专利名称：抗多种脑膜炎球菌血清组的可注射性疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗学领域，尤其针对细菌性脑膜炎。
背景技术：
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是导致细菌性脑膜炎的革兰氏阴性人病原体[1]。脑膜炎奈瑟球菌与淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)密切相关，虽然明确判别脑膜炎球菌的一个特征是存在在所有病原性脑膜炎球菌中的多糖荚膜。在生物体荚膜多糖的基础上，已鉴定到12种脑膜炎奈瑟球菌血清组(A，B，C，H，I， K，L，29E, W135，X，Y和Ζ)。血清组A(MenA)是在亚撒哈拉非洲流行病的最普遍原因。血清组B和C引起发达国家的大多数病例，而血清组W135和Y引起发达国家的其余病例。除用于分类之外，荚膜多糖已被用于疫苗。多年来已知血清组Α，C，Y和W135荚膜多糖的可注射四价疫苗[2，3]，并批准用于人类。尽管它们在青少年和成人中有效，它们诱导的免疫反应差且保护持续时间短，不能用于婴儿[例如4]。本疫苗中的多糖未缀合， 以1 1 1 1重量比存在[5]。一旦从它们的冻干形式再重建，Mencevax ACWY 和 Menomune 都含有50g纯化的各种多糖。也已将血清组A，C，W135和Y的荚膜多糖以缀合物形式联合W-9]以产生四价疫苗，例如不含佐剂的Menactra 产品。已批准将缀合的血清组C寡糖用于人类，包括MenjugateTM[10，11]，Meningitec 和NeisVac-C 。产品Menjugate ，Meningitec 具有与CRM197载体缀合的寡糖抗原，而 NeisVac-C 利用了与破伤风毒素载体缀合的完全多糖(0_脱乙酰化)。然而，还需要改进抗血清组A，W135和Y的缀合疫苗及其制造。参考文献7中揭示的产品、方法和应用致力于解决这种需求，但是还可以进行更多的调整和改进。发明描述本发明提供一种含有荚膜糖的可注射免疫原性组合物，荚膜糖来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y中的至少两种，其中所述荚膜糖与载体蛋白缀合和/或是寡糖，其中该组合物每剂量含有< 50 μ g脑膜炎球菌糖。本发明还提供一种含有荚膜糖的可注射免疫原性组合物，荚膜糖来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y中的至少两种，其中所述荚膜糖与载体蛋白缀合和/或是寡糖， 其中该组合物还含有来自下列一种或多种的抗原(a)脑膜炎奈瑟球菌血清组B ； (b)流感嗜血杆菌B型；和/或(c)肺炎链球菌。本发明优选的16种组合物中包括的抗原是(1)脑膜炎奈瑟球菌血清组C，W135 和Y ；⑵脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y ； (3)脑膜炎奈瑟球菌血清组B，C，W135和 Y ； (4)脑膜炎奈瑟球菌血清组A，B，C，W135和Y ； (5)流感嗜血杆菌B型和脑膜炎奈瑟球菌血清组C，W135和Y ； (6)流感嗜血杆菌B型和脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y ； (7)流感嗜血杆菌B型和脑膜炎奈瑟球菌血清组B，C，W135和Y ； (8)流感嗜血杆菌B型和脑膜炎奈瑟球菌血清组A，B, C，W135和Y ； (9)肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组C，W135和 Y ； (10)肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y ； (11)肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组B，C，W135和Y ； (12)肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组A，B，C，W135和Y ； (13)流感嗜血杆菌B型，肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组C，W135和Y;(14)流感嗜血杆菌B型，肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组Α，C，W135和Y ； (15)流感嗜血杆菌B型， 肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组B，C，W135和Y ； (16)流感嗜血杆菌B型，肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组Α，B, C，W135和Y。本发明组合物中的糖抗原优选与载体缀合。本发明组合物中的糖抗原优选为寡糖。本发明组合物中的糖抗原最优选与寡糖缀合。脑膜炎球菌糖混合物本发明组合物含有来自脑膜炎奈瑟球菌血清组Α，C，W135和Y中的至少两种(即 2，3或4种)的荚膜糖。本发明组合物优选包含至少来自血清组C，W135和Y(即非MenA 糖)的脑膜炎奈瑟球菌糖。优选将各糖抗原组合而不消除各自的保护功效，虽然实际的免疫原性(例如ELISA效价)可能降低。优选来自一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清组的糖的混合物，例如含有来自血清组 A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, C+W135+Y, A+C+W135+Y 等的糖的组合物。优选的组合物含有来自血清组C和Y的糖。其它优选的组合物含有来自血清组C， W135和Y的糖。不优选含有仅来自血清组A和仅来自血清组C的荚膜糖的组合物(参看参考文献10，13和14)。当混合物含有来自血清组A和C的荚膜糖时，MenA糖MenC糖的比例(w/w)可大于1(例如2 1,3 1,4 1,5 1,10 1或更高)。当混合物含有来自血清组Y及血清组C和W135两者中的一种或两种的荚膜糖时，MenY糖MenW135糖的比例(w/w)可大于1(例如2 1,3 1,4 1,5 1,10 1或更高)和/或MenY糖MenC糖的比例 (w/w)可小于1 (例如1 2,1 3,1 4,1 5或更低)。 每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的典型含量为1 μ g-20 μ g，例如约1 μ g，约2. 5 μ g， 约4yg，约5yg，或约101^(表示为糖)。来自血清组A C W135 Y的糖，优选的比例(w/w)是1 1 1 1; 1 1 1 2 ；2 1 1 1 ；4 2 1 1 ；8 4 2 1 ；4 2 1 2 ；8 4 1 2 ；
4 2 2 1 ;2 2 1 1 ;4 4 2 1 ;2 2 1 2 ;4 4 1 2 ；禾口 2:2:2: 1。来自血清组C W135 Y的糖，优选的比例(w/w)是1 1 1 ； 1 1 2 ； 1 1 1 ;2 1 1 ;4 2 1 ;2 1 2 ;4 1 2 ;2 2 1 ；禾口 2 1 1。优选采用基本上等量的各种糖。荚膜多糖的纯化通常用来制备脑膜炎球菌荚膜多糖的方法包括以下步骤多糖沉淀(例如利用阳离子去垢剂)，乙醇分级分离，冷酚抽提(去蛋白质)和超速离心(去LPS)[例如参考文献 15]。然而，更优选的程序[7]包括多糖沉淀，然后用低级醇溶解沉淀的多糖。可以用阳离子去垢剂进行沉淀，例如四丁铵和十六烷基三甲基铵盐(例如溴盐)，或海地美溴铵和肉
5豆蔻基三甲铵盐。尤其优选十六烷基三甲基溴化铵(‘CTAB’)[16]。可以用低级醇例如甲醇，I"丙醇，2-丙醇，1- 丁醇，2- 丁醇，2-甲基-1-丙醇，2-甲基-2-丙醇，二醇等来溶解沉淀的物质，但乙醇尤其适于溶解CTAB-多糖复合物。优选将乙醇加入沉淀的多糖，达到乙醇终浓度在50%和95%之间。重新溶解后，可进一步处理该多糖以除去污染物。这在较少污染物也不能接受的情况下(例如人疫苗的生产)尤其重要。这一步通常包括一个或多个过滤步骤例如深度过滤，经活性碳过滤，大小过滤和/或超过滤。一旦过滤除去了杂质，可将多糖沉淀以进行进一步处理和/或加工。可用交换阳离子(例如加入钙或钠盐)方便地实现这一目的。作为纯化的替代方法，可用全部或部分合成来获得本发明的荚膜糖，例如参考文献17描述了 Hib合成，参考文献18的MenA合成。可化学修饰多糖。例如，可修饰多糖以封闭基团替代一种或多种羟基。这对降低血清组A的水解尤其有用[19](见下)。也可进行多糖的0-脱乙酰化。脑膜炎奈瑟球菌血清组B本发明的一些组合物包含来自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的抗原。不同于血清组A， C，W135和Y，MenB的荚膜糖因为与人自身抗原有相似性，所以不适用于作为人的免疫原。因此如果将一种糖抗原用于MenB，需要用一种经修饰的糖，例如唾液酸残基中的N-乙酰基被 N-酰基替代的糖。合适的N-酰基是C1-C8的酰基，例如N-丙酰基[20]。然而，优选采用多肽抗原而非糖抗原。因此该组合物可包含一种或多种多肽抗原，这些抗原诱导抗MenB感染的保护性免疫反应或抗MenB的杀菌性免疫反应。更一般地，该组合物优选在给予对象后可在该对象中诱导抗脑膜炎奈瑟球菌血清组B的两种或多种(例如2或幻高毒性谱系A4，ET-5和谱系3的抗体反应。已出版了 MC58和MenB菌株的基因组序列[21]，可从编码的多肽中选择合适的抗原[22]。参考文献22-32描述了优选的抗原。优选本发明组合物包含10种或更少的(例如9，8，7，6，5，4，3，幻纯化抗原混合物而非单一抗原，尤其优选该组合物不应包含复杂的或不确定的抗原混合物例如优选该组合物中不含有外膜囊泡(OMVs)。优选的组合物包含一种或多种以下五种抗原[32] (1) iNadA'蛋白，优选寡聚形式(例如三聚体形式)；⑵‘741，蛋白；(3) ‘936，蛋白；(4) ‘953，蛋白；和(5) '287' 蛋白。优选的MenB抗原含有菌株^96，MC58，95N477，和394/98之一中发现的氨基酸序列。蛋白287优选来自菌株四96，或更优选来自菌株394/98。蛋白741优选来自血清组B 菌株MC58、2996、394/98或95N477，或来自血清组C菌株90/18311。更优选菌株MC58。蛋白936、953和NadA优选来自菌株四96。当组合物包括特定蛋白抗原(如741或观7)时， 该组合物可包括大于1种变体形式的抗原，例如来自相同蛋白，但来自1种以上菌株。可作为串联或单独蛋白加入这些蛋白。来自MenB的‘NadA，(奈瑟球菌粘附素A)在参考文献25中示为蛋白‘961，(SEQ IDs 2943和2944)且在参考文献21中示为‘NMB1994，(也参见GenBank登录号11352904 和7227256)。蛋白的详细描述可见于参考文献33。当根据本发明使用时，NadA可采用多种形式。优选的NadA形式是截短或缺失变体，如参考文献四到31中所示。特别是优选没有其C末端膜锚的NadA (如对于菌株四96，缺失残基351-405 [SEQ ID NO :1])，在本文中有时用‘C’上标区分，例如NadA 。在大肠杆菌(E.coli)中表达无其膜锚结构域的NadA使蛋白分泌到培养物上清中，伴随去除其23聚体的前导肽(如对于菌株2996，留下327聚体 [SEQ ID NO :2])。无前导肽的多肽在本文中有时用‘NL，上标区分，例如NadAw或NadA(G) (Ν 。优选的NadA多肽具有的氨基酸序列(a)与SEQ ID NO :2有50%或更多同一性(例如 60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多)；和/或(b)包括至少η个来自SEQ ID NO 1的连续氨基酸，其中 η 为 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、 90、100、150、200、250或更多)。对于(b)优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25或更多)来自SEQ ID NO IC末端和/或N末端的氨基酸(如NadAfc)、 NadA(NL\NadA(c)(NL))0其它优选的片段包括来自SEQ ID NO=I的表位，SEQ ID N0:1尤其优选的片段是SEQ ID NO :2。这写不同的序列包括NadA变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。各种NadA序列示于参考文献34的图9。来自MenB的‘741，蛋白示于参考文献25 (SEQ IDs 2535和2536)且在参考文献 21中示为‘NMB1870，(也参见GenBank登录号GI :7227128)。血清组A中的对应蛋白[35] 具有GenBank登录号7379322。741是天然脂蛋白。当根据本发明使用时，741蛋白可采用多种形式。优选的741形式是截短或缺失变体，如参考文献四到31所示。特别741的N末端可缺失到和包括其聚甘氨酸序列(即对于菌株MC58，缺失残基1到72 [SEQ ID NO 3]), 在本文中有时用‘AG’前缀区分。此缺失能提高表达。缺失也去除741的脂化位点。优选的741序列具有氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO :3有50%或更多同一性(例如60%、70%、 80%、90%、95%、99%或更多)；和/或(b)包括至少η个来自SEQ ID NO :3的连续氨基酸， 其中 η 为 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、 200、250或更多)。对于(b)优选的片段包括来自741的抗原表位。其它优选的片段缺乏 1 个或多个(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多)来自 SEQ ID N0:3C 末端和 / 或N末端的氨基酸。这些序列包括741变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。各种741序列可见于参考文献31的SEQ IDs 1-22和参考文献36的 SEQ IDs 1-23。参考文献 37 的 SEQ IDs l-2990蛋白741是引起抗脑膜炎球菌抗体反应的极有效抗原，它在所有脑膜炎球菌血清组中表达。系统发育分析显示蛋白分裂成2组，这些分裂中之一再次分裂，产生总共3个变体[38]，尽管抗特定变体培养的血清在相同变体组中是杀菌性的，它对表达另2个变体之一的菌株无活性，即有变体内交叉保护，但没有变体间交叉保护[36，38]。因此，为了最大交叉菌株效率，组合物优选应包括大于1个蛋白741变体。来自各变体的示范序列在本文的SEQ IDs 10、11和12中给出，起始是741脂蛋白形式中脂类共价附着的N末端半胱氨酸残基。因而，组合物优选应包括下列至少两种⑴第1种蛋白，所含氨基酸序列与SEQ ID NO 10有至少序列同一性和/或所含氨基酸序列由来自SEQ ID NO 10的至少χ个连续氨基酸片段组成；⑵第2种蛋白，所含氨基酸序列与SEQ ID Ν0:11有至少序列同一性和/或所含氨基酸序列由来自SEQ ID NO=Il的至少y个连续氨基酸片段组成；和(3) 第3种蛋白，所含氨基酸序列与SEQ ID NO :12有至少序列同一性和/或所含氨基酸序列由来自SEQ ID NO :12的至少ζ个连续氨基酸片段组成。a值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5 或更多。b 值至少是 85，例如 86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5 或更多。c 值至少是 85，例如 86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、99. 5或更多。a、b和c值彼此内在不相关。χ值至少是7，例如8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、 60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y 值至少是 7，例如 8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、 100、120、140、160、180、200、225、250。ζ 值至少是 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、 160、180、200、225、250。x、y和ζ值彼此内在不相关。任何特定741氨基酸序列优选不属于一种以上类别(1)、(2)和(3)。因此，任何特定741序列仅属于类别(1)、(2)和(3)之一。因而优选蛋白⑴与蛋白⑵有小于的序列同一性；蛋白⑴与蛋白(3)有小于的序列同一性；蛋白(2)与蛋白(3)有小于的序列同一性。i值是60或更多(例如 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90 等)且至多是 a。j 值是 60 或更多(例如 61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90 等)且至多是 b。 k 值是 60 或更多(例如 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等)且至多是c。i、j和k值彼此内在不相关。
来自血清组B的‘936，蛋白示于参考文献25 (SEQ IDs观83和观84)且在参考文献21中示为‘NMB2091，(也参见GenBank登录号GI :7227353)。血清组A中的对应基因具有GenBank登录号7379093。当根据本发明使用时，936蛋白可采用多种形式。优选的936形式是截短或缺失变体，如参考文献四到31中所示。特别是936的N末端前导肽可缺失(即对于菌株MC58，缺失残基1到23[SEQID NO 4])以产生936(Ν 。优选的936 序列具有氨基酸序列(a)与SEQ ID而4有50%或更多同一性(例如60%、70%、80%、 90%、95%、99%或更多)；和/或(b)包括至少η个来自SEQ ID NO :4的连续氨基酸，其中 η 为 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多)。对于(b)优选的片段包括来自936的抗原表位。其它优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)来自SEQ ID N0:4C末端和/或 N末端的氨基酸。这些序列包括936变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。来自血清组B的‘953，蛋白示于参考文献25 (SEQ IDs四17和四18)且在参考文献21中示为‘NMB1030，(也参见GenBank登录号GI :7226269)。血清组A中的对应蛋白 [35]具有GenBank登录号7380108。当根据本发明使用时，953蛋白可采用多种形式。优选的953形式是截短或缺失变体，如参考文献四到31中所示。特别是953的N末端前导肽可缺失(即对于菌株MC58，缺失残基1到19[SEQID NO 5])以产生953(Ν 。优选的953 序列具有氨基酸序列(a)与SEQ ID而5有50%或更多同一性(例如60%、70%、80%、 90%、95%、99%或更多)；和/或(b)包括至少η个来自SEQ ID NO :5的连续氨基酸，其中 η 为 7 或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多)。对于(b)优选的片段包括来自953的抗原表位。其它优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)来自SEQ ID N0:5C末端和/或N末端的氨基酸。这些序列包括953变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。953的等位基因形式可见于参考文献观的
图19。来自血清组B的187，蛋白示于参考文献25(SEQ IDs 3103和3104)且在参考文献21中示为‘NMB2132’，在参考文献13中示为‘GNA2132，(也参见GenBank登录号GI 7227388)。血清组A中的对应蛋白[35]具有GenBank登录号7379057。当根据本发明使用时，287蛋白可采用多种形式。优选的287形式是截短或缺失变体，如参考文献四到31中所示。特别是观7的N末端可缺失到和包括其聚甘氨酸序列(例如对于菌株MC58，缺失残基1到对得到AG287[SEQ ID NO :6])。此缺失能提高表达。优选的287序列具有氨基酸序列(a)与 SEQ ID NO :6有 50%或更多同一性(例如 60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多)；和/或(b)包括至少η个来自SEQ ID NO 6的连续氨基酸，其中η为7或更多(例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。对于 (b)优选的片段包括来自287的抗原表位。其它优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)来自SEQID NO :6C末端和/或N末端的氨基酸。这些序列包括287变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。287的等位基因形式可见于参考文献观的图5和15、参考文献25的实施例13和图21 (SEQ IDs 3179 到 3184)。5种基本MenB抗原(NadA，741，953，936和观7)可作为5种单独蛋白存在于组合物中，但优选至少2种抗原表达为单一多肽链(‘杂合’蛋白[参考文献四到31])，即5种抗原形成少于5种多肽。杂合蛋白提供2个主要优点首先，通过加入克服问题的合适杂合伴侣来协助本身不稳定或表达差的蛋白；第二，简化商业生产，因为仅需使用1种表达和纯化便于生成2个单独有用的蛋白。发明组合物中包括的杂合蛋白可包含2种或更多(即2、 3、4或5)的5种基本抗原。优选由5种基本抗原中的2种组成的杂合体。在5种基本抗原的组合内，抗原可存在于大于1种杂合蛋白和/或作为非杂合蛋白。然而，抗原优选作为杂合体或非杂合体存在，但不是两者，尽管包括蛋白741作为杂合和非杂合(优选脂蛋白)抗原可能有用，特定是当使用一种以上741变体时。杂合蛋白可由公式NH2-A-[-X-L-]n-B-C00H表示，其中X是5个基本抗原之一的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列；η是2、3、4或5。如果-X-部分在其野生型形式中有前导肽序列，它可包括或省略于杂合蛋白。在一些实施方案中，将缺失前导肽，除了位于杂合蛋白N末端的-X-部分，即保留X1的前导肽， 但省略的前导肽。这相等于缺失所有前导肽并使用&的前导肽作为-A-部分。对于各n[-X-L_]例子，接头氨基酸序列_L_可存在或缺乏。例如，当n = 2时， 杂合体可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH 等。接头氨基酸序列-L-通常短(例如20个或更少氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、 11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括促进克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头(即包括Glyn, 其中η = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、和组氨酸标志(即Hisn,其中η = 3、4、5、6、7、8、 9、10或更多)。其它合适接头氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO 9), Gly-Ser 二肽从BamHI限制性位点形成，从而协助克隆和操作， (Gly4)四肽是典型的聚甘氨酸接头。如果Xlri是AG蛋白且Ln是甘氨酸接头，这可相等于Xn+1不是ΔG蛋白且缺乏Ln。-A-是任选的N末端氨基酸序列。它通常短(例如40个或更少氨基酸，即39、38、 37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白运输的前导序列或者促进克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标志，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合适的 N末端氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。如果&缺乏其自身的N末端甲硫氨酸，-A-优选是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)。-B-是任选的C末端氨基酸序列。它通常短(例如40个或更少氨基酸，即39、38、 37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白运输的前导序列、促进克隆或纯化的短肽序列(如包括组氨酸标志，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、或提高蛋白稳定性的序列。其它合适的C末端氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。最优选η为2。用于发明的二抗原杂合体包括NadA和741 ；NadA和936 ；NadA和 953 ；NadA 和 287 ；741 和 936 ；741 和 953 ；741 和 287 ；936 和 953 ；936 和 287 ；953 和 287。 2种优选蛋白是 是936且&是741 ；X1是287且&是953。发明的2种尤其优选杂合蛋白如下
权利要求
1.一种含有荚膜糖的可注射免疫原性组合物，所述荚膜糖来自四种脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y，其特征在于(i)荚膜糖与载体蛋白缀合，四个血清组有单独缀合物；(ii)所述缀合物具有蛋白过量的糖蛋白比例(w/V)；和(iii)所述组合物含有每剂 10 μ g-25 μ g的脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖，每种糖的量为每剂2. 5 μ g、5 μ g或10 μ g。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述A、C、W135和Y糖为每剂5μg或每剂 2.5”。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述A、C、W135和Y糖为每剂5μ g。
4.一种含有荚膜糖的可注射免疫原性组合物，所述荚膜糖来自四种脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y，其特征在于(i)荚膜糖与载体蛋白缀合，四个血清组有单独缀合物；(ii)所述缀合物具有蛋白过量的糖蛋白比例(w/V) ； (iii)所述组合物含有每剂 10 μ g-25 μ g的脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖；和(iv)糖以C W135 Y比(w/w) 1 1 2、 2 1 2、4 1 2、2 2 1、和 2 1 1 存在。
5.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述糖以A C W135 Y比(w/ w)l 1 1 2、4 2 1 1、8 4 2 1、4 2 1 2、8 4 1 2、4 2 2 1、 2 2 1 1、4 4 2 1、2 2 1 2、4 4 1 2 或 2 :2:2: 1 存在。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述糖具有相同的载体蛋白。
7.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述糖具有相同的载体蛋白。
8.如任一前述权利要求所述的组合物，其特征在于，所述载体蛋白是白喉类毒素。
9.一种含有荚膜糖的可注射免疫原性组合物，所述荚膜糖来自四种脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y，其特征在于(i)荚膜糖与载体蛋白缀合，四个血清组有单独缀合物， 其中所述载体蛋白是白喉类毒素；(ii)所述缀合物具有蛋白过量的糖蛋白比例(w/V)； 和(iii)所述组合物含有每剂10 μ g-25 μ g的脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖。
10.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述糖以A C W135 Y比(w/ w)l 1 1 1、1 1 1 2、2 1 1 1、4 2 1 1、8 4 2 1、 4 2 1 2、8 4 1 2、4 2 2 1、2 2 1 1、4 4 2 1、2 2 1 2、 4:4:1:2 或 2:2:2:1 存在。
11.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，各种糖量基本相等。
12.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，各种糖量基本相等。
13.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，各种脑膜炎球菌糖抗原量为每剂 2. 5 μ g、4 μ g或5 μ g,以糖表示。
14.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，各种脑膜炎球菌糖抗原量为每剂 2. 5 μ g、4 μ g或5 μ g,以糖表示。
15.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，四种缀合物各具有达1 5的糖/蛋白比例(w/w)。
16.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，四种缀合物各具有达1 5的糖/蛋白比例(w/w)。
17.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，四种缀合物各具有达1 5的糖/蛋白比例(w/w)。
18.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述荚膜糖通过接头基团与载体蛋白缀合O
19.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述荚膜糖通过接头基团与载体蛋白缀合 O
20.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述荚膜糖通过接头基团与载体蛋白缀合O
21.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还含有氯化钠。
22.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，还含有氯化钠。
23.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，还含有氯化钠。
24.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的体积是0.5ml。
25.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物的体积是0.5ml。
26.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物的体积是0.5ml。
27.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还含有来自下列一种或多种的抗原(a) 脑膜炎奈瑟球菌血清组B ； (b)流感嗜血杆菌B型；和/或(c)肺炎链球菌。
28.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，还含有来自下列一种或多种的抗原(a) 脑膜炎奈瑟球菌血清组B ； (b)流感嗜血杆菌B型；和/或(c)肺炎链球菌。
29.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，还含有来自下列一种或多种的抗原(a) 脑膜炎奈瑟球菌血清组B ； (b)流感嗜血杆菌B型；和/或(c)肺炎链球菌。
30.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的脑膜炎球菌糖抗原是与载体蛋白缀合的寡糖。
31.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的脑膜炎球菌糖抗原是与载体蛋白缀合的寡糖。
32.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的脑膜炎球菌糖抗原是与载体蛋白缀合的寡糖。
33.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还含有铝盐佐剂。
34.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，还含有铝盐佐剂。
35.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，还含有铝盐佐剂。
36.如前任一权利要求所述的组合物的用途，其特征在于，用于制备在患者中引起免疫反应以预防和/或治疗细菌性脑膜炎的疫苗。
全文摘要
一种含有荚膜糖的可注射免疫原性组合物，荚膜糖来自四种脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y，(i)荚膜糖与载体蛋白缀合，四个血清组有单独缀合物；(ii)脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和Y的缀合物以2∶1∶1∶1的糖重量比例存在；和(iii)该组合物每剂量含有10μg-25μg的脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖。还公开了组合物用于制备在患者中引起预防和/或治疗细菌性脑膜炎的免疫反应的疫苗的用途。
文档编号C07K14/22GK102302776SQ20101011948
公开日2012年1月4日 申请日期2004年1月30日 优先权日2003年1月30日
发明者P·科斯坦蒂诺 申请人:诺华疫苗和诊断有限公司