专利名称：一种抑菌性铁蛋白及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种抑菌性铁蛋白及其制备和应用。
背景技术：
铁蛋白(ferritin)广泛存在于各种生物体中，具有很强的铁结合能力，其主要功能是将细胞中过剩的铁以一种可以重新利用的形式储存起来，从而避免游离铁引起的各种对细胞有损伤作用的化学反应产生。当机体缺乏铁时，储存于铁蛋白中的铁离子即可释放出来，供机体使用。因此，铁蛋白在维持生物体铁平衡中具有重要作用。我们在研究中发现半滑舌鳎铁蛋白不仅具有螯合铁的功能，而且具有广谱的抑菌效应，能够抑制多种鱼类重要致病性细菌的生长，因此在病害防治中具有良好的应用潜能。
发明内容
本发明目的在于提供一种铁蛋白及其制备和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种铁蛋白铁蛋白为序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示。铁蛋白的制备1)质粒 pETCsFer2 的构建以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒 pBSCsFer2 ；将上述质粒PBSCsFer2和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV酶切，回收 0. 5kb和5. 4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETCsFer2 ；2)铁蛋白的表达和制备将上述步骤1)的质粒pETCs!^r2转化转化Rosetta (DE!3)，在含有卡那霉素的LB 培养基上培养，筛选转化子即为Rosetta(DEIBVpETCsi^erf ；将转化子Rosetta (DE3) /PETCsFer2用终浓度为ImM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达后，采用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示的铁蛋白。所述步骤1)中 Fl 为 5' -GATATCATGGAGTCTCAAGTGCG-3 ‘ ；Rl 为 5’ -GATATCGCTCTTGCCACCGT-3’。铁蛋白的应用所述序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列的铁蛋白可作为抑菌剂。 所述铁蛋白可作为迟缓爱德华氏菌、哈氏弧菌、海豚链球菌、荧光假单胞菌或副溶血弧菌的抑菌剂。本发明具有如下优点1.广谱、高效抑菌作用。本发明的铁蛋白可以有效抑制多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，因而可以用于防控细菌性疾病。
图1为本发明实施例提供的纯化得到的铁蛋白电泳图谱(其中，纯化得到的铁蛋白为泳道2 ；泳道1 分子量marker。)。图2为本发明实施例提供的铁蛋白的抑菌效应检测图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相应试剂盒。2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；酵母转化按 hvitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20)；聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照 Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannua1. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001。3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。实施例1本发明的铁蛋白为序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列。序列表SEQ ID No. 1 为:MESQVRQNYHRDCEAAVNRMINMELFASYNYTSMAFHFSRDDVALPGFAHFFKENSHEEREHAEKLLSFQNKRGGRIFLQDIKKPERDEWVNGLDAMEHALQLEKTVNQALLDLHKLASEHGDPHMCDFLETHYLNEQVEAIKKLGDYITNLKRLDPANNKMAEYLFDKHTLHGGKS(a)序列特征 长度177 类型氨基酸序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)假设否(d)反义否(e)最初来源半滑舌鳎空间结构该蛋白预期含有一个真核铁蛋白结构域，由氨基酸14-155，构成，另外，氨基酸89-118预期形成一个α-螺旋结构。实施例2铁蛋白的制备方法1)质粒 pETCsFer2 的构建
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为94°C 60s 预变性模板 DNA，然后 94°C 40s, 50°C 60s, 72°C 60s，5 个循环后改为 94°C 40s, 58°C 60s， 72°C 60s，30个循环后再在72°C延伸反应7-lOmin。PCR产物纯化后与载体pBS_T (购于 “天根生化科技(北京)有限公司”)于室温连接4-6小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素(100ug/ml)、Xgal (40ug/ml)、异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(Mug/ml)的LB 培养基上培养18- 小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSCsFer2。将pBSCsFer2和质粒 pET259(质粒 pET259 构建过程参见 Zheng, W. J.，Hu, Y. H.，Sun, L.，2010. Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot(Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Immunol. 28,829-836)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收0. 5kb和5. 4kb片段， 将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素(30ug/ml)的LB 培养基上培养18-M小时，筛选转化子提取质粒，即为PETCsFer2。所述LB组成成分按重量百分比计1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 % 氯化钠,97. 5 % 蒸馏水。所述 Fl 为 5’ -GATATCATGGAGTCTCAAGTGCG-3，；Rl 为 5’ -GATATCGCTCTTGCCACCGT-3’。2)铁蛋白的表达和制备将步骤1)的质粒PETCsFer2转化R0Setta(DE3)(购于“百泰克生物技术(北京)有限公司”)，在含有卡那霉素(30ug/ml)的LB培养基上培养，筛选转化子即为 Rosetta(DE3)/pETCsFer2。将 Rosetta(DE3)/pETCsFer2 在含有卡那霉素的 LB 培养基中于 37°C培养至0D_为0. 6，加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到ImM，18°C继续摇动培养 4-5 小时，而后用 GE Healthcare (美国)公司的 nickel-nitrilotriacetic acid 亲和层析柱纯化重组蛋白(层析条件用4-5ml Wash buffer洗柱两次，随后用0. 5-lml Elution buffer洗柱，收集所有洗脱液)。将洗脱液中的重组蛋白进行N-端氨基酸测序， 证实其为序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示的铁蛋白。将重组蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，发现其分子量与表SEQ ID No. 1中序列的分子量一致(参见图1)。上述Wash buffer 成分为50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole, pH 8. O ； 上述 Elution buffer 成分为50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,250mM imidazole, pH 8. 0.实施例3铁蛋白的抑菌效应检测在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌(保存于CGMCC，编号为CGMCC 2330)、哈氏弧菌(保存于CGMCC，编号为CGMCC 1985)、海豚链球菌(保存于CGMCC，编号为CGMCC 1984)、 荧光假单胞菌(保存于CGMCC，编号为CGMCC 23 )、副溶血弧菌(保存于CGMCC，编号为 CGMCC 1. 2164)至OD6c 为0. 5，将其稀释1000倍。将上述纯化的铁蛋白在PBS中稀释至^ig/ ml。取IOOul稀释菌液，加入395ul LB培养基，再加入5ul稀释后的铁蛋白或5ul PBS (对照组)。将混合液在LB培养基中于培养，在不同时间点测量细菌浓度。结果表明，与对照组相比，加入铁蛋白组的细菌生长完全被抑制(参见图幻。因此本发明的铁蛋白具有强性抑菌效应，可作为广谱抑菌剂用于细菌性病害的防治。
权利要求
1.一种铁蛋白，其特征在于铁蛋白为序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示。
2.—种权利要求1所述的铁蛋白的制备，其特征在于1)质粒pETCsFer2的构建以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体 PBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒 pBSCsFer2 ；将上述质粒pBSCsFer2和质粒pET259分别用限制性内切酶EcoRV酶切，回收0. 5kb和 5. 4kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒PETCsi^erf ；2)铁蛋白的表达和制备将上述步骤1)的质粒pETCs!^r2转化转化Rosetta(DEiB)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养,筛选转化子即为Rosetta(DE3)/pETCsFer2 ；将转化子Rosetta (DE3) /PETCsFer2用终浓度为ImM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达后，采用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示的铁蛋白。
3.按权利要求2所述的铁蛋白的制备，其特征在于所述步骤1)中Fl为 5，-GATATCATGGAGTCTCAAGTGCG-3，；Rl 为 5’ -GATATCGCTCTTGCCACCGT-3，。
4.一种权利要求1所述的铁蛋白的应用，其特征在于所述序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列的铁蛋白可作为抑菌剂。
5.按权利要求1所述的铁蛋白的应用，其特征在于所述铁蛋白可作为迟缓爱德华氏菌、哈氏弧菌、海豚链球菌、荧光假单胞菌或副溶血弧菌的抑菌剂。
全文摘要
本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种抑菌性铁蛋白及其制备和应用。铁蛋白为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。制备方法以半滑舌鳎cDNA为模板PCR扩增铁蛋白基因，构建质粒pETCsFer2，将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，诱导表达后回收重组蛋白。所述铁蛋白能够抑制多种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的生长。
文档编号C07K14/46GK102241759SQ20111009318
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者孙黎, 张敏, 汪玮 申请人:中国科学院海洋研究所