专利名称：一种从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(ΔFc)的方法
技术领域：
本发明涉及生物活性物质的分离纯化方法，尤其涉及一种从鹅血中分离免疫球蛋 白IgY(AFc)的方法。
背景技术：
我国是鸭鹅等水禽饲养的主要国家，年饲养总量达到43亿只，占世界总量的75% 以上。水禽血液是食品加工过程的下脚料，部分加工成熟血块食用，大部分被当废料直接排 到自然界中，不仅浪费了宝贵的生物资源，而且对环境造成了一定的污染。动物血液是重要 的蛋白质和矿物质来源，目前我国已部分利用了猪血、牛血等畜血资源制备血粉、提取蛋白 及其他生物活性成分，而水禽血液尚未得到充分利用。鹅血是一种高蛋白资源，蛋白含量高 达19%，含有大量球蛋白，具有增强机体免疫力、抗癌等多种功能，已经越来越引起人们的 关注。鹅血中免疫球蛋白包括IgM、IgA和υ -链免疫球蛋白。υ -链免疫球蛋白在鹅体 液中以IgY和IgY(AFc)两种形式存在，是鹅抗感染免疫的最主要抗体。IgY的分子量为 180kDa,由两条重链(67kDa)和两条轻链(23kDa)组成，重链包括一个可变区和四个恒定区 (CHl 4)，没有铰链区。IgY(AFc)的分子量为130kDa，也由两条重链和两条轻链组成，轻 链与IgY相同，但重链分子量仅37 42kDa，与IgY重链相比缺失了两个末端恒定区(CH3 和CH4)。由于IgY(AFc)分子结构的特殊性，免疫原性较低，具有很高的开发利用价值。经 文献检索发现，邱翔等(西南民族大学学报，2004，30 (3) 331-333)采用辛酸-硫酸铵沉淀 法、硫酸铵沉淀和DEAE纤维素层析法从鸭血浆中提取IgY，并进行了比较，发现辛酸_硫酸 铵法简便、快速，所获得的IgY纯度较高，但未报道具体数值。卜春文(食品科技，2004，(5) 79-81,85)从鹅血中提取IgY，收率达85%以上。以上两篇文献均未有效分离IgY( Δ Fe)。 日本专利(专利号JP2002030100A，
公开日2002. 1.29)采用免疫亲和法从家禽的卵黄中提 取IgY ( Δ Fe)。因此，关于从鹅血等水禽血液中分离纯化得到高纯度的IgY (AFc),未见有 文献报道。鹅血中脂肪含量高，通过降低温度和静置，去除分层的脂肪，并结合二氧化硅吸 附，可以有效去除血液中的脂肪。辛酸沉淀法是免疫球蛋白蛋白质分离的有效方法，且辛 酸用量少，去除容易。混合模式吸附层析是近年来发展起来的新型层析技术，其功能配基 同时兼有疏水基团和离子交换基团，配基密度通常比较高，吸附容量大，可以通过静电相吸 来强化吸附或静电排斥来协助解吸，特别适合于大规模的分离纯化。本发明将混合模式吸 附层析与辛酸沉淀两种分离方法有效结合，用混合模式吸附剂直接处理辛酸沉淀的上清 液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量、高抗体选择性的特性，建立起一种从鹅血中分离 IgY ( δ Fe)免疫球蛋的经济高效方法，可以推广应用到其它水禽血液的处理。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从鹅血中分离免疫球蛋白
3IgY(AFc)的方法。从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(AFc)的方法包括如下步骤1)配置0. IM的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将新鲜鹅血与抗凝剂按照体积比为 9 1的比例混合均勻，用离心机以2500 3000rpm转速离心10 20分钟，得到血浆，4 8°C静置5 12小时，吸除上层聚集的脂肪，加入二氧化硅粉末进一步脱脂，二氧化硅粉末 的加入量为300 1000mg/ml血浆，室温搅拌30 60分钟，过滤，得到脱脂血浆；2)将脱脂血浆与浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4 5)按照体积比为1 4混合均勻，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30 100μ 1/ml稀释血浆，4 8°C静 置2 4小时，用离心机以8000-10000rpm转速离心20 30分钟，取上清液，得到免疫球 蛋白IgY(AFc)粗品溶液；3)调节免疫球蛋白IgY(AFc)粗品溶液的pH至5 7，用0. 45 μ m滤膜过滤后， 上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰 对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY(AFc)溶液；4)将免疫球蛋白IgY(AFc)溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度> 95%的免疫球蛋白 IgY(AFc)固体产品。所述的混合模式吸附剂为MEP Hypercel，或者以4_巯乙基吡啶或2_巯甲基咪唑 为功能配基的层析介质。所述的平衡缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，PH值为 5 7。所述的洗脱缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH值为3 4. 5。本发明针对鹅血等水禽血液资源的综合开发，通过辛酸沉淀与混合模式吸附层析 的有机结合，用于鹅血中免疫球蛋白IgY(AFc)的分离纯化。采用混合模式吸附剂直接处 理辛酸沉淀后的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量和高抗体选择性，提高分离 效率，简化分离步骤，得到一个经济高效的提取免疫球蛋白IgY(AFc)的方法。本发明的优 点在于1)快速，成本低廉；2)工艺简单，易于放大；3)过程处理量大，分离效率高；4)免疫 球蛋白IgY(AFc)的纯度高。
附图是本发明混合模式吸附层析分离鹅血浆免疫球蛋白的电泳谱图。
具体实施例方式本发明提供一种从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(AFc)的方法。将新鲜抗凝血液离 心去除红细胞，经过脱脂处理，得到脱脂血浆；用辛酸法沉淀去除部分杂蛋白，得到上清液； 将上清液通过混合模式吸附层析柱进行分离，得到免疫球蛋白IgY(AFc)。通过本发明分离 得到的免疫球蛋白IgY(AFc)纯度大于95%。从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(AFc)的方法 包括如下步骤1)配置0. IM的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将新鲜鹅血与抗凝剂按照体积比为 9 1的比例混合均勻，用离心机以2500 3000rpm转速离心10 20分钟，得到血浆，4 8°C静置5 12小时，吸除上层聚集的脂肪，加入二氧化硅粉末进一步脱脂，二氧化硅粉末 的加入量为300 1000mg/ml血浆，室温搅拌30 60分钟，过滤，得到脱脂血浆；2)将脱脂血浆与浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4 5)按照体积比为1 4混合均勻，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30 100μ 1/ml稀释血浆，4 8°C静 置2 4小时，用离心机以8000-10000rpm转速离心20 30分钟，取上清液，得到免疫球 蛋白IgY(AFc)粗品溶液；3)调节免疫球蛋白IgY(AFc)粗品溶液的pH至5 7，用0. 45 μ m滤膜过滤后， 上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰 对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY(AFc)溶液；4)将免疫球蛋白IgY(AFc)溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度> 95%的免疫球蛋白 IgY(AFc)固体产品。所述的混合模式吸附剂为MEP Hypercel，或者以4_巯乙基吡啶或2_巯甲基咪唑 为功能配基的层析介质。所述的平衡缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，PH值为 5 7。所述的洗脱缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH值为3 4. 5。以下通过实施例对本发明作进一步的描述实施例1取新鲜鹅血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，4°C静置5小时，除去上层的脂肪，然后按照每 毫升血浆加入二氧化硅300mg，室温搅拌30分钟，过滤得到脱脂血浆。取5ml脱脂血浆，加 入5ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4)混合均勻，得到稀释血浆10ml，加入600 μ 1辛酸， 搅拌均勻，4°C静置2小时，待杂蛋白沉淀完全，以SOOOrpm离心30分钟，得到上清液9. 5ml。 上清液用0. 45 μ m滤膜过滤，调节pH值为7. 0，取Iml作为进样样品。层析柱(内径1cm) 中填充5ml MEP Hypercel混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾 缓冲液(PH7. 0)，洗脱液为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4. 0)，收集洗脱组分，脱盐， 冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY ( Δ Fe)，电泳分析纯度为96. 8 %。实施例2取新鲜鹅血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离 心机以3000rpm转速离心15分钟，除去红细胞，8°C静置12小时，除去上层的脂肪，然后按 照每毫升血浆加入二氧化硅lOOOmg，室温搅拌60分钟，过滤得到脱脂血浆。取5ml脱脂血 浆，加入15ml的60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 5)混合均勻，得到稀释血浆20ml，加入 600 μ 1辛酸，搅拌均勻，4°C静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm离心20分钟，得到 上清液19. 6ml。上清液用0.45 μ m滤膜过滤，调节pH值为5.0，取2ml作为进样样品。层 析柱(内径Icm)中填充5ml MEP Hypercel混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的磷酸氢二 钠_磷酸二氢钾缓冲液(PH5. 0)，洗脱液为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3. 0)，收集 洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，电泳分析纯度为97. 2%。实施例3取新鲜鹅血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，4°C静置8小时，除去上层的脂肪，然后按照每 毫升血浆加入二氧化硅300mg，室温搅拌60分钟，过滤得到脱脂血浆。取5ml脱脂血浆，加 入20ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5. 0)混合均勻，得到稀释血浆25ml，加入2500 μ 1 辛酸，搅拌均勻，8°C静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm离心20分钟，得到上清液 23.8ml。上清液用0.45 μ m滤膜过滤，调节pH值为6.0，取Iml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml MEP Hypercel混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的磷酸氢二钠-磷酸 二氢钾缓冲液(PH6. 0)，洗脱液为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3. 5)，收集洗脱组 分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，电泳分析纯度为95. 6%。实施例4取新鲜鹅血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，4°C静置5小时，除去上层的脂肪，然后按照每 毫升血浆加入二氧化硅500mg，室温搅拌30min，过滤得到脱脂血浆。取5ml脱脂血浆，加入 5ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5. 0)混合均勻，得到稀释血浆10ml，加入300 μ 1辛酸， 搅拌均勻，4°C静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以SOOOrpm离心30分钟，得到上清液9. 5ml。 上清液用0. 45 μ m滤膜过滤，调节pH值为6. 0，取2ml作为进样样品。层析柱(内径1cm) 中填充5ml以MEP Hypercel为功能配基的混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的磷酸氢二 钠_磷酸二氢钾缓冲液(PH6. 0)，洗脱液为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4. 0)，收集 洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，电泳分析纯度为95. 8%。实施例5取新鲜鹅血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，4°C静置10小时，除去上层的脂肪，然后按照 每毫升血浆加入二氧化硅600mg，室温搅拌30min，过滤得到脱脂血浆。取5ml脱脂血浆，加 入5ml的60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5. 0)混合均勻，得到稀释血浆10ml，加入500 μ 1 辛酸，搅拌均勻，8°C静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以SOOOrpm离心30分钟，得到上清液 9. 5ml。上清液用0. 45 μ m滤膜过滤，调节pH值为5. 0，取Iml作为进样样品。层析柱(内 径1cm)中填充5ml以4-巯乙基吡啶为功能配基的纤维素介质，平衡缓冲液为20mM的磷酸 氢二钠_磷酸二氢钾缓冲液(PH5. 0)，洗脱液为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3. 0)， 收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，电泳分析纯度为96. 3%。实施例6取新鲜鹅血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，8°C静置15小时，除去上层的脂肪，然后按照 每毫升血浆加入二氧化硅800mg，室温搅拌40min，过滤得到脱脂血浆。取5ml血浆，加入 IOml的60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 5)混合均勻，得到稀释血浆15ml，加入600 μ 1 辛酸，搅拌均勻，8°C静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm离心20分钟，得到上清液 15.2ml。上清液用0.45-滤膜过滤，调节pH值为7.0，取2ml作为进样样品。层析柱(内径 Icm)中填充5ml以2-巯甲基咪唑为功能配基的纤维素介质，平衡缓冲液为20mM的磷酸氢 二钠_磷酸二氢钾缓冲液(PH7. 0)，洗脱液为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4. 5)，收 集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，电泳分析纯度为98. 0%。
权利要求
一种从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(ΔFc)的方法，其特征在于包括如下步骤1)配置0.1M的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将新鲜鹅血与抗凝剂按照体积比为9∶1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，得到血浆，4～8℃静置5～12小时，吸除上层聚集的脂肪，加入二氧化硅粉末进一步脱脂，二氧化硅粉末的加入量为300～1000mg/ml血浆，室温搅拌30～60分钟，过滤，得到脱脂血浆；2)将脱脂血浆与浓度为60mM的乙酸 乙酸钠缓冲液(pH4～5)按照体积比为1～4混合均匀，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30～100μl/ml稀释血浆，4～8℃静置2～4小时，用离心机以8000 10000rpm转速离心20～30分钟，取上清液，得到免疫球蛋白IgY(ΔFc)粗品溶液；3)调节免疫球蛋白IgY(ΔFc)粗品溶液的pH至5～7，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY(ΔFc)溶液；4)将免疫球蛋白IgY(ΔFc)溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度＞95％的免疫球蛋白IgY(ΔFc)固体产品。
2.根据权利要求1所述的一种从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(AFc)的方法，其特征在 于所述的混合模式吸附剂为MEP Hypercel，或者以4-巯乙基吡啶或2-巯甲 基咪唑为功能 配基的层析介质。
3.根据权利要求1所述的一种从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(AFc)的方法，其特征在 于所述的平衡缓冲液为磷酸氢二钠_磷酸二氢钾缓冲液，PH值为5 7。
4.根据权利要求1所述的一种从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(AFc)的方法，其特征在 于所述的洗脱缓冲液为柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液，pH值为3 4. 5。全文摘要
本发明公开了一种从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(ΔFc)的方法。具体步骤如下1)制备脱脂血浆，取新鲜血液，离心，除去红细胞，进行脱脂，得脱脂血浆。2)辛酸沉淀，向血浆中加入辛酸达到一定浓度，沉淀去除杂蛋白，离心分离，取上清液。3)柱层析，用填充有混合模式吸附剂的层析柱分离上清液，收集洗脱峰。4)脱盐和干燥，将收集液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的免疫球蛋白IgY(ΔFc)。本发明所开发方法的特色在于设计了一条新的分离工艺，可以从鹅血中分离免疫球蛋白IgY(ΔFc)，方法的关键在于从辛酸沉淀的上清液中直接提取免疫球蛋白IgY(ΔFc)，具有操作步骤简单，分离纯化因子高的优点，可以推广应用于其它水禽血液的处理。
文档编号C07K1/22GK101899110SQ20101022868
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者姚善泾, 林东强, 童红飞 申请人:浙江大学