专利名称：一种花生活性肽分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及花生活性肽分离、纯化工艺，属于食品蛋白加工领域。
背景技术：
一般地，功能活性肽(抗氧化肽、抗菌肽、血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽)的获得途径主要有三种(1)从天然生物体提取，由于提取成本高，不能大规模生产。( 化学合成、酶法合成或生物反应器法(重组DNA技术)合成，化学合成法成本高、副反应物及残留化合物对人体有害，其发展受到制约；酶法合成反应周期长，产率低不能满足工业生产的需求；生物反应器合成法刚开始兴起，很多技术还不够完善，还不能适应工业化生产。(3)水解蛋白产生，酸法水解蛋白，氨基酸受损严重，水解难控制而较少应用；蛋白酶酶解法反应条件温和，可大量生产含有功能活性肽的粗酶解物，越来越受到重视。但是，蛋白酶酶解后的产物成分较多，既包括所需的目的功能活性肽类，也包括为了维持酶解过程中的PH值而加入的盐类物质，以及原料蛋白的一些成分如未水解的大分子蛋白、游离氨基酸、碳水化合物类、脂肪、无机盐类等。因此，为了获得比较纯的功能活性肽，就必须对粗酶解物进行分离、纯化操作。功能活性肽类是一类两性的生物活性物质，它的活性受溶液的酸碱度、正负电荷多少、离子强度、金属离子等影响。因此，对功能活性肽类进行分离、纯化就不能用化学方法，而必须采用物理方法。目前，物理分离方法通常采用纳滤、阴阳离子交换树脂法、超滤等。纳滤(NF，Nanofiltration)是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右，可以脱除以二价离子为主的盐类和相对分子质量300以上的大多数有机物。离子交换树脂一般呈现多孔状或颗粒状，当溶液流经离子交换树脂时， 溶液中的某些离子，如盐类离子会被带相反电荷的离子交换树脂所吸附，而溶液中其他成分不被吸附而流出，从而达到脱盐的目的。超滤是以压力为推动力的膜分离技术之一，以大分子与小分子分离为目的。在超滤过程中，水溶液在压力推动下，流经膜表面，小于膜孔的溶剂(水)及小分子溶质透过膜，成为透过液，比膜孔大的溶质及溶质集团被截留，随水流排出，成为浓缩液。绿色环保是当前生产企业追求的目标，纳滤、阴阳离子交换树脂法、超滤等分离技术是纯物理操作过程，不会产生化学污染，且分离效率高、分离效果好，愈来愈广泛的应用于食品和医药等行业。本发明采用纳滤、阴阳离子交换树脂法、超滤等技术对花生蛋白粗酶解物进行分离、纯化，可以得到纯度高的花生活性肽产品，包括抗氧化肽、抗菌肽和ACE抑制肽，适合工业化生产需要。
发明内容
本发明的目的是提供产品纯度高，抗氧化性、抑菌性、ACE抑制活性等功能活性好的花生活性肽的分离、纯化方法。为达到上述目的，本发明采用以下步骤
花生蛋白粉蛋白酶酶解液，纳滤预浓缩，阴阳离子树脂脱盐，超滤分离、浓缩，检验活性，冷冻干燥得到一定分子量范围的花生活性肽，包括抗氧化肽、抗菌肽、ACE抑制肽。具体来说，所述的方法如下(1)花生蛋白粉蛋白酶酶解液的制备；(2)将酶解液纳滤，滤液预浓缩，得到预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液；(3)将预浓缩酶解液上树脂柱脱盐，收集浓缩液得到脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；(4)将脱盐的酶解液超滤，分离、浓缩，收集浓缩液，冷冻干燥，即得。所述的花生活性肽为抗氧化活性肽、抑菌活性肽或ACE抑制活性肽。优选地，步骤(1)所述的花生蛋白粉蛋白酶酶解液的制备方法是取质量百分含量为8% 15%的花生蛋白粉悬浮液，调节pH值至5.0，加入10FBG/g花生蛋白粉的 Viscozyme L(复合植物水解酶，FBG为Viscozyme L酶活单位)，在微波萃取/合成仪中， 以800w微波功率和45°C条件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中灭酶20min，调节pH值至 6.5 9.0，加入4000 800(^/^底物(U为蛋白酶酶活单位)的蛋白酶，在微波萃取/合成仪中，以800 IOOOw微波功率和45 60°C条件，微波酶解4 lOmin，然后，100°C水浴中灭酶20min，在20°C条件下，5000r/min离心15min，上清液为花生蛋白粉蛋白酶酶解液；优选地，所述的蛋白酶为菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶以2 2 3比例混合的复合酶PH8. 0。优选地，步骤(2)所述的纳滤预浓缩条件为操作压力为0. 1 0. 6MPa，温度为 20 50°C，截留分子量为100 IOOODa(道尔顿)的卷式、平板式、管式纳滤膜，时间为1 5min。优选地，步骤(3)所述的树脂装柱阴阳离子比例为阴离子阳离子为1 4 4 1，过柱速度为3 8倍柱体积/h。优选地，步骤(4)所述的超滤分离、浓缩条件为操作压力为0. 05 0. 3MPa，温度为20 40°C，截留分子量为IkDa IOkDa (千道尔顿)的卷式、板式、中空纤维式和管式超滤膜，时间为3 lOmin，超滤分离、浓缩的次数为3次。花生活性肽产品纯度高，抗氧化性、抑菌性、ACE抑制活性等功能活性好，可作为天然的食品添加剂(如抗氧化剂、防腐剂)用于食品工业中，也可作为天然的功能保健食品原料用于高血压的辅助治疗中。花生活性肽分离、纯化工艺简单，易操作，纯物理分离过程，环境友好，为增加花生蛋白质资源附加值，提供了新途径，适合工业化生产。
具体实施例方式实施例1取质量百分含量为10%的花生蛋白粉悬浮液，调节pH值至5.0，加入10FBG/g花生蛋白粉的Viscozyme L (复合植物水解酶，FBG为Viscozyme L酶活单位)，在微波萃取 /合成仪中，以800w微波功率和45°C条件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中灭酶20min， 调节PH值至8.0，加入菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶以2 2 3比例混合的复合酶，加入量为5000U/g底物(U为蛋白酶酶活单位)在微波萃取/合成仪中，以800w微波功率和45°C条件，微波酶解6min，然后，100°C水浴中灭酶20min，在20°C条件下，5000r/min离心15min，上清液为花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作压力为0.38MI^和25°C下，经过截留分子量为IOOODa(道尔顿)的卷式纳滤膜，纳滤预浓缩 3. 5min，收集浓缩液得到预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液在5倍柱体积/h条件下，通过阴离子阳离子为3 2的阴阳离子树脂柱脱盐，得到脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作压力为0. IOMPa 和25°C下，经过截留分子量为IOkDa(千道尔顿)的中空纤维式超滤膜，超滤分离、浓缩 %iin，得到透过液1和浓缩液1，将透过液1在操作压力为0. ISMPa和25°C下，经过截留分子量为5kDa(千道尔顿)的中空纤维式超滤膜，超滤分离、浓缩6min，得到透过液2和浓缩液2，将透过液2在操作压力为0. 25MPa和25°C下，经过截留分子量为2kDa (千道尔顿)的中空纤维式超滤膜，超滤分离、浓缩8min，得到透过液3和浓缩液3，检验浓缩液1、浓缩液 2、浓缩液3、透过液3的抗氧化活性，抗氧化活性由高到低依次为透过液3 >浓缩液3 >浓缩液2 >浓缩液1，将透过液3和浓缩液3分别冷冻干燥得到5kDa >分子量> 2kDa和分子量< 2kDa的两种抗氧化钛。实施例2取质量百分含量为12%的花生蛋白粉悬浮液，调节pH值至5.0，加入10FBG/g花生蛋白粉的Viscozyme L (复合植物水解酶，FBG为Viscozyme L酶活单位)，在微波萃取/ 合成仪中，以800w微波功率和45°C条件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中灭酶20min，调节pH值至8.0，加入菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶以2 2 3比例混合的复合酶， 加入量为6500U/g底物(U为蛋白酶酶活单位)在微波萃取/合成仪中，以900w微波功率和55°C条件，微波酶解5min，然后，100°C水浴中灭酶20min，在20°C条件下，5000r/min离心15min，上清液为花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作压力为 0. 45MPa和30°C下，经过截留分子量为800Da(道尔顿)的卷式纳滤膜，纳滤预浓缩5min， 收集浓缩液得到预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液在6 倍柱体积/h条件下，通过阴离子阳离子为4 1的阴阳离子树脂柱脱盐，得到脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作压力为0. 12MI^和25°C 下，经过截留分子量为6kDa(千道尔顿)的卷式超滤膜，超滤分离、浓缩5min，得到透过液1 和浓缩液1，将透过液1在操作压力为0. 20MI^和25°C下，经过截留分子量为3kDa(千道尔顿)的卷式超滤膜，超滤分离、浓缩8min，得到透过液2和浓缩液2，将透过液2在操作压力为0.26MI^和25°C下，经过截留分子量为IkDa(千道尔顿)的中空纤维式超滤膜，超滤分离、浓缩lOmin，得到透过液3和浓缩液3，检验浓缩液1、浓缩液2、浓缩液3、透过液3的抗氧化活性，抗氧化活性由高到低依次为透过液3 >>浓缩液3 >浓缩液2 >浓缩液1，将透过液3冷冻干燥得到分子量< IkDa的花生抗氧化肽。实施例3取质量百分含量为14%的花生蛋白粉悬浮液，调节pH值至5.0，加入10FBG/g花生蛋白粉的Viscozyme L(复合植物水解酶，FBG为Viscozyme L酶活单位)，在微波萃取 /合成仪中，以800w微波功率和45°C条件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中灭酶20min， 调节PH值至8.0，加入菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶以2 2 3比例混合的复合酶，加入量为7500U/g底物(U为蛋白酶酶活单位)在微波萃取/合成仪中，以IOOOw微波功率和52°C条件，微波酶解6. 5min，然后，100°C水浴中灭酶20min，在20°C条件下，5000r/min离心15min，上清液为花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作压力为0.42MI^和35°C下，经过截留分子量为IOOODa(道尔顿)的管式纳滤膜，纳滤预浓缩 2min，收集浓缩液得到预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液在8倍柱体积/h条件下，通过阴离子阳离子为1 1的阴阳离子树脂柱脱盐，得到脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作压力为0. 13MPa和 30°C下，经过截留分子量为5kDa(千道尔顿)的中空纤维式超滤膜，超滤分离、浓缩7. 5min, 得到透过液1和浓缩液1，将透过液1在操作压力为0. 20MI^和30°C下，经过截留分子量为 3kDa(千道尔顿)的管式超滤膜，超滤分离、浓缩8. 5min，得到透过液2和浓缩液2，将透过液2在操作压力为0.30MI^和30°C下，经过截留分子量为IkDa(千道尔顿)的中空纤维式超滤膜，超滤分离、浓缩IOmin，得到透过液3和浓缩液3，检验浓缩液1、浓缩液2、浓缩液3、 透过液3的抗氧化活性，抗氧化活性由高到低依次为透过液3 >浓缩液3 >浓缩液2 >浓缩液1，将透过液3和浓缩液3分别冷冻干燥得到3kDa >分子量> IkDa和分子量< IkDa 的两种花生ACE抑制肽。实施例4取质量百分含量为8 %的花生蛋白粉悬浮液，调节pH值至5. 0，加入10FBG/g花生蛋白粉的Viscozyme L (复合植物水解酶，FBG为Viscozyme L酶活单位)，在微波萃取/ 合成仪中，以800w微波功率和45°C条件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中灭酶20min，调节pH值至8.0，加入菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶以2 2 3比例混合的复合酶 PH8.0，加入量为6000U/g底物(U为蛋白酶酶活单位)在微波萃取/合成仪中，以900w微波功率和58°C条件，微波酶解8min，然后，100°C水浴中灭酶20min，在20°C条件下，5000r/min 离心15min，上清液为花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作压力为0. IOMI^a和35°C下，经过截留分子量为SOODa(道尔顿)的卷式纳滤膜，纳滤预浓缩:3min， 收集浓缩液得到预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液在6 倍柱体积/h条件下，通过阴离子阳离子为1 4的阴阳离子树脂柱脱盐，得到脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作压力为0. 12MI^和32°C 下，经过截留分子量为6kDa (千道尔顿)的管式超滤膜，超滤分离、浓缩7min，得到透过液 1和浓缩液1，将透过液1在操作压力为0. 22MPa和32°C下，经过截留分子量为3kDa(千道尔顿)的管式超滤膜，超滤分离、浓缩9min，得到透过液2和浓缩液2，将透过液2在操作压力为OJSMI^和32°C下，经过截留分子量为IkDa(千道尔顿)的管式超滤膜，超滤分离、浓缩lOmin，得到透过液3和浓缩液3，检验浓缩液1、浓缩液2、浓缩液3、透过液3的抗氧化活性，抗氧化活性由高到低依次为透过液3 >浓缩液3 >浓缩液2 >浓缩液1，将透过液3、浓缩液3、浓缩液2分别冷冻干燥得到6kDa >分子量> 3kDa、3kDa >分子量> IkDa和分子量 < IkDa的三种花生抗菌肽。实施例5取质量百分含量为12. 5 %的花生蛋白粉悬浮液，调节pH值至5. 0，加入10FBG/g 花生蛋白粉的Viscozyme L (复合植物水解酶，FBG为Viscozyme L酶活单位)，在微波萃取/合成仪中，以800w微波功率和45°C条件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中灭酶20min， 调节PH值至8.0，加入菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶以2 2 3比例混合的复合酶，加入量为8000U/g底物(U为蛋白酶酶活单位)在微波萃取/合成仪中，以800w微波功率和56°C条件，微波酶解8. 2min，然后，100°C水浴中灭酶20min，在20°C条件下，5000r/ min离心15min，上清液为花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作压力为0.6MI^和30°C下，经过截留分子量为IOOODa(道尔顿)的卷式纳滤膜，纳滤预浓缩 4min,收集浓缩液得到预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液在6倍柱体积/h条件下，通过阴离子阳离子为4 3的阴阳离子树脂柱脱盐，得到脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液在操作压力为0. IOMPa和 40°C下，经过截留分子量为SkDa(千道尔顿)的中空纤维式超滤膜，超滤分离、浓缩8min， 得到透过液1和浓缩液1，将透过液1在操作压力为0. 22MI^和40°C下，经过截留分子量为 4kDa(千道尔顿)的中空纤维式超滤膜，超滤分离、浓缩8min，得到透过液2和浓缩液2，将透过液2在操作压力为OJSMI^和40°C下，经过截留分子量为IkDa(千道尔顿)的中空纤维式超滤膜，超滤分离、浓缩8min，得到透过液3和浓缩液3，检验浓缩液1、浓缩液2、浓缩液3、透过液3的抗氧化活性，抗氧化活性由高到低依次为透过液3 >>浓缩液3 >浓缩液 2 >浓缩液1，将透过液3冷冻干燥得到分子量< IkDa的花生抗菌肽。
权利要求
1.一种花生活性肽分离、纯化方法，包括以下步骤(1)花生蛋白粉蛋白酶酶解液的制备；(2)将酶解液纳滤，滤液预浓缩，得到预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液；(3)将预浓缩酶解液上树脂柱脱盐，收集浓缩液得到脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；(4)将脱盐的酶解液超滤，分离、浓缩，收集浓缩液，冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的花生活性肽分离、纯化方法，其特征在于，所述的花生活性肽为抗氧化活性肽、抑菌活性肽或ACE抑制活性肽。
3.根据权利要求1所述的花生活性肽分离、纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述的花生蛋白粉蛋白酶酶解液的制备方法是取质量百分含量为8% 15%的花生蛋白粉悬浮液， 调节PH值至5. 0，每克花生蛋白粉加入10FBG的复合植物水解酶Viscozyme L，以800w微波功率和45°C条件，微波酶解5min，然后，90°C水浴中灭酶20min，调节pH值至6. 5 9. 0， 每克底物加入4000 8000U的蛋白酶，以800 IOOOw微波功率和45 60°C条件，微波酶解4 lOmin，然后，100°C水浴中灭酶20min，在20°C条件下，5000r/min离心15min，上清液为花生蛋白粉蛋白酶酶解液。
4.根据权利要求1所述的花生活性肽分离、纯化方法，其特征在于，所述的蛋白酶为菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶以2 2 3比例混合的复合酶pH8.0。
5.根据权利要求1所述的花生活性肽分离、纯化方法，其特征在于，步骤( 所述的纳滤预浓缩条件为操作压力为0. 1 0. 6MPa，温度为20 50°C，截留分子量为100 IOOODa纳滤膜，时间为1 5min。
6.根据权利要求1所述的花生活性肽分离、纯化方法，其特征在于，步骤C3)所述的树脂装柱阴阳离子比例为阴离子阳离子为1 4 4 1，过柱速度为3 8倍柱体积/h。
7.根据权利要求1所述的花生活性肽分离、纯化方法，其特征在于，步骤(4)所述的超滤分离、浓缩条件为操作压力为0. 05 0. 3MPa，温度为20 40°C，截留分子量为IkDa IOkDa超滤膜，时间为3 lOmin，超滤分离、浓缩的次数为3次。
全文摘要
本发明公开了一种花生活性肽分离、纯化方法，包括以下步骤花生蛋白粉蛋白酶酶解液的制备；将酶解液纳滤，滤液预浓缩，得到预浓缩花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将预浓缩酶解液上树脂柱脱盐，收集浓缩液得到脱盐的花生蛋白粉蛋白酶酶解液；将脱盐的酶解液超滤，分离、浓缩，收集浓缩液，冷冻干燥，即得。以本发明制得的花生活性肽产品纯度高，抗氧化性、抑菌性、ACE抑制活性等功能活性好，可作为天然的食品添加剂用于食品工业中，也可作为天然的功能保健食品原料用于高血压的辅助治疗中。工艺简单，易操作，适合工业化生产。
文档编号C07K1/34GK102250999SQ201110145258
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者于丽娜, 孙杰, 张会翠, 张初署, 朱凤, 杨庆利, 毕洁 申请人:山东省花生研究所