专利名称：具有抗肿瘤活性的九肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及肽或肽样分子以及它们在治疗中的用途，尤其是作为抗肿瘤剂以及作为包括肿瘤疫苗在内的疫苗的佐剂的用途。
背景技术：
肽及其衍生物长期以来被认为是治疗方面受关注的分子。多种生物使用肽作为它们的宿主防御机制的一部分。已经从细菌和哺乳动物这样不同的物种中分离了抗微生物肽。通常，这些肽具有净正电荷并且在与细菌细胞膜的外部磷脂双层相互作用时倾向于形成两性的α-螺旋或β-折叠结构。在大多数情况下，抗菌作用的详细分子机制是未知的， 但是被分类为L类(溶解)肽的某些肽被认为与细菌细胞膜相互作用，形成离子通道、孔或能破坏膜的稳定性的其它结构。在一般种类的抗微生物溶解肽中，某些还表现出抗肿瘤活性。肿瘤细胞的真核细胞膜的性质与原核生物细胞膜相似，并且假定这可以提供这些溶解肽在体内对于肿瘤细胞的一定程度的选择性。具有两性特征和净正电荷的肽的一些抗肿瘤活性在WO 00/12542, WO 01/66147、WO 01/19852 和 Yang et al. Journal of P印tide Science[2004]，10，pp 37-46 (PMID :14959890)中有描述。通常，抗肿瘤活性需要的肽大于设计用于抗细菌用途的肽。在需要良好的靶细胞毒性和体内选择性之间进行的平衡在产生有用的抗肿瘤肽中造成了特殊的问题，部分原因是在肿瘤细胞和未转化的细胞的细胞膜之间仍存在高度的相似性。然而，人类和动物群体中癌症的盛行和它在死亡率中的作用意味着对能有效对抗肿瘤的新药物存在持续的需求。根除肿瘤或减小肿瘤大小或减少血液或淋巴系统中循环的癌细胞数在很多方面都是有利的减少疼痛或不适、防止转移、便于手术介入、延长生命。在研究肽的生物学活性期间，本发明的发明人已经鉴定出了一小组分子，其表现出特别好的对抗一系列癌症类型的活性并且对癌细胞比正常细胞具有良好的选择性。发明描述如下文详述，一种分子(LTX-315)是特别优选的，并且因此按照本发明的第一方面，提供了具有SEQ ID NO :23的式的化合物或该化合物的盐、酯或酰胺。一方面，本发明提供了具有下列特征的化合物，优选为肽a)由线性排列的9个氨基酸组成；b)在那9个氨基酸之中，5个是阳离子性的且4个具有亲脂性R基；c)所述9个氨基酸中的至少一个是非遗传编码的氨基酸或遗传编码氨基酸的修饰过的衍生物；以及任选地d)所述亲脂性和阳离子性残基的排列使得不多于两个任一类型的残基彼此相邻； 以及还任选地e)所述分子包含两对相邻的阳离子氨基酸和一对或两对相邻的亲脂性残基。阳离子氨基酸可以相同或不同，并且优选为赖氨酸或精氨酸，但可以是组氨酸或在PH 7.0时携带正电荷的任何非遗传编码的或修饰过的氨基酸。合适的非遗传编码的阳离子氨基酸和修饰过的阳离子氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸的类似物，例如高赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基庚二酸、二氨基丙酸和高精氨酸以及三甲基赖氨酸和三甲基鸟氨酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、4-氨基-1-甲脒基哌啶-4-羧酸和4-胍基苯丙氨酸。亲脂性氨基酸(即具有亲脂性R基的氨基酸)可以相同或不同，并且都具有R基， 所述R基具有至少7个非氢原子、优选至少8个或9个、更优选至少10个非氢原子。本文将具有亲脂性R基的氨基酸称为亲脂性氨基酸。通常所述亲脂性R基具有至少一个、优选两个环状基团，所述两个环状基团可以是稠合的或连接的。所述亲脂性R基可含有诸如0、N或S的杂原子，但通常不多于一个杂原子，优选为氮。该R基优选具有不多于2个极性R基，更优选没有或有一个极性R基，最优选没有极性R基。色氨酸是优选的亲脂性氨基酸，所述分子优选包含1-3个，更优选包含2或3个， 最优选包含3个色氨酸残基。可以并入的其它遗传编码的亲脂性氨基酸是苯丙氨酸和酪氨酸。优选地，亲脂性氨基酸中的一个是非遗传编码的氨基酸。最优选地，所述分子由3 个遗传编码的亲脂性氨基酸、5个遗传编码的阳离子氨基酸和1个非遗传编码的亲脂性氨基酸组成。在本文中，尽管严格来说D氨基酸不是遗传编码的，但是也不将其认为是“非遗传编码的氨基酸”，所述“非遗传编码的氨基酸”不应仅在立体特异性上，而应该是在结构上不同于20个遗传编码的L氨基酸。本发明的分子具有的氨基酸中的一些或全部可以以D 型存在，然而优选地，所有的氨基酸都是L型。当所述分子包含非遗传编码的亲脂性氨基酸(或氨基酸衍生物)时，该氨基酸的R 基优选包含不多于35个非氢原子，更优选不多于30个非氢原子，最优选不多于25个非氢原子。优选的非遗传编码的氨基酸包括2-氨基-3-(联苯基-4-基)丙酸(联苯丙氨酸)、2_氨基-3，3-二苯基丙酸(二苯丙氨酸)、2_氨基-3-(蒽-9-基)丙酸、2-氨基-3-(萘-2-基)丙酸、2-氨基-3-(萘-1-基)丙酸、2-氨基-3-[1，1' :4'，1〃 -三联苯基-4-基]-丙酸、2-氨基-3- (2,5,7-三叔丁基-IH-吲哚-3-基)丙酸、2-氨基_3_[1， 1' 3'，1〃 -三联苯基-4-基]-丙酸、2-氨基-3-[1，1' :2'，1〃 -三联苯基-4-基]-丙酸、2-氨基-3-(4-萘-2-基-苯基)-丙酸、2-氨基-3-(4' -丁基联苯基-4-基)丙酸、 2-氨基-3-[1，Γ :3'，1〃 -三联苯基-5'-基]-丙酸和2-氨基-3-(4-(2, 2-二苯基乙基)苯基)丙酸。在优选的实施方案中，本发明的化合物具有下面列出的式I-V之一，其中C代表上文所定义的阳离子氨基酸，L代表上文所定义的亲脂性氨基酸。氨基酸是共价连接的，优选通过肽键共价连接而产生真正的肽，或通过其它连接共价连接而产生拟肽物。可以修饰这些分子的自由氨基或羧基末端，优选对羧基末端进行修饰以去除负电荷，最优选将羧基端酰胺化，该酰胺基可以被取代。CCLLCCLLC(I) (SEQ ID NO 1)LCCLLCCLC(II) (SEQ ID NO 2)CLLCCLLCC(111) (SEQ ID NO 3)CCLLCLLCC (IV) (SEQ ID NO 4)
CLCCLLCCL(V) (SEQ ID NO 5)通常，拟肽物的特征在于保留其肽等同物的极性、三维大小和功能性(生物活性)，但是其中肽键已经被替换，通常被更稳定的连接所替换。“稳定”表示对水解酶的酶降解的抗性更强。通常，代替酰胺键的键(酰胺键代替物)保留了酰胺键的许多性质，例如构象、空间体、静电特征、形成氢键的可能性等。‘‘Drug Design and Development (药物设计与开发)〃 ,Krogsgaard, Larsen, Liljefors and Madsen(Eds) 1996, Horwood Acad. Pub 的第14章提供了设计和合成拟肽物技术的一般性讨论。在本发明的情况下，当分子是与膜而不是酶的特异性活性位点发生反应时，所述的确切模拟亲和力和效力或底物功能的某些问题就不相关了，并且可以基于给定的肽结构或所需官能团的基序容易地制备拟肽物。合适的酰胺键替代物包括以下基团=N-烷基化(Schmidt, R. et al.，Int. J. Peptide Protein Res. , 1995,46,47),逆反(retro-inverse)酉先胺(Chorev, M and Goodman, Μ. , Acc. Chem. Res, 1993，26，266)，硫代酰胺(Sherman D. B. and Spatola, Α. F. J. Am. Chem. Soc.，1990， 112,433)，硫酯、膦酸酯、酮亚甲基(Hoffman, R. V. and Kim, H. 0. J. Org. Chem.，1995，60， 5107)、羟基亚甲基、氟代乙烯基(AlImendinger，T. et al.，Tetrahydron Lett. , 1990,31, 7297)，乙烯基、亚甲基氨基(Sasaki, Y and Abe, Τ. Chem. Pharm. Bull. 1997 45，13)，亚甲 l^tft (Spatola, Α. F. ， Methods Neurosci, 1993,13，19) (Lavielle, S. et. al. ， Int. J. Peptide Protein Res.，1993，42，270)以及亚磺酰氨基(Luisi，G. et al. Tetrahedron Lett.1993，34，2391)。本发明的拟肽化合物可具有9个可识别的亚基，所述亚基与9个阳离子氨基酸和亲脂性氨基酸在大小和功能上大致相同。因此，术语“氨基酸”在本文中方便地用于表示拟肽化合物的等同亚基。而且，拟肽物可以具有与氨基酸的R基等同的基团，并且本文中关于合适的R基以及N和C末端修饰基团的讨论可以加以变通应用于拟肽化合物。正如〃 Drug Design and Development (药物设计禾口开发)〃 ,Krogsgaard et al. ,1996以及酰胺键的代替中所讨论的，拟肽物可以涉及用二拟肽结构或三拟肽结构代替较大的结构部分，并在这种情况下，涉及肽键的模拟部分，例如唑衍生的模拟物，可以用作二肽代替。然而，如上文所讨论的，仅酰胺键被代替的拟肽物以及拟肽主链是优选的。合适的拟肽物包括还原的肽，其中通过用诸如硼烷的还原剂或诸如氢化锂铝的氢化物试剂进行处理使酰胺键还原成亚甲基胺。所述还原在增加分子的整体阳离子性中具有增加的优势。其它拟肽物包括，例如通过酰胺官能化的聚甘氨酸的逐步合成而形成的类肽。 某些拟肽主链可以容易地从它们的肽前体获得，例如全甲基化的肽，合适的方法描述于 Ostresh, J. M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994)91，11138-11142。强碱性条件有助于 N-甲基化超过0-甲基化，并导致肽键的某些或全部氮原子和N末端氮的甲基化。优选的拟肽骨架包括聚酯、聚胺及它们的衍生物以及取代的烷和烯。拟肽物优选具有可以按照本文所讨论进行修饰的N和C末端。术语“氨基酸”包括β和Y氨基酸以及α氨基酸，还包括N取代的甘氨酸。本发明的化合物包括β肽和酯肽。如上文所讨论的，本发明的化合物包含至少一个，且优选一个非遗传编码氨基酸。 当该残基指定为L'时，优选的化合物由以下式表示
CCL' LCCLLC(I' ) (SEQ ID NO 6)CCLLCCLL' C(I" ) (SEQ ID NO 7)CCLL' CCLLCd" ‘ ) (SEQ ID NO 8)LCCLL' CCLC(II' ) (SEQ ID NO 9)特别优选的是式I和II的肽，并且在这些之中，尤其优选式I"的肽。优选地，所述肽不是LTX-302 (SEQ ID NO 11)(下文)。如表1中所示的以下肽(除了 LTX-302之外)是最优选的。表 1
名称
LTX-301 LTX-302 LTX-303
SEQ ID NO 10 11 12
序列
Dip-K-K-W-W-K-K-W-K-NH2 W-K-K-W-DiP-K-K-W-K-NH2 W-K-K-W-W-K-K-Dip-K-NH2LTX-304 LTX-305 LTX-306 LTX-307 LTX-308 LTX-309 LTX-310 LTX-312 LTX-313 LTX-314 LTX-315 LTX-316 LTX-317 LTX-318 LTX-319 LTX-320 LTX-321 LTX-323 LTX-324 LTX-325 LTX-326 LTX-327 LTX-329 LTX-331 LTX-332 LTX-333 LTX-334 LTX-335 LTX-336 LTX-338
其中
权利要求
1.具有SEQID N0:23的式的化合物(LTX-315)或该化合物的盐、酯或酰胺。
2.如权利要求1所述的化合物、盐、酯或酰胺，其与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。
3.如前述权利要求中任一项所述的化合物、盐、酯或酰胺，其与至少一种其它治疗成分组合。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物、盐、酯或酰胺，其与至少一种疫苗组合。
5.用于治疗人体或动物体的前述权利要求中任一项所述的化合物、盐、酯或酰胺或组合。
6.用于疫苗接种的权利要求5所述的化合物、盐、酯或酰胺或组合。
7.用作疫苗佐剂的权利要求6所述的化合物、盐、酯或酰胺或组合。
8.用作抗肿瘤剂的权利要求5-7中任一项所述的化合物、盐、酯或酰胺或组合。
9.权利要求1-8中任一项所述的化合物、盐、酯或酰胺或组合在制备药物中的用途。
10.权利要求9所述的化合物、盐、酯或酰胺或组合在制备治疗癌症的药物中的用途。
11.权利要求9或10所述的化合物、盐、酯或酰胺或组合在制备疫苗中的用途。
12.用于破坏肿瘤细胞膜的稳定性和/或透化肿瘤细胞膜的权利要求1-4中任一项所述的化合物、盐、酯或酰胺或组合。
13.药物包装，包括 (i)至少一种疫苗；和( )权利要求1-3中任一项所述的化合物、盐、酯或酰胺。
14.治疗肿瘤的方法，包括给予有需要的患者药学上有效量的权利要求1-4中任一项所述的化合物、盐、酯或酰胺或组合的步骤。
15.疫苗接种方法，包括给予患者药学上有效量的权利要求1-4中任一项所述的化合物、盐、酯或酰胺或组合的步骤。
全文摘要
本发明涉及肽或肽样分子以及它们在治疗中的用途，尤其是作为抗肿瘤剂的用途。
文档编号C07K7/06GK102232082SQ200980147514
公开日2011年11月2日 申请日期2009年9月11日 优先权日2008年11月26日
发明者欧斯汀·瑞克德尔, 约翰·希谷尔德·斯万德森, 约翰·阿蒙德·艾里克森, 邦特·艾瑞卡·浩格 申请人:莱特克斯生物制药股份有限公司