专利名称：一种人工合成的新型抗血栓多肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽，尤其涉及经人工修饰并合成的具有抗血栓活性的多肽。本发明 还涉及该多肽的制备方法以及作为抗血栓剂的应用，属于生物医药领域。
背景技术：
随着人口的老龄化、心血管疾病发病率的增加，现行抗血栓标准药物已经不能适 应和满足现有需求，该类药物的市场容量仍在不断增大。目前的抗血栓药物未能满足活性 好、药效可预测、可口服、起效快、副作用小等要求。因而，鉴于市场机会较大和现有药物各有缺陷，寻找安全，方便的新型抗栓药物已 成为国内外医药界的研究热点，与此同时，对于此类药物的创新性研究，特别是对多肽及可 口服的小分子类肽或化合物的研究也就具有更加重要的意义和市场前景。动脉粥样硬化是血管系统疾病的主要病理基础，动脉粥样硬化斑块破裂和继发的 血栓形成是大多数急性血管事件发生的主要原因。近年研究表明，动脉粥样硬化的形成和 斑块的破裂与细胞外基质的破坏和重构有密切关系，而基质金属蛋白酶(MMPs)是一族Zn2+ 依赖型蛋白水解酶，主要负责降解细胞外基质，其表达水平的增高和活性的增强都能够加 速不稳定斑块及血栓的形成。因此，基质金属蛋白酶抑制剂(MMPI)成为了药物化学领域研 究的一个热点，越来越多的研究试图通过抑制MMI3S活性以延缓动脉粥样硬化的发生和防 止斑块破裂、血栓形成。其中，基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)属于半胱氨酸蛋白酶超 家族，为MMPI中一组多功能因子家族，能特异的抑制MMPs的活性，其N端功能区半胱氨酸 残基与MMPs的锌离子活性中心结合，C端功能区与MMPs的其他部位结合，以1 1的比例 非共价键结合形成MMP-TIMP复合体，阻断MMPs与底物的结合，抑制MMI3S蛋白水解活性。因 此，调节MMPs的活性可能是心血管疾病治疗，特别是血栓治疗的一个新方向，对其拮抗剂 的进一步研究将促进临床的早日应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种人工合成的具有良好抗血栓活性的新型多肽BNC， 其氨基酸序列为Pyr-Asn-Cys。根据基质金属蛋白酶抑制剂(MMPI)的设计思路，基于底物的MMPI的设计理论，利 用固相多肽合成技术，设计完成了新型抗血栓多肽BNC，其氨基酸序列为Pyr-Asn-Cys，分 子量为346。本发明的目的之二是提供一种具有良好抗血栓活性的新型多肽BNC的制备方法。根据所设计的BNC氨基酸序列，利用!^mc固相多肽合成技术进行合成。先将所要 合成肽链的C末端半胱氨酸的羧基以酯键形式与2-氯三苯甲基氯树脂相连，然后以此结合 在固相载体上的半胱氨酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分进 行缩合并脱保护。重复(缩合一洗涤一去保护一洗涤一下一轮缩合)操作，达到所要合成 的肽链长度，最后利用切割液将肽链从树脂上裂解下来，即得粗品。经HPLC反相柱进行纯化后通过质谱分析确证。以上所述的!^mc固相多肽合成方法是本领域的常规并公知的技术。电刺激大鼠颈总动脉血栓形成、ADP诱发的小鼠急性肺血栓形成以及小鼠的凝血 时间测定等动物实验证明，本发明的多肽BNC具有较强的抗血栓活性。本发明的目的之三是将新型多肽BNC应用于抗血栓药物的制备中。本发明的有益效果在于根据基质金属蛋白酶抑制剂(MMPI)的设计思路，基于底物的MMPI的设计理论，利 用固相多肽合成技术，设计完成的新型抗血栓多肽BNC具有结构简单、人工合成方便和良 好的抗血栓活性等有益特点，有望成为一种极具应用潜力且安全有效的抗血栓多肽药物。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。应当指出，这些实施例仅用来 对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。本发明中所出现的缩略语的说明HBTUDIEAFomcTFATISEDTDMFDCMMeOH实施例1新型抗血栓多肽BNC的制备及分离纯化按下述序列制备BNC。BNC的氨基酸序列为焦谷氨酸-天冬酰胺-半胱氨酸。本实施例采用固相多肽合成技术进行手工合成，合成的多肽经高浓度的TFA切割 后，得到粗品。经HPLC反相柱进行纯化后，通过质谱分析确证。具体实验步骤如下DBNC的制备(以制备1. 323mmol量的BNC为例说明固相合成多肽的方法)以下制备抗血栓多肽BNC的树脂、Fmoc保护氨基酸及缩合试剂、切割试剂均购买 于上海吉尔生化有限公司。制备从C端到N端逐个进行。称取1.01g(1.323mmOl)2-氯三苯甲基氯树脂放 入小烧杯中，加入DMF(没过树脂)溶胀30min，后倒出一半体积的DMF加入等体积的DCM 再溶胀30min，之后倒入砂芯漏斗抽滤干。连接好装置，并通入氮气，调节使气流平稳。 称取Fmoc-Cys(Trt)-OH 1. 93g (3. 31mmol)用DMF溶解，之后加入装置中，并加入DIEA 1. 2ml (7. 69mmol)，接着补加DMF使反应液的总体积为柱床体积的2 3倍，室温反应lh。 利用茚三酮显色法检测反应完全后，加入部分20 %的哌啶/DMF先反应5min，之后加入剩 余部分再反应15min (共30ml)，脱去Fmoc保护基。用茚三酮显色法检测，结果表明脱保护 反应已进行完全。滤去反应液，将树脂用DMF洗涤4次，至滤液加水无浑浊，滤干。称取第
苯并三唑-N，N, N’，N’四甲基脲六氟磷酸酯
二异丙基乙胺
9-芴甲氧羰基
三氟乙酸
三异丙基硅烷
1,2-乙二硫醇
二甲基甲酰胺
二氯甲烷
无水甲醇2 个氨基酸 Fmoc-Asn (Trt)-OHl. 97g(3. 31mmol)，另称取缩合剂 HBTU 1. 57g(3. 80mmol)，混 合后用DMF溶解，之后将完全溶解的混合液加入到含多肽树脂的砂心漏斗中，调节氮气的 流速使之处于稳速状态，之后再加入DIEA 1. 2ml (7. 69mmol)，后加入DMF使反应液的总量 为柱床体积2 3倍，室温反应lh。用茚三酮显色法检测，结果表明缩合反应已进行完全。 将反应后的树脂滤干，用DMF洗4次，抽滤干，加入20%的哌啶/DMF重复脱保护操作。滤 去反应液，将树脂用DMF洗涤6次，至滤液加水无浑浊，滤干。接着称取第三个氨基酸Pyr 0. 55g(4. ^mmol)，缩合剂HBTU1. 57g，混合后于DMF中溶解完全，之后加入反应装置中，调 节氮气使流速平稳，之后再加入DIEA 1. 2ml (7. 69mmol)，后加入DMF使反应液的总量为柱 床体积2 3倍，室温反应lh。用茚三酮显色法检测，结果表明缩合反应已进行完全。将反 应后的树脂滤干，用DMF洗4次，无水MeOH洗1次，DCM洗2次，无水MeOH洗2次，每次洗 涤不少于lmin，之后抽滤干。将树脂转移后，加入切割液TFA TIS EDT H2O (9. 4 0. 1 0. 25 0. 25) 搅拌30min。抽滤，在滤液中加入10倍体积的冰乙醚，充分震荡后静置30min。抽干，真空 干燥，即得BNC粗肽。2) BNC 的纯化将200mg上述粗肽溶解于50ml纯水中，用制备型反相HPLC纯化。色谱柱为 Delta-I^akClSZSX200mm ；流动相为A液5%甲醇+水相中0. 05%三氟乙酸，B液95%甲 醇+水相中0. 05%三氟乙酸，以70%的B液为流动相等度洗脱，流速为5ml/min，检测波长 为^Onm和214nm，主峰保留时间为17min左右，比较合适，分离效果较好，适合样品的大量 制备。收集主峰峰尖部分后，用分析型反相HPLC对收集成分进行检测，色谱柱为苏州环球 柱，流动相同上，洗脱程序为49% B液20min，流速为lml/min，检测波长214nm，收集 的成分达到纯度要求。收集液经旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得到BNC纯肽。纯肽的质谱 表明，其分子量为346，与计算值相符。实施例2BNC对电刺激大鼠颈总动脉内膜后血栓形成的影响1)样品溶液的配制阳性对照组临用前将氯吡格雷以生理盐水稀释成所需浓度的药液Omg/ml) ；BNC 组临用前以0. 2% L-精氨酸溶解，并以生理盐水稀释成所需浓度的药液Omg/ml)。各组均 尾静脉给药，容积为10ml/kg。2)动物模型的制备大鼠腹腔注射10mg/L戊巴比妥钠溶液(30mg/kg)，麻醉后仰卧位固定。颈部正 中线切口，游离右侧颈总动脉，近心端放置BT87-3型实验性体内血栓形成测定仪的刺激电 极，远心端放置温度探头。当刺激电极接通电流后，以2mA直流电刺激动脉7min，使刺激部 位的血管内皮受损，激活血小板和凝血系统，管腔混合血栓逐渐形成，血流逐渐阻断，当血 流完全阻断时，远端温度突降，仪器报警，显示堵塞时间(tt^)，即血栓形成时间。3)实验步骤 取Wistar大鼠32只，体重200 250g，雌雄各半，按体重随机分为4组，每组8只， 即空白对照组，模型对照组，阳性对照组(剂量为20mg/kg)，BNC组(剂量为20mg/kg)。采 用尾静脉注射给药，给药体积为10ml/kg，给药后15min开始刺激。空白对照组给予0. 2% L-精氨酸，模型对照组给予生理盐水，阳性对照组给予氯吡格雷。
4)统计学处理采用Excel软件处理数据。所有数据均表示为均数士标准差6土S)表示，两组 间比较用t检验，结果见表1。表1各组对电刺激大鼠颈总动脉内膜后血栓形成的影响6士S)
权利要求
1.一种具有抗血栓活性的多肽BNC，其氨基酸序列为Pyr-Asn-CyS，分子量为346。
2.一种制备权利要求1多肽的方法，其特征在于，所述的制备方法为i^omc固相合成法。 包括(1)称取2-氯三苯甲基氯树脂放入小烧杯中，加入DMF溶胀30min，后倒出一半体积的 DMF加入等体积的DCM再溶胀30min，之后倒入砂芯漏斗抽滤干；(2)经保护的氨基酸在树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并脱保护， 反应过程中利用氮气搅拌；(3)合成的多肽经切割液TFA TIS EDT H2O(9. 4 0. 1 0. 25 0.25)剪切 30min后，得到多肽粗品。
3.权利要求1的多肽在制备抗血栓药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，公开了一种人工合成的具有抗血栓活性的多肽BNC，并公开了其制备方法以及作为抗血栓剂的应用。BNC利用Fomc固相化学法合成，含有3个氨基酸残基，序列为Pyr-Asn-Cys，分子量为346，结构式如下。动物试验表明该多肽对电刺激大鼠颈总动脉内膜后血栓的形成及对ADP诱发的小鼠急性肺血栓的形成均有抑制作用，并且可以延长小鼠的凝血时间。BNC结构式
文档编号C07K1/06GK102060908SQ201010284849
公开日2011年5月18日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者孔毅, 杨天雨, 赖伊丽, 邵妤 申请人:中国药科大学