专利名称：一种从蜂王浆中提取10-羟基-2-癸烯酸的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从蜂王浆中提取10-羟基-2-癸烯酸的工艺，特别是一种大孔吸附树脂吸附层析法提取癸烯酸的工艺。
背景技术：
蜂王浆又名蜂皇浆， 是由11 21日龄的青年工蜂下咽头腺和大颚腺分泌的，主要用于饲喂蜂王和幼虫，呈乳白色、淡黄色或浅橙色半透明为粘稠浆状，具有特殊香味、味酸、 涩、辛、略甜，富含蛋白质、糖类、脂肪酸、维生素、游离氨基酸等生理活性物质。蜂王浆具有活化细胞、促使伤口愈合、促进内分泌、增加食欲、增强体力、防治骨质疏松、防衰老、安神、 抗菌、抗癌、抗辐射等多种生理活性作用，具有极高的医药和保健价值。10-羟基-2-癸烯酸(10-Hydroxy-2-Decenoic acid, 10-HDA)又称王衆酸,是蜂王衆中主要的活性成分,是德国科学家D. J朗格于1921年首次在工蜂上颚腺中发现的。1957年，A. Butenandt首先报道从蜂王浆中分离得到10-HAD。此后，国内外学者从性质、结构、药理及测定方法等方面对 10-HAD进行了较为深入的研究。10-HAD是一种不饱和脂肪酸，分子式为HO-CH2-(CH2)6-CH =CH-COOH(C10H18O3)，分子量186. 25，白色絮状结晶或针状结晶，不易吸潮，在高温条件下易变为油状或焦化，低温冷冻干燥时不易升华。熔点为64°C，溶于甲醇、乙醇、乙醚和氯仿，微溶于丙酮，难溶于水。对石蕊试纸显酸性，能使溴水和高锰酸钾溶液迅速褪色，对三氯化铁不显紫色。
研究表明，10-HAD对人和动物具有多方面的药理作用。第一，抑菌杀菌作用， 10-HAD对金黄葡萄球菌、链球菌、变形杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、结核杆菌星状癣菌、 表皮癣菌等具有抑菌杀菌作用，10-HAD对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌的最低以菌浓度(MIC)分别为 O. 625mg/mL、l. 25mg/mL、2. 5mg/mL ;第二，抗癌、抗肿瘤作用，10-HAD 可通过刺激环状-腺磷苷的合成，使蛋白质螺旋结构和氨基酸序列正常化，从而使受肿瘤破坏的结构正常化，因而对癌细胞具有抑制作用；第三，抗辐射作用，10-HAD具有保护和修复蛋白质、DNA、RNA的作用，所以它能对急性辐射损伤起到防治作用；第四，降血脂作用， 10-HAD能减少饭后脂肪堆积，防止脂类物质的合成，是改善血液中脂肪含量的一部分因素， 对高血脂症具有良好的治疗作用。
10-HAD作为一种拥有显著生理活性的物质，不仅可以直接作为药物使用，而且还是食品、化妆品的添加剂，还可以用于合成香料和医药中间体，市场需求极大。迄今为止，已报道的10-HAD的提取方法主要有乙醇提取法、乙醚提取法、溶液沉淀结晶法、醇中沉淀结晶法及高效液相色谱法(HPLC)等。有机溶剂提取法不但过程复杂、工序繁琐、回收率较低， 而且获得的10-HAD纯度不高。HPLC法虽然可获得纯度较高的10-HAD，但是该方法不适于工业化生产。大孔吸附树脂具有选择性好、回收率高、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点。本发明利用大孔吸附树脂提取蜂王浆中的10-HAD，获得的10-HAD纯度高，而且具有回收率高、工艺流程简单、对生物活性无损等特点，适用于10-HDA的工业化大规模生产。发明内容
本发明提供一种利用大孔吸附树脂快速、无损的从蜂王浆中提取高纯度10-HAD 的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为，用95%乙醇将蜂王浆稀释适当倍数后，超声振荡提取，去离子水稀释；提取液经大孔吸附树脂静态吸附；吸附树脂装柱，乙醇动态洗脱，收集洗脱液中含10-HDA的组份；经蒸发浓缩、冷冻干燥获得纯度> 92. 5%的 10-HDA。其具体过程如下
a、将蜂王浆与一定比例的95 %乙醇混合、振荡混匀，置于超声波中超声提取 15min, 3000r/min 离心 5min,取上清。
b、将a步骤中获得的上清液用4 5倍体积的去离子水稀释后与大孔吸附树脂 X-5按一定比例混合，150r/min振荡吸附3h 4h。
C、将吸附后的大孔吸附树脂X-5装入层析柱，先用3倍柱体积20%乙醇洗脱，去除部分杂质，然后用浓度为75 % 95 %的乙醇解吸10-HDA，流速为lmL/min，核酸蛋白检测器检测波长为245nm，根据解吸曲线收集含10-HAD组份的解吸液。
d、将收集到的解吸液蒸发浓缩、然后冷冻干燥，所得到的干物即为10-HAD。
其中
步骤a中所述的蜂王浆与95%乙醇的比例为1: 3 (m/v)。
步骤b中上清液与大孔吸附树脂X-5的比例为I 10 (m/v)。
本发明具有如下优点
(I)利用95%的乙醇超声提取10-HAD条件温和、回收率高。
(2)本发明采用的大孔吸附树脂X-5对10-HAD选择性良好，吸附、解吸速度快，吸附容量大，所用试剂可回收利用，且工艺流程简单，适于工业生产。
(3)本发明所提取的10-HAD纯度高，并且自然状态下可保持原有的生理活性。
具体实施方式
实施例1 :
(I) 95%乙醇超声提取10-HAD :将蜂王浆与95%乙醇按1: 3(m/v)的比例混合、 振荡混勻，置于超声波中超声提取15min, 3000r/min离心5min,取上清。
(2)大孔吸附树脂吸附10-HAD :将上清液用4 5倍体积的去离子水稀释后与大孔吸附树脂X-5按1: 10 (m/v)比例混合，150r/min振荡混匀4h，弃去吸附后的残液，收集树脂，用蒸馏水洗涤树脂3次。
(3)解吸剂解吸10-HAD :吸附后的大孔吸附树脂X-5装入层析柱，先用3倍柱体积 20%乙醇洗脱，去除部分杂质，然后用浓度为75%的乙醇解吸10-HDA，流速为lmL/min根据解吸曲线收集含10-HAD的解吸液。
(4) 10-HAD的获得及纯度测定将收集的解吸液蒸发浓缩、冷冻干燥后获得的白色物质即10-HAD。经HPLC外标法测定其回收率为81%，纯度为95%。
实施例2
(I) 95%乙醇超声提取10-HAD :将蜂王浆与95%乙醇按1: 3(m/v)的比例混合、震荡混匀，置于超声波中超声提取15min，3000r/min离心5min，取上清。
(2)大孔吸附树脂吸附10-HAD :将上清液4 5倍体积的蒸馏水稀释后与大孔吸附树脂X-5按1: 10 (m/v)比例混合，150r/min振荡混匀4h，弃去吸附后的残液，收集树脂， 用蒸馏水洗涤树脂3次。
(3)解吸剂解吸10-HAD :吸附后的大孔吸附树脂X-5装入层析柱，先用3倍柱体积 20%乙醇洗脱，去除部分杂质，然后用浓度为95%的乙醇解吸10-HDA，流速为lmL/min根据解吸曲线收集含10-HAD的解吸液。
(4) 10-HAD的获得及回收率、纯度测定将收集的解吸液蒸发浓缩、冷冻干燥后获得的白色物质即10-HAD。经HPLC内标法测定其回收率为8 7%，纯度为92. 5%。
权利要求
1.一种大孔吸附树脂法从蜂王浆中提取10-羟基-2-癸烯酸(IO-HDA)的方法，该方法包括以下工艺步骤 (1)蜂王浆经95%乙醇溶解后，超声提取； (2)提取液用去离子水稀释后与大孔吸附树脂按一定比例混合，150r/min振荡吸附3h 4h ; (3)吸附后树脂装柱；先以20%的乙醇洗脱杂质，然后以75 % 95 %的乙醇洗脱10-HAD ； (4)将收集到的洗脱液蒸发浓缩、冷冻干燥所得白色物质即为10-HAD。
2.根据权利要I所述的10-HDA提取工艺，其特征在于，所述步骤(I)蜂王浆与95%乙醇比例为1: 3(m/v)。
3.根据权利要I所述的10-HDA提取工艺，其特征在于，所述步骤(2)提取液用4 5倍体积的蒸馏水稀释。
4.根据权利要I所述的10-HDA提取工艺，其特征在于，所述步骤(2)大孔吸附树脂为X-5树脂。
5.根据权利要I所述的10-HDA提取工艺，其特征在于，所述步骤(2)提取液与大孔树月旨X-5的比例为I 10(m/v)。
6.根据权利要I所述的10-HDA提取工艺，其特征在于，所述步骤(3)解吸液为75% 95%的乙醇。
全文摘要
本发明公布了大孔吸附树脂法从蜂王浆中提取10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)的工艺。蜂王浆溶于95％乙醇，经超声提取；提取液加去离子水稀释后用大孔吸附树脂X-5吸附提取液中的10-HAD；吸附后的树脂装入层析柱，以75％～95％的乙醇解吸，收集含10-HAD的解吸液；洗脱液蒸发浓缩、冷冻干燥获得纯度≥92.5％的10-HAD。
文档编号C07C59/42GK103044240SQ20111032096
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月15日 优先权日2011年10月15日
发明者张其安, 杨少波 申请人:山东华康蜂业有限公司