专利名称：静注巨细胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人免疫球蛋白及其制备方法，特别是一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法。
背景技术：
巨细胞病毒CMV(Cytomegalovirus)是疱疹病毒科β属的DNA病毒，由巨细胞病毒引起的孕妇、新生儿、器官移植患者、免疫抑制患者感染死亡率可达50% 80%。巨细胞病毒人免疫球蛋白CMV-IgG因能特异中和巨细胞病毒，临床上主要用其治疗孕妇、新生儿、 免疫抑制患者及器官移植手术中弓I发的巨细胞病毒重症感染。普通人群中的巨细胞病毒自然感染率可达80%以上，从健康人群中筛选并采集含高效价巨细胞病毒IgG抗体的血浆， 采用特定的分离纯化方法制备巨细胞病毒人免疫球蛋白药物，对于治疗因巨细胞病毒引起的重症感染具有不可替代的临床应用价值。目前，已上市的特异性人免疫球蛋白类药物大多采用低温乙醇法(Edwin J. Cohn, L. Ε. Strong, W. L. Hughes JR. , D. J. Mulford, J. N. Ashworthm, M. Melin and H. L. Taylor, J.Am. Chem. Soc.，68 (1946) 459-475.)进行分离提纯，该法由1946年美国哈佛大学Edwin. J. Cohn教授发明，通过调节工艺中的pH，蛋白浓度，温度，乙醇浓度和离子强度五个参数来实现不同蛋白的分离。长期实践表明，低温乙醇法存在以下几方面的缺陷首先，乙醇是一种蛋白变性剂，分离过程中易引起IgG结构改变而变性失活，导致效价回收率较低，还可能导致新的抗原决定簇的形成；其次，相比柱层析技术，乙醇沉淀纯化效率较低，通常需要减少蛋白回收率来达到产品的纯度要求，因此工艺过程收率偏低，产品纯度不高；再次，因分离过程通常需在低温条件下进行，还存在硬件及运行成本高，劳动强度大等缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法，要解决的技术问题是提高产品的纯度、收率及安全性。本发明采用以下技术方案一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白，所述静注巨细胞病毒人免疫球蛋白比活性不小于2. 5PEI-U/mg,抗-CMV效价不小于100PEI-U/ml，纯度大于 98. 2%，蛋白含量为51 55mg/ml。一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白的方法，包括以下步骤(1)FI+II+III、FII+III 沉淀制备取经酶联免疫法测定的抗-CMV高效价的人血浆，2 30°C下融浆，合并混合；①FI+II+III沉淀制备用生理盐水调节血浆蛋白含量至45 55mg/ml，用冰乙酸调节pH至6. 0 6. 5， 加入95%乙醇或无水乙醇调节乙醇浓度至20 25%，反应温度为-5. 5 -4. 5°C，搅拌反应为4 6小时，反应完毕离心或压滤分离获得FI+II+III沉淀；②FII+III沉淀制备
用生理盐水调节血浆蛋白含量至45 55mg/ml，用冰乙酸调节pH至6. 8 7. 2， 加入体积比分数为95%的乙醇或无水乙醇并调节乙醇浓度至7. 5 8. 5%，反应温度为-2. 5 -2. 0°C，搅拌反应4小时，反应完毕经离心或压滤分离去除FI沉淀，获得上清液，用冰乙酸调节上清液pH至6. 0 6. 5，加入95%乙醇或无水乙醇调节乙醇浓度至20 25%，反应温度为-5. 5 -4. 5°C，搅拌反应为4 6小时，反应完毕经离心或压滤分离获得 FII+III 沉淀；(2)FI+II+III 或 FII+III 沉淀溶解FI+II+III或FII+III沉淀用0. 9 1. 1倍血浆量的pH为4. 8 5. 2、浓度为20 SOmM乙酸钠缓冲液在2 8°C下搅拌8 16小时，使沉淀充分溶解，经离心或压滤分离上
清液；⑶辛酸沉淀用4mol/L乙酸或0. 5 lmol/L氢氧化钠调节上清液pH至4. 5 5. 5，按10 lOOmmol/L浓度加入辛酸，在18 25°C下搅拌反应1 3小时，经离心或过滤分离上清液；(4)辛酸病毒灭活上清液用孔径为1. 0 μ m滤膜过滤，控制过滤压力不大于0. 25MPa，用4mol/L乙酸或0. 5 lmol/L氢氧化钠调节滤液pH至4. 5 5. 5，补加注射用水或辛酸调节悬液辛酸浓度至20 80mmol/L，在20 30°C下搅拌1 2小时，离心或过滤分离上清液；(5)乙醇沉淀用0. 5 lmol/L盐酸或氢氧化钠调节上清液pH至4. 5 5. 5，按12 16%浓度加入95%乙醇或无水乙醇进行沉淀反应，在-4. 0 -2. 5°C下搅拌反应2 8小时，离心或压滤分离上清液；(6)超滤上清液经0. 45 μ m滤膜过滤，控制过滤压力不大于0. 25MPa,滤液用30KD超滤膜 15 20倍浓缩，经8 10倍体积pH 6. 0 7. 1的20 60mmol/L的磷酸盐缓冲液超滤透析，超滤后收样控制蛋白含量为25 40mg/ml ；(7)阴离子交换层析用pH为6. 0 7. 1、浓度为20 60mmol/L的磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液平衡层析柱8 10柱体积，按每毫升填料不大于填料最大载量的70 80%计算上样蛋白量，上样后收集穿透液，挂柱杂蛋白经含2mol/LNaCl的pH 6. 0 7. 1的20 60mmol/L的磷酸盐缓冲液洗脱；(8)纳米膜除病毒过滤用0. 5 lmol/L的盐酸调节穿透液pH至4. 2 5. 0，经0. 1 μ m滤膜预过滤后，用 Novasip DV20纳米膜过滤除病毒，控制过滤压力不大于0. 25Mpa ；(9)超滤除病毒后滤液经30KD超滤膜浓缩蛋白含量至80 100mg/ml，用8 10倍注射用水超滤，超滤后收样控制蛋白含量为80 150mg/ml ；(10)配制测定超滤后原液蛋白含量，用注射用水稀释调整制品蛋白含量至51 55mg/ml， 同时按9 11%的量加入麦芽糖，用0.5 lmol/L盐酸调节pH至3. 8 4. 2。
本发明的方法在所述配制步骤后除菌分装，经0.2μπι滤膜过滤除菌，控制过滤压力不大于0. 25MPa，按蛋白含量51 55mg/ml，效价不小于100PEI-U/ml规格分装。本发明的方法抽样测定分装后制品蛋白含量，抗-CMV效价，纯度，分子大小分布， 辛酸残留量，渗透压摩尔浓度的项目质量指标。本发明的在阴离子交换层析步骤中加入填料，填料选自DEAE Sepharose Fast Flow、TOYOPEARL DEAE 650M 或 Macro-Pr印 DEAE Media。本发明与现有技术的全过程低温乙醇分级分离工艺方法相比，具有的技术效果如下(1)采用了条件温和的辛酸沉淀及阴离子交换层析工艺，减少了低温乙醇沉淀的步骤，在提高产品收率的同时，能有效保持IgG的活性，提高纯度和收率。工艺过程效价回收率为40 65%，纯化倍数为5. 30 8. 14，IgG回收率大于4. 9g/L，纯度大于98. 2%，IgG 多聚体小于0. 1%。(2)工艺过程中采用了辛酸病毒灭活和纳米膜过滤除病毒工艺，能有效灭活和去除病毒，结合阴离子交换层析，工艺过程病毒降低量大于121og1(l。(3)辛酸沉淀能有效沉淀非免疫球蛋白类杂质，而IgG、IgA、铜蓝蛋白保留在上清液中，沉淀过程抗体效价回收率可达90 %以上。(4)阴离子交换层析能有效去除多聚体及酸性杂蛋白，经纯化后最终产品不含多聚体、白蛋白等杂质。(5)本发明工艺的生产周期为5 7天，现有技术的低温乙醇工艺生产周期为 28 30天，有效提高了生产效率，同时减少了乙醇的使用量，降低能耗和劳动强度，能有效节约生产成本。总之，本发明所用的巨细胞病毒人免疫球蛋白的制备工艺不仅提高了产品纯度、 收率和安全性，还能节省能耗和降低生产成本。
图1是本发明静注巨细胞病毒人免疫球蛋白纯化工艺流程图。图2是现有技术低温乙醇法制备普通人免疫球蛋白工艺流程图。图3是实施例1静注巨细胞病毒人免疫球蛋白纯化样品聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳图谱。图4是实施例2静注巨细胞病毒人免疫球蛋白纯化样品聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳图谱。图5是实施例3静注巨细胞病毒人免疫球蛋白纯化样品聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳图谱。图6是实施例4静注巨细胞病毒人免疫球蛋白纯化样品聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳图谱。图7是实施例5静注巨细胞病毒人免疫球蛋白纯化样品聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳图谱。图8是对比例1静注人免疫球蛋白pH4纯化样品聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳图谱。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例1，如图1所示，(1)取经酶联免疫法测定抗-CMV高效价的人血浆20人份，25°C条件下融浆，混合后体积为11540ml。(2)加入生理盐水2310ml调节血浆蛋白含量至49. 53mg/ml，，加入冰乙酸调节pH 至6. 18，加入无水乙醇3^6ml调节悬液乙醇浓度至22%，调节反应温度至-5. 0°C，搅拌反应4小时，反应完毕离心分离获得FI+II+III沉淀。(3)FI+II+III沉淀用pH为4. 93、浓度为50mmol/L乙酸钠缓冲液11500ml进行溶解，4°C下搅拌12小时，离心分离上清液。(4)用4mol/L乙酸调节上清pH至4. 57，60mmol/L浓度加入辛酸，在21°C下搅拌反应3小时，离心分离上清液。(5)上清液经1. 0 μ m滤膜过滤，控制过滤压力不大于0. 25MPa,用0. 5mol/L氢氧化钠调节PH至4. 74，补加注射用水调整辛酸浓度至22mmol/L，22°C下搅拌1小时灭活脂包
膜病毒，离心分离上清液。(6)用0. 5mol/L氢氧化钠调节上清pH至5. 11，按14%浓度加入无水乙醇2070ml， 在-3. 8°C下反应7小时，离心分离上清液。(7)上清液经0. 45 μ m滤膜过滤，控制过滤压力不大于0. 25MPa,滤液用30KD超滤膜20倍浓缩，经8倍体积pH为6. 63、浓度为25mmol/L磷酸盐缓冲液超滤，超滤后收样 2000ml，蛋白含量为 36. 81mg/ml。(8)用 pH 为 6. 63、浓度为 25mmol/L 磷酸盐缓冲液平衡 DEAE Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Bio-Sciences AB，美国)柱10个柱体积，柱体积为200ml，，将超滤后滤液过柱，收集穿透液7000ml，挂柱杂蛋白用含2mol/LNaCl的pH为6. 63、浓度为25mmol/ L的磷酸盐缓冲液洗脱。(9)用lmol/L盐酸调节穿透液pH至4.25，经0. Iym滤膜预过滤后，再用Novasip DV20纳米膜过滤除病毒，控制过滤压力不大于0. 25MPa。(10)除病毒后滤液用30KD超滤膜10倍浓缩，经8倍体积注射用水超滤，收获原液 600ml，蛋白含量为107. 21mg/ml，用注射用水稀释并按10g/L的量加入麦芽糖，用0. 5mol/ L盐酸调节pH至4. 02，经0. 2 μ m滤膜过滤除菌，控制过滤压力不大于0. 25MPa,按蛋白含量51 55mg/ml，效价不小于100PEI_U/ml规格分装，分装后抽样用凯氏定氮法检测蛋白含量、用酶联免疫法法测定效价、非还原型E聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE法测定纯度及白蛋白残留、PH值测定法测定pH值，高效液相色谱法测定IgG单体、二聚体、多聚体、裂解体，气相色谱法测定辛酸残留量，渗透压摩尔浓度测定法测定渗透压摩尔浓度，检测结果见表6。工艺过程蛋白及效价回收率见表1。表1工艺过程蛋白及效价回收率
权利要求
1.一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白，其特征在于所述静注巨细胞病毒人免疫球蛋白比活性不小于2. 5PEI-U/mg，抗-CMV效价不小于100PEI-U/ml，纯度大于98. 2%，蛋白含量为 51 55mg/ml。
2.一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白的方法，包括以下步骤(1)FI+II+III、FII+III沉淀制备取经酶联免疫法测定的抗-CMV高效价的人血浆，2 30°C下融浆，合并混合；①FI+II+III沉淀制备用生理盐水调节血浆蛋白含量至45 55mg/ml，用冰乙酸调节pH至6. 0 6. 5，加入 95%乙醇或无水乙醇调节乙醇浓度至20 25%，反应温度为-5. 5 -4. 5°C，搅拌反应为 4 6小时，反应完毕离心或压滤分离获得FI+II+III沉淀；②FII+III沉淀制备用生理盐水调节血浆蛋白含量至45 5511^/1111，用冰乙酸调节？!1至6.8 7.2， 加入体积比分数为95%的乙醇或无水乙醇并调节乙醇浓度至7. 5 8. 5%，反应温度为-2. 5 -2. 0°C，搅拌反应4小时，反应完毕经离心或压滤分离去除FI沉淀，获得上清液，用冰乙酸调节上清液pH至6. 0 6. 5，加入95%乙醇或无水乙醇调节乙醇浓度至20 25%，反应温度为-5. 5 -4. 5°C，搅拌反应为4 6小时，反应完毕经离心或压滤分离获得 FII+III 沉淀；(2)FI+II+III或 FII+III 沉淀溶解FI+II+III或FII+III沉淀用0. 9 1. 1倍血浆量的pH为4. 8 5. 2、浓度为20 SOmM乙酸钠缓冲液在2 8°C下搅拌8 16小时，使沉淀充分溶解，经离心或压滤分离上清液；(3)辛酸沉淀用4mol/L乙酸或0. 5 lmol/L氢氧化钠调节上清液pH至4. 5 5. 5，按10 lOOmmol/L浓度加入辛酸，在18 25°C下搅拌反应1 3小时，经离心或过滤分离上清液；(4)辛酸病毒灭活上清液用孔径为Ι.Ομπι滤膜过滤，控制过滤压力不大于0. 25MPa，用4mol/L乙酸或 0. 5 lmol/L氢氧化钠调节滤液pH至4. 5 5. 5，补加注射用水或辛酸调节悬液辛酸浓度至20 80mmol/L，在20 30°C下搅拌1 2小时，离心或过滤分离上清液；(5)乙醇沉淀用0. 5 lmol/L盐酸或氢氧化钠调节上清液pH至4. 5 5. 5，按12 16%浓度加入 95%乙醇或无水乙醇进行沉淀反应，在-4. 0 -2. 5°C下搅拌反应2 8小时，离心或压滤分离上清液；(6)超滤上清液经0. 45 μ m滤膜过滤，控制过滤压力不大于0. 25MPa,滤液用30KD超滤膜15 20倍浓缩，经8 10倍体积pH 6. 0 7. 1的20 60mmol/L的磷酸盐缓冲液超滤透析，超滤后收样控制蛋白含量为25 40mg/ml ；(7)阴离子交换层析用pH为6. 0 7. 1、浓度为20 60mmol/L的磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液平衡层析柱8 10柱体积，按每毫升填料不大于填料最大载量的70 80%计算上样蛋白量，上样后收集穿透液，挂柱杂蛋白经含2mol/LNaCl的pH 6. 0 7. 1的20 60mmol/L的磷酸盐缓冲液洗脱；(8)纳米膜除病毒过滤用0. 5 lmol/L的盐酸调节穿透液pH至4. 2 5. 0，经0. 1 μ m滤膜预过滤后，用 Novasip DV20纳米膜过滤除病毒，控制过滤压力不大于0. 25Mpa ；(9)超滤除病毒后滤液经30KD超滤膜浓缩蛋白含量至80 100mg/ml，用8 10倍注射用水超滤，超滤后收样控制蛋白含量为80 150mg/ml ；(10)配制测定超滤后原液蛋白含量，用注射用水稀释调整制品蛋白含量至51 55mg/ml，同时按9 11%的量加入麦芽糖，用0.5 lmol/L盐酸调节pH至3. 8 4. 2。
3.根据权利要求2所述的静注巨细胞病毒人免疫球蛋白的方法，其特征在于在所述配制步骤后除菌分装，经0. 2 μ m滤膜过滤除菌，控制过滤压力不大于0. 25MPa,按蛋白含量 51 55mg/ml，效价不小于100PEI-U/ml规格分装。
4.根据权利要求3所述的静注巨细胞病毒人免疫球蛋白的方法，其特征在于抽样测定分装后制品蛋白含量，抗-CMV效价，纯度，分子大小分布，辛酸残留量，渗透压摩尔浓度的项目质量指标。
5.根据权利要求2所述的静注巨细胞病毒人免疫球蛋白的方法，其特征在于在阴离子交换层析步骤中加入填料，填料选自DEAE Sepharose Fast Flow、T0Y0PEARL DEAE 650M 或 Macro-Prep DEAE Media。
全文摘要
本发明公开了一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法，要解决的技术问题是提高产品的纯度、收率及安全性。本发明的静注巨细胞病毒人免疫球蛋白比活性不小于2.5PEI-U/mg，抗-CMV效价不小于100PEI-U/ml，纯度大于98.2％，蛋白含量为51～55mg/ml。本发明采用辛酸沉淀、阴离子交换层析代替传统低温乙醇法部分乙醇沉淀步骤，将IgG始终保留在上清液中，以保持IgG的活性；采用辛酸病毒灭活与纳米膜除病毒工艺，有效地保障产品的安全性，研究表明本发明的制备方法不仅提高了产品纯度、收率和安全性，还能节省能耗和降低生产成本。
文档编号C07K1/36GK102286099SQ201110223760
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者丁玉江, 刘永娣, 吴开永, 吴恩应, 宋清爽, 张佩, 张信, 张彦鹏, 张运佳, 戴美兰, 李慧, 王春华, 王锦才, 罗姗, 郭采平, 陈玉琴, 黄伟荣, 黄倩云 申请人:深圳市卫武光明生物制品有限公司