.细胞毒性T淋巴细胞激活剂，其包括权利要求3所述的肽结合的脂质体。
14.权利要求12或13所述的细胞毒性T淋巴细胞激活剂，其进一步包括CpG-DNA。
15.禽流感病毒疫苗，其包括肽， 其中所述肽包括(1)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代， 具有9至11个氨基酸的长度，并且能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。
16.禽流感病毒疫苗，其包括权利要求3所述的肽结合的脂质体。
17.权利要求15或16所述的禽流感病毒疫苗，其进一步包括CpG-DNA。
18.用于细胞毒性T细胞的活化的肽， 其中所述肽包括(1)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代， 具有9至11个氨基酸的长度，并且能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。
19.权利要求3所述的肽结合的脂质体，其用于细胞毒性T细胞的活化。
20.药物组合物，其用于细胞毒性T细胞的活化，其包括权利要求3所述的肽结合的脂质体和CpG-DNA。
21.肽，其用于针对禽流感的接种疫苗， 其中所述肽包括(1)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，或(2)SEQ ID N0:1至9的任一个所示的氨基酸序列，其中一个或两个氨基酸被取代， 具有9至11个氨基酸的长度，并且能够诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞。
22.权利要求3所述的肽结合的脂质体，其用于针对禽流感的接种疫苗。
23.药物组合物，其用于针对禽流感的接种疫苗，其包括权利要求3所述的肽结合的脂质体和CpG-DNA。
全文摘要
含有脂质体和与脂质体结合的肽的禽流感病毒疫苗，其中所述肽包含(1)SEQIDNO:1至SEQIDNO9的任一个所示的氨基酸序列，或(2)SEQIDNO:1至SEQIDNO9的任一个所示的氨基酸序列中通过一个或两个氨基酸取代产生的氨基酸序列，具有9至11个氨基酸残基的长度，并且可诱导HLA-限制性细胞毒性T淋巴细胞；且所述脂质体包括具有含有一个不饱和键的C14-24酰基、或含有一个不饱和键的C14-24烃基的磷脂，和脂质体稳定剂；并且其中所述肽与所述脂质体的表面结合。
文档编号C07K7/06GK102232083SQ20098014754
公开日2011年11月2日 申请日期2009年11月27日 优先权日2008年11月28日
发明者内田哲也, 小田洋, 松井政则, 梶野喜一, 种市麻衣子 申请人:国立大学法人北海道大学, 学校法人埼玉医科大学, 日本国立感染症研究所, 日油株式会社