专利名称：一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中的鱼类基因工程，特别涉及大黄鱼h印cidin抗菌肽 及其制备方法。
背景技术：
抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)广泛存在于动植物中，是动植物机体免 疫反应中的重要角色。H印cidin是一个在C端保守位点上富含半胱氨酸残基的抗菌肽家 族。2000 年，Krause A 等(1. Krause A, Neitz S, Magert HJ, Schulz A, Forssmann WG, Knappe PS, Adermann K. LEAP-1, a novel highly disulfide-bonded human peptide, exhibits antimicrobial activity [J] FEBS Lett.，2000，480 :147_150)从人类血菜中首 次发现了 LEAP-1 (后称为hepcidin)。H印cidin抗菌肽的C末端保留了半胱氨酸形成的富 集区，圆二色(circular dichroism, CD)光谱学特性研究证实，在磷酸缓冲液中h印cidin 抗菌肽具有两个稳定的0折叠结构，这一结构与抗菌多肽的胱氨酸(cystin-eknot)结构 非常相似。鱼类抗菌肽是鱼类先天免疫的重要组成部分，使用抗菌肽作为药物用于海水养 殖鱼类的疾病防治，具有广阔的应用前景。大黄鱼 h印cidin 抗菌肽基因(Genebank accession no :EF156401)由 258 个碱基 组成，编码85个氨基酸。同其他已经发现的h印cidin抗菌肽结构一样，大黄鱼h印cidin抗 菌肽包括内质网靶向的位于N端的信号肽(前24个氨基酸)，前导肽(35个氨基酸)和位 于C端的成熟肽(26个氨基酸)。其中前导肽和成熟肽共同构成了前体pro-h印cidin (2. Ke-Jian Wang，Jing-Jing Cai，Ling Cai，Hai-Dong Qu，Ming Yang，Min Zhang，Cloning and expression of a hepcidin gene from a marine fish(Pseudosciaena crocea) and the antimicrobial activity of its synthetic peptide， Peptides， Volume 30， Issue 4，April 2009，638-646)成熟|太部分含有 8 个半胱氨酸(3. HunterHN，Fulton DB， Ganz T & Vogel HJ(2002)The solution structure of human hepcidin， a peptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis. J Biol Chem277，37597-37603)，形成 4 个二硫键结构。但 由于此4个二硫键结构较为复杂，因此使得通过化学方法合成大黄鱼hepcidin抗菌肽 的技术难度较大，费用昂贵，且难以工业化生产。目前，通过基因工程的方法获得的重组 h印cidin抗菌肽往往没有广谱抗菌效果，或者抗菌谱研究不充分(4. Zhmg H，Yimn QP， Zhu YP，Ma RY. Expression and preparation of recombinant hepcidin inEscherichia coli [J]Protein. Expr. Purif.，2005，41 409-416 ；5. Srinivasulu B.，Syvitski R.，Seo J. K.，Mattatall N. R.，Knickle L. C.，Douglas S. E.，Expression, purification and structural characterization of recombinant hepcidin, an antimicrobial peptide identified in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, Protein Expr. Purif.， 2008，61 36-44)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大黄鱼h印cidin抗菌肽及其制备方法。所述一种大黄鱼h印cidin抗菌肽(简写为C-pro-PC-h印c)的氨基酸序列如下Met Val Pro Ala Asn Glu Glu Gin Glu Leu Glu Gin Gin lie Tyr Phe151015Ala Asp Pro Glu Met Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met202530Arg Glu Asn Arg Gin Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg354045Cys Cys Pro Arg Met Arg Gly Cys Gly lie Cys Cys Arg Phe Leu Glu505560His His His His His His65其中N端含有表达起始密码子的Met蛋白，C端连接有6个His标签和Xho I酶 切位点翻译后的2个氨基酸Leu和Glu。所述一种大黄鱼h印cidin抗菌肽的基因序列为gcRccatRRt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat tttgctgatc 60cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaat cgtcagggca 120gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga tgtggtatct 180gctgcaggttc c t c g a gegg 200其中Nco I酶切位点为CCATGG，Xho I酶切位点为CTCGAG。所述一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法包括以下步骤1)克隆大黄鱼h印cidin抗菌肽基因，并将大黄鱼h印cidin抗菌肽基因插入表达 载体，构建携带大黄鱼h印cidin抗菌肽基因的重组表达载体；将所述大黄鱼h印cidin抗菌 肽基因的重组表达载体转化到大肠杆菌中，选取转化后大肠杆菌中的阳性克隆于培养基中 进行培养，提取质粒；2)将步骤1)中的所得质粒转化到大肠杆菌中，选取转化后大肠杆菌中的阳性克 隆于培养基中进行发酵培养，离心收集发酵后的大肠杆菌细胞，重悬所述大肠杆菌细胞于 悬菌磷酸缓冲液中，再次离心，弃上清，将沉淀溶于变性液中，得混合溶液；3)测定混合溶液中蛋白浓度，调节蛋白浓度，加入氧化液，再加入复性液，离心，过 滤，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白粗提物；4)纯化大黄鱼h印cidin抗菌肽蛋白粗提物，即得大黄鱼h印cidin抗菌肽。在步骤1)中，所述表达载体可为原核表达载体pET-28a+，所述大肠杆菌可为 E. coli T0P10F'，所述培养基可为含有卡那霉素和D-葡萄糖的LB培养基；所述培养条件 可为37°C，180rpm培养8h，所述提取质粒可采用常规小量质粒提取试剂盒进行提取。在步骤2)中，所述大肠杆菌可为E. coli BL21(DE3)pLysS，所述培养基可为含有 卡那霉素和D-葡萄糖的LB液体培养基；所述发酵培养的条件可为温度为37°C，摇床培 养至菌液0D, = 0. 3 0. 5时，再加入异丙基硫代-0 -D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为
5lOOii g/mL，32°C，180rpm诱导5h ；所述离心可为5000rpm，4°C离心lOmin，所述悬菌磷酸缓 冲液的配方为50mmol/L Na2HP04, 50mmol/L NaH2P04, 300mmol/L NaCl，去离子水定容至 1L， 调节pH为8.0 ；所述再次离心为8000rpm，4°C离心lOmin，所述变性液的配方为8mol/L尿 素，50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl, lOOmmol/L 0 -巯基乙醇，去离子水定容至 1L，调节pH 为 9. 0。在步骤3)中，所述调节蛋白浓度至1. 2mg/mL为宜，所述加入氧化液的时间最好 在所述沉淀溶于变性液12h之后；所述氧化液的配方为2mol/L尿素，50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl,2mmol/L cysteine, 0. lmmol/L cystine，5%甘油，去离子水定容至 1L，调 节pH为9. 0 ；所述复性液为配方为50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl，5%甘油，去离子水定 容至1L，调节pH为9. 0 ；所述复性的时间为48h，所述离心为:12000rpm，4°C离心15min ；所 述过滤的滤膜孔径为0.45 ym;所述混合液、氧化液与复性液的体积比可为1 2 3。在步骤4)中，所述纯化可采用HisTrap层析柱纯化，所述HisTrap层析柱纯化可 采用以下方法亲和层析介质装柱后，先用溶液A鏊合Ni2+金属离子，用5 10个柱体积超纯水 (可由美国Millipore公司的超纯水系统制备)洗柱；再过5 10个柱体积的溶液B的溶 液洗去多余的附2+，并用5 10个柱体积超纯水洗柱；接着过5 10个柱体积溶液C平衡 层析柱；将过滤后的大黄鱼h印cidin抗菌肽蛋白粗提物全部上柱，用5 10个柱体积的溶 液C过柱，洗去未结合的蛋白；再用30个柱体积将溶液C过渡到溶液D以去除尿素，3个柱 体积的溶液D过柱平衡，最后用5个柱体积的溶液E过柱洗脱目标蛋白，收集洗脱峰，即得 大黄鱼hepcidin抗菌肽；所述溶液A为摩尔浓度200mmol/L的硫酸镍；所述溶液B的组成为NaH2P04和NaCl，所述NaH2P04的摩尔浓度为25mmol/L，所述 NaCl的摩尔浓度为500mmol/L，用磷酸调pH为4 ；所述溶液C的组成为Tris缓冲液、NaCl、咪唑和尿素，所述Tris缓冲液的摩尔浓 度为50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为lOOmmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为20mmol/L，所述 尿素的摩尔浓度为2mol/L，pH为9 ；所述溶液D的组成为Tris缓冲液、NaCl和咪唑，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为 50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为20mmol/L，pH为9 ；所述溶液E的组成为Tris缓冲液、NaCl和咪唑，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为 50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为400mmol/L，pH为9 ；所述大黄鱼h印cidin抗菌肽基因序列与已经发表的其它鱼类同类h印cidin抗菌 肽基因序列同源性不高，与杂交斑纹鲈鱼Morone chrysops h印cidin抗菌肽基因序列的相 似度为85%。与已经发表的其它鱼类h印cidin抗菌肽相比，所述大黄鱼h印cidin抗菌肽 的主要表达组织不同。由于基因序列不同，所述大黄鱼hepcidin抗菌肽的表达载体所也区 别于其它的hepcidin抗菌肽原核表达载体。目前尚无报道大黄鱼h印cidin抗菌肽的原核表达，本发明采用融合表达方式，增 大了表达产物分子量，使表达产物大黄鱼hepcidin抗菌肽更加稳定。优化了蛋白变性复性 条件，包括复性时采用的蛋白浓度，复性时间，配置的溶液等，可以得到优于以往报道的更 为广谱的抗菌活性的大黄鱼hepcidin抗菌肽。本发明所述的大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白纯化条件，不仅提高了蛋白的得率，而且解决了大黄鱼h印cidin抗菌肽表达复性时会有蛋 白析出的问题。所用的溶液配置简单，价格低廉。大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白的抗菌活性测定的结果(参见实施例中的表2)表 明经过变性复性纯化后的大黄鱼h印cidin抗菌肽具有较强的广谱抗菌活性，比以往报道 的h印cidin蛋白具有更为广谱和更强的抗菌功能。不仅对革兰氏阳性菌的抑制作用较革 兰氏阴性菌强，对真菌和酵母也显示出很强的抑制效果。对重要致病菌金黄色葡萄球菌的 最小抑菌浓度为< 1.5i!m0l/L，具有潜在的医用价值。对水产致病菌嗜水气单胞菌的最小 抑菌浓度为1. 5 3i!m0l/L ；同时对水产致病菌哈维氏弧菌也有一定的抑制作用。与现有抗菌肽相比，如原核表达的Japanese flounder h印cidin抗菌肽的最小杀 菌浓度为25iimol/L且几乎不抗各种真菌及其它细菌(5. Srinivasulu B.，Syvitski R.， Seo J. K. , Mattatall N. R. , Knickle LC. , Douglas S. E. , Expression, purification and structural characterization of recombinant hepcidin, an antimicrobial peptide identified in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, Protein Expr. Purif., 2008,61 :36-44.)，本发明所制备的大黄鱼h印cidin抗菌肽具有很高的抗细菌，抗真菌，抗 酵母的广谱抗菌活性，不仅可用于科研，也可以作为饲料添加剂用于海水养殖鱼类的疾病 防治，具有广阔的应用前景。
图1为PET_28a+载体酶切处理后的电泳图。在图1中，M为DNA Marker, 1为未 进行酶切的PET-28a+载体，2为使用Ndel和EcoRI进行双酶切后的PET_28a+载体，bp代 表碱基对。图2为大黄鱼h印cidin抗菌肽表达载体图谱。在图2中，T7为启动子，ATG为起 始密码子，Pro-PC-hepc gene为大黄鱼h印cidin抗菌肽基因，His Tag为6个His标签， TGA为终止密码子，Nco I和Xho I分别为酶切位点，C-pro-PC-h印c为大黄鱼h印cidin抗 菌肽的简写；A为目的片段插入位点，B为载体上游，C为载体下游。图3为PCR扩增后的大黄鱼h印cidin抗菌肽基因电泳图。在图3中，M为DNA Marker, 1为PCR扩增后获得的产物，即大黄鱼h印cidin抗菌肽基因。图4为检测原核表达产物的电泳图。在图4中，M为蛋白Marker ；1为表达产物的 超声上清，含有少量目的蛋白和菌体杂蛋白，2为表达产物超声沉淀，含有大量表达的包涵 体和杂蛋白，3为洗涤包涵体后的上清，洗涤掉了部分杂蛋白，4为洗涤后离心的沉淀，大部 分为目的蛋白。图5为C-Pro-PC-h印c蛋白复性产物的亲和层析图。在图5中，横坐标为体积 Volume (mL)，纵坐标为紫外吸收值AbsorbanceOnAU)，10 180mL左右的平缓峰为没有挂柱 的流穿的蛋白峰，在360mL处的紫外吸收的尖峰即为收集的纯化目的蛋白。图6为检测蛋白纯化产物的电泳图。在图6中，M代表蛋白Marker，1、2为不同浓 度的纯化后的蛋白，3为上柱纯化前的蛋白，4为流穿的杂蛋白。
具体实施例方式以下实施例可以使本专业技术领域的技术人员更加全面的了解本发明，本发明并不限于下述的实施例。本发明所涉及的原核表达载体pET-28a+购自Novagen公司，菌株E. coli BL21 (DE3)pLysS和E. coli TOPI OF均购自晶美生物有限公司。本发明所涉及的菌种大肠杆菌(Escherichia coli)、表皮葡萄球菌 (Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、谷氨酸棒杆 菌(Corynebacterium glutamicum)、溶壁微球菌(Micrococcus luteus)、枯草芽抱杆菌 (Bacillus subtilis)、赌状芽胞杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi C)、畐ij 溶血弧菌(Vibrio parahaemloyticus)、角军藻月元酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、白假丝酵母(Candida albicans)、禾谷镰 抱(Fusarium graminearum)、腐皮键抱(Fusarium solani)、黑曲霉(Aspergillus niger) 购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)购自 Invitrogen 公司。本发明采用的主要试剂和耗材Chelating Sepharose Fast Flow和DEAE Sepharose Fast Flow层析填料购自安玛西亚公司；Qiaquick Gel Extraction Kit购自 QIAGEN 公司；Ex Taq DNA 聚合酶，限制性内切酶 Ncol、Xhol、Ndel、EcoRI，DNA Ligation Kit，虾碱性磷酸酶SAP，核酸共沉剂购自TaKaRa公司；PCR及酶反应纯化试剂盒和质粒小量 纯化试剂盒购自东盛公司；丙烯酰胺、N, N'-亚甲基双丙烯酰胺为BBI公司产品；Hybond ECL(硝酸纤维素膜)为安玛西亚产品；Kan、IPTG、考马斯亮兰R250均购自购自上海生工； 低分子量标准蛋白质Marker购自BBI公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生 物技术研究所；其它试剂均为国产分析纯试剂。实施例lpET_28a+载体的处理1) pET_28a+ 质粒的提取；将含有pET-28a+原核表达载体的E. coli BL21 (DE3)pLysS的保存于20%甘油的 大肠杆菌划线于含50 u g/ml卡那霉素的LB平板上，37°C培养12h。挑取单克隆，接种至5ml 添加了 50 ii g/ml卡那霉素和0. 5%0-葡萄糖的1^液体培养基中，371，180印111培养811，按 照东盛质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒。2) pET-28a+载体的酶切和去磷酸化处理；按照以下体系对pET-28a+质粒进行Ncol-Xhol双酶切Ncol-Xhol 双酶切10XK Buffer (缓冲液)15u 1
0. 1 % BSA15u 1
Ncol内切酶7u 1
Xhol内切酶7u 1
pET-28a+ 质粒100 u 1
超纯水6u 1
总体积150 u 137°C孵育6h，用0. 8%琼脂糖凝胶电泳分离酶切后产物，Qiagen凝胶回收试剂盒 回收特异性片段，溶于88 yl洗脱液中。按以下体系对酶切后载体进行磷酸化处理pET_28a+双酶切回收产物88 ii 1
10 X PCRBuffer (缓冲液)碱性磷酸酶SAP总体积
10 u 1 2u 1 100 u 137°C孵育30min，65°C灭活15min，将100 yl酶切后载体稀释到200 yl，酚氯仿异 戊醇法抽提蛋白，按照核酸共沉剂说明书沉淀处理好的载体，用水重悬后存于-20°C待用。 处理好的载体具有Ncol-Xhol的粘性末端(参见图1)。实施例2目的基因的获得1)引物的设计根据pET_28a+载体上的多克隆位点及大黄鱼h印cidin cDNA序列设计含有大黄 鱼h印cidin抗菌肽前导肽的表达载体(参见图2)，PCR上下游引物如表1，黑体表示限制 性内切酶位点，C-Pro-PC-hepc forward其中CCATGG为Nco I酶切位点，前端的GCG为酶 切位点的保护碱基，C-Pro-PC-hepc reverse其中CTCGAG为Xho I的酶切位点，前端的CCG 为设计的保护碱基
权利要求
一种大黄鱼hepcidin抗菌肽，其特征在于其氨基酸序列如下Met Val Pro Ala Asn Glu Glu Gln Glu Leu Glu Gln Gln Ile Tyr Phe1 5 10 15Ala Asp Pro Glu Met Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met20 25 30Arg Glu Asn Arg Gln Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg35 40 45Cys Cys Pro Arg Met Arg Gly Cys Gly Ile Cys Cys Arg Phe Leu Glu50 55 60His His His His His His65其中N端含有表达起始密码子的Met蛋白，C端连接有6个His标签和Xho I酶切位点翻译后的2个氨基酸Leu和Glu。
2.一种大黄鱼hepcidin抗菌肽基因，其特征在于其序列如下RCRCcatRRt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat tttgctgatc 60 cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaat cgtcagggca 120 gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga tgtggtatct 180 gctgcaggtt cctcgag egg200其中Nco I酶切位点为CCATGG，Xho I酶切位点为CTCGAG。
3.一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)克隆大黄鱼h印cidin抗菌肽基因，并将大黄鱼h印cidin抗菌肽基因插入表达载体， 构建携带大黄鱼h印cidin抗菌肽基因的重组表达载体；将所述大黄鱼h印cidin抗菌肽基 因的重组表达载体转化到大肠杆菌中，选取转化后大肠杆菌中的阳性克隆于培养基中进行 培养，提取质粒；2)将步骤1)中的所得质粒转化到大肠杆菌中，选取转化后大肠杆菌中的阳性克隆于 培养基中进行发酵培养，离心收集发酵后的大肠杆菌细胞，重悬所述大肠杆菌细胞于悬菌 磷酸缓冲液中，再次离心，弃上清，将沉淀溶于变性液中，得混合溶液；3)测定混合溶液中蛋白浓度，调节蛋白浓度，加入氧化液，再加入复性液，离心，过滤， 即得大黄鱼h印cidin抗菌肽蛋白粗提物；4)纯化大黄鱼h印cidin抗菌肽蛋白粗提物，即得大黄鱼h印cidin抗菌肽。
4.如权利要求3所述的一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述表达载体为原核表达载体pET-28a+。
5.如权利要求3所述的一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述大肠杆菌为E.coliT0P10F'，所述培养基为含有卡那霉素和D-葡萄糖的LB培 养基；所述培养条件为37°C，180rpm培养8h，所述提取质粒采用常规小量质粒提取试剂盒 进行提取。
6.如权利要求3所述的一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)pLysS ；所述培养基最好为含有卡那霉素和D-葡 萄糖的LB液体培养基；所述发酵培养的条件为温度为37°C，摇床培养至菌液0D,=`0. 3 0. 5时，再加入异丙基硫代-3 -D-半乳糖苷至终浓度为100 u g/mL, 32°C，180rpm诱 导5h ；所述离心为5000rpm，4°C离心lOmin ；所述悬菌磷酸缓冲液的配方最好为50mmol/L Na2HP04, 50mmol/LNaH2P04, 300mmol/L NaCl，去离子水定容至 1L，调节 pH 为 8. 0 ；所述再次 离心为8000rpm，4°C离心lOmin，所述变性液的配方最好为8mol/L尿素，50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl, 100mmol/L 0 -巯基乙醇，去离子水定容至1L，调节pH为9。
7.如权利要求3所述的一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于在步骤 3)中，所述调节蛋白浓度至1. 2mg/mL，所述加入氧化液的时间在所述沉淀溶于变性液12h 之后；所述氧化液的配方最好为2mol/L尿素，50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl,2mmol/L cysteine, 0. lmmol/L cystine，5%甘油，去离子水定容至1L，调节pH为9. 0 ；所述复性液 为配方最好为50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl，5%甘油，去离子水定容至1L，调节pH为 `9. 0 ；所述复性的时间为48h，所述离心为12000rpm，4°C离心15min ；所述过滤的滤膜孔径 为 0. 45 y m。
8.如权利要求3所述的一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述混合液、氧化液与复性液的体积比为1 2 3。
9.如权利要求3所述的一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述纯化采用HisTrap层析柱纯化，所述HisTrap层析柱纯化采用以下方法亲和层析介质装柱后，先用溶液A鏊合附2+金属离子，用5 10个柱体积超纯水洗柱； 再过5 10个柱体积的溶液B的溶液洗去多余的附2+，并用5 10个柱体积超纯水洗柱； 接着过5 10个柱体积溶液C平衡层析柱；将过滤后的大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白粗提 物全部上柱，用5 10个柱体积的溶液C过柱，洗去未结合的蛋白；再用30个柱体积将溶 液C过渡到溶液D以去除尿素，3个柱体积的溶液D过柱平衡，最后用5个柱体积的溶液E 过柱洗脱目标蛋白，收集洗脱峰，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽。
10.如权利要求9所述的一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于在步骤 4)中，所述溶液A为摩尔浓度200mmol/L的硫酸镍；所述溶液B的组成为NaH2P04和NaCl，所述NaH2P04的摩尔浓度为25mmol/L，所述NaCl 的摩尔浓度为500mmol/L，用磷酸调pH为4 ；所述溶液C的组成为Tris缓冲液、NaCl、咪唑和尿素，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为 50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为lOOmmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为20mmol/L，所述尿素 的摩尔浓度为2mol/L，pH为9 ；所述溶液D的组成为Tris缓冲液、NaCl和咪唑，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为 50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为20mmol/L，pH为9 ；所述溶液E的组成为Tris缓冲液、NaCl和咪唑，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为 50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为400mmol/L，pH为9。
全文摘要
一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法。涉及生物技术领域中的鱼类基因工程，提供一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法。所述大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法包括克隆大黄鱼hepcidin抗菌肽基因，构建重组载体，转化宿主细胞，挑选阳性克隆进行原核表达，分离纯化表达产物，获得大黄鱼hepcidin抗菌肽。分离纯化时提高了蛋自的得率，解决了大黄鱼hepcidin抗菌肽表达复性时会有蛋自析出的间题。所用的溶液，配置简单，价格低廉。制备的大黄鱼hepcidin抗菌肽具有很高的广谱抗菌活性，不仅可用于科研，而且可以作为饲料添加剂用于海水养殖鱼类的疾病防治，具有广阔的应用前景。
文档编号C07K14/46GK101974082SQ201010505548
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者王克坚, 蔡晶晶, 蔡灵 申请人:厦门大学