专利名称：一种马钱子总碱的提取分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种中药有效成分的提取方法，特别是涉及一种从中药马钱子中提取马钱子碱的方法，属于药物技术领域。
背景技术：
马钱子又名番木鳖，始载于《本草纲目》，味苦，寒性，有大毒，归肝，脾经，功效为通络止痛，散结消肿。临床上用于风湿顽痹，麻木瘫痪，跌打损伤，痈疽肿痛，小儿麻痹后遗症，类风湿性关节炎等疾病；但具有剧毒的特性严重影响其在临床上的应用，所谓“毒药猛剂善起沉疴”。马钱子的治疗量为0.3-0.6g，过量易出现中毒，如何合理安全使用马钱子，成为近年的研究热点之一。研究表明，总生物碱是马钱子中最主要的有效部位，包括马钱子碱、士的宁、番木鳖次碱、马钱子新碱、番木鳖甙、依卡精等，其中的主要生物碱成分中马钱子碱具有抗炎、镇痛作用，士的宁则是中枢神经兴奋剂，主要在临床上治疗面瘫，神经麻痹等，同时也是主要的毒性成分，基本无抗炎、镇痛作用；文献报道小鼠灌服士的宁、马钱子碱、马钱子仁的LD50分别为3.27mg/kg、233mg/kg和234.5mg/kg ;小鼠腹腔注射上述药物的LD50分另为
1.53mg/kg、69.77mg/kg和76mg/kg，其口服中毒剂量成人为5 10mg，口服致死量为30mg。表明士的宁是马钱子中的主要毒性成分。有文献报道，分别用士的宁和马钱子碱给小鼠灌胃，两者的LD5tl分别为3.27mg/kg和233mg/kg,由此可以得知士的宁的安全性很低,如果能除去马钱子总生物碱中的部分士的宁，则既能降低其毒性，又能保留其原有的抗炎镇痛的药理活性，提高临床用药的安全性。因此，现代研究中需要一种能降低士的宁含量的马钱子总碱的提取方法。有文献报道，分别用士的宁和马钱子碱给小鼠灌胃，两者的LD5tl分别为
3.27mg/kg和233mg/kg,由此可以得知士的宁的安全性很低，如果能除去马钱子总碱中的部分士的宁，则既能降低其毒性，又能保留其原有的抗炎镇痛的药理活性，提高临床用药的安全性。因此，现代研究中需要一种提纯高纯度马钱子碱的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度马钱子碱的提取分离纯化方法，主要是利用马钱子碱的特性及马钱子碱和士的宁的不同性质来提取分离纯化。本发明是通过以下技术方案实现的:(I)马钱子总碱的提取:可选用酸水提取-有机溶剂萃取法、醇提取-有机溶剂萃取法、碱化-有机溶剂提取法中的一种方法得到马钱子总碱，其中有机溶剂是指甲苯、氯仿、乙酸乙酯中的一种；(2)马钱子碱粗品的制备:可选用溶剂提取法(溶剂是指甲醇、水、碱水、乙酸乙酯溶液中的一种，萃取溶 剂是指甲苯、氯仿、乙酸乙酯中的一种)、柱层析法、盐酸盐-硫酸盐分步结晶法中的一种。(3)马钱子碱的纯化:可选用盐酸盐-硫酸盐分步结晶法、柱层析法中的一种。
具体来说，当步骤(2)采取溶剂提取法时，步骤(3)采取盐酸盐-硫酸盐分步结晶法、柱层析法中的一种；当步骤⑵采取柱层析法时，步骤(3)采取盐酸盐-硫酸盐分步结晶法；当步骤(2)采取盐酸盐-硫酸盐分步结晶法时，步骤(3)采取柱层析法。上述步骤(I)、步骤(2)、步骤(3)中的方法任意组合均可制备得到纯度90%以上的马钱子碱，包括可得到纯度98%以上的马钱子碱单体。下面对其所述及的提取、分离、纯化的方法的具体步骤说明如下:1、酸水提取-有机溶剂萃取法:取马钱子粉碎成粗粉，加酸水提取，合并提取液，过滤，浓缩，碱化后加有机溶剂萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂，干燥，粉碎，即得马钱子总碱；酸水提取-有机溶剂萃取法中的酸液是指0.5mol/L-5mol/L的盐酸、0.5mol/L-2mol/L的硫酸、0.5mol/L-5mol/L盐酸乙醇溶液、0.5mol/L_2mol/L硫酸乙醇溶液中的一种；酸液用量为5-12倍量， 加热回流次数为1-3次，每次0.5-2小时；提取方法为渗漉法，回流法、搅拌法中的一种，优选的方案是酸液是指lmol/L的盐酸；加热回流法；酸液用量10倍量；加热回流2次，每次1.5小时。马钱子粗粉经酸液提取过滤后，滤液调整pH值至10-11 ；萃取溶剂是指甲苯、氯仿、乙酸乙酯中的一种，优选为乙酸乙酯。其中乙酸乙酯的用量为0.5-4倍量，萃取次数为2-6次；优选I倍量，萃取4次。2、醇提取-有机溶剂萃取法:取马钱子粉碎成粗粉，加乙醇(50 % -95 %乙醇)提取(回流、渗漉、搅拌)，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，调整PH值至10-11，碱化后的溶液用有机溶剂(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱；其中优选50%乙醇，萃取溶剂优选乙酸乙酯。3、碱化-有机溶剂提取法:取马钱子粉碎成粗粉，加碱液湿润药材粉末，再用有机溶剂(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)提取，合并提取液，减压回收有机溶剂(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱。其中，碱液是指氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、稀氨水溶液中的一种。优选氨水碱化。提取溶剂优选氯仿或乙酸乙酯。4、溶剂提取法:马钱子总碱加溶剂溶解提取，提取液过滤后依据提取溶剂进一步处理(如为碱水提取液，再以有机溶剂萃取，合并萃取液)，减压回收有机溶剂，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子碱粗品(马钱子碱含量> 80% )；其中提取马钱子总碱的溶剂是指甲醇、水、碱水、乙酸乙酯溶液中的一种；优选碱水溶液，碱水溶液可用氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、稀氨水溶液中的一种或几种；优选氨水溶液；萃取溶剂是指甲苯、氯仿、乙酸乙酯中的一种，优选为乙酸乙酯。其中乙酸乙酯的用量为0.5-4倍量，萃取次数为2-6次；优选I倍量，萃取4次。5、柱层析法:马钱子总碱或马钱子碱粗品溶于适量溶剂，上大孔吸附树脂柱吸附，收集洗脱液，减压浓缩，蒸干，即得马钱子碱粗品或纯度高达90%以上马钱子碱；其中大孔吸附树脂柱可以用阳离子交换树脂柱或硅胶柱代替。
6、盐酸盐-硫酸盐分步结晶法:马钱子总碱或马钱子碱粗品加盐酸溶液，放置，使士的宁形成结晶，过滤，滤液碱化后加入硫酸使之形成马钱子碱硫酸盐，通过重结晶法纯化即可得到马钱子碱粗品或纯度高达90%以上的马钱子碱。盐酸盐-硫酸盐分步结晶法中马钱子总碱或马钱子碱粗品可以根据需要考虑加入有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等溶解后通过重结晶步骤进行精制。下面就其方法进行列举，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的举例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。方法一:(I)酸水提取-有机溶剂萃取法；(2)溶剂提取法；(3)盐酸盐-硫酸盐分
步结晶法。方法二: (I)醇提取-有机溶剂萃取法；(2)溶剂提取法；(3)盐酸盐-硫酸盐分步
结晶法。方法三:(I)碱化-有机溶剂提取法；(2)溶剂提取法；(3)盐酸盐-硫酸盐分步结晶法。方法四:(1)酸水提取-有机溶剂萃取法；(2)柱层析法；(3)盐酸盐-硫酸盐分步
结晶法。方法五:(I) 醇提取-有机溶剂萃取法；(2)柱层析法；(3)盐酸盐-硫酸盐分步结晶法。方法六:(I)碱化-有机溶剂提取法；(2)柱层析法；(3)盐酸盐-硫酸盐分步结晶法。方法七:(I)酸水提取-有机溶剂提取法；(2)溶剂提取法；(3)柱层析法。方法八:(I)醇提取-有机溶剂萃取法；(2)溶剂提取法；(3)柱层析法。方法九:⑴碱化-有机溶剂提取法；⑵溶剂提取法；(3)柱层析法。方法十:(1)酸水提取-有机溶剂萃取法；(2)盐酸盐-硫酸盐分步结晶法；(3)柱层析法。方法^^一: (I)醇提取-有机溶剂萃取法；(2)盐酸盐-硫酸盐分步结晶法；(3)柱层析法。方法十二: (I)碱化-有机溶剂提取法；(2)盐酸盐-硫酸盐分步结晶法；(3)柱层析法。通过以上方法制得的马钱子碱中的马钱子碱纯度> 90%。本发明药物的活性成分可以加入药剂学上可接受的辅料按常规工艺制备成所需制剂。如可以制成常用的片剂(分散片、泡腾片、口腔崩解片、含片、咀嚼片、泡腾片)、胶囊剂(硬胶囊、软胶囊剂)、颗粒剂、丸剂(滴丸剂)、散剂等固体制剂形式的口服药物，也可以制成糖浆、口服液等液体制剂形式的口服药物；还可以制成膏剂、凝胶剂、软膏剂、巴布剂、贴膏剂、搽剂、洗剂、涂膜剂等外用制剂形式的外用药物。因此，该药物组合物中除有效成分夕卜，还可以含有药学上可以接受的辅料。这里所述的辅料，可以根据不同的制剂有所不同，如在片剂、胶囊剂、颗粒剂等固体制剂中常用的稀释剂、崩解剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、填充剂等；在糖浆、口服液等液体制剂形式中常用的表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂、助流剂等；在凝胶剂、软膏剂等外用制剂形式中常用的药用油性基质、水性基质、防腐剂、抗氧齐 、保湿剂、透皮吸收促进剂、表面活性剂等。其常用辅料如淀粉、乳糖、糊精、糖粉、微晶纤维素、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙、改良淀粉、山梨醇、聚乙烯吡咯酮、重质碳酸镁、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲淀粉钠、羟丙基纤维素、聚维酮Κ30、白陶土、预胶化淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、甜叶菊苷、甜菜碱、阿司帕坦、甘草甜素、糖精钠、枸橼酸、碳酸氢钠、碳酸钠、卡拉胶、琼脂、明胶、海藻酸钠、黄原胶、瓜耳豆胶、西黄耆胶、阿拉伯胶、槐豆胶、刺梧桐胶、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、聚丙烯酰胺、交联型聚丙烯酸钠、聚乙烯醇、卡波姆、山梨酸、山梨酸钾、羟苯乙酯、苯甲醇、尼泊金、硫柳汞、二甲基亚砜、氮酮、三乙醇胺、氢氧化钠、甘油、丙二醇、ΒΗΤ、ΒΗΑ、十二烷基硫酸钠、吐温类、司盘类等。马钱子为马钱科植物马钱(Strychnos nux-vomica L.)的干燥成熟种子经炮制所得制马钱子，具有通络止痛、消肿散结的功效，临床用于治疗风湿顽痹、麻木瘫痪、跌打损伤和痈疽肿痛等疾病。马钱子主要活性成分为总生物碱，其中生物碱成分中马钱子碱具有较好的抗炎镇痛的药理活性，是马钱子的主要有效成分，而另一含量较高的士的宁是强毒性成分，同时为无效成分，所以在提取过程中需要提高马钱子碱的含量，降低士的宁的含量。本发明人在前期的有效部位药效筛选试验(弗氏完全佐剂致大鼠足跖急性肿胀及痛反应指数的试验)的结果表明，实验发现A组(马钱子碱含量90% ) QSmg.kg—lB组(马钱子碱:士的宁=2: I) (25mg.kg-1)和阳性药(扶他林)均可抑制由FCA引起的急性足跖肿胀和屈关节疼痛，而C组(马钱子碱:士的宁=I: 2) (25mg.kg-1)山组(士的宁含量90% ) (25mg.kg-1)对其效果都不明显，说明士的宁是抗炎、镇痛的无效成分和主要毒性成分，马钱子碱是抗炎、镇痛的主要有效成分。该部分详细试验记载在本发明人于2011年9月30日提交的申请号为201110294731.8的 说明书中，在此不再重复描述。所以本发明是在前期研究的基础上，进一步提取高纯度马钱子碱，使马钱子碱含量达到90%以上，甚至得到马钱子碱含量98%以上的单体。本发明人在申请号分别为201110294731.8,201110300527.2,201110297528.6的三个发明技术方案的基础上进一步深入研究，其中提取工艺的参数、分离工艺的参数在申请号分别为201110294731.8、201110300527.2,201110297528.6的发明内容中均有记载，在此不再重复描述。以下对上述方法制得的马钱子碱进行鉴定和含量测定一、马钱子碱单体的结构鉴定将本发明中制备的马钱子碱单体与法定的马钱子碱对照品进行对比鉴定，证明两者完全是相同的化合物即可:1、样品及来源:马钱子喊对照品:购于中国药品生物制品检定所；马钱子碱供试品:由上述十二种方法制备得到；2、结构确证项目:(I)采用熔点测定仪、热重(TGA)或差热分析(DSC)，确定本发明中马钱子碱的熔点及熔程；(2)用红外吸收光谱(溴化钾压片法)，分析其特征功能团，为确证结构提供依据；
(3)采用粉晶X-射线衍射谱确定其晶型；(4)用高分辩率质谱，确定其分子量；(5)采用核磁共振氢谱、碳谱(200MHz以上高分辨，lH-NMR、13C-NMR、H-Hcosy,HMBC, HSQC等)，确定其C、H、O、N等原子数量及立体结构；利用上述信息，综合解析，确定本品为马钱子碱。二、马钱子碱单体的鉴别1、薄层层析鉴别:参照《中国药典》马钱子项下，取马钱子碱供试品溶于氯仿制成2mg/ml供试液，另取马钱子碱对照品，制成同等浓度的对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液(4: 5: 0.6: 0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。2、红外光谱:马钱子碱供试品的红外光谱图与马钱子碱对照品一致。三、马钱子碱的含量测定1、测定方法以中国药品生物制品检定所的马钱子碱为标准对照品，建立马钱子碱的HPLC-DAD检测方法，并采用LC-MS方法验证峰纯度，采用标准曲线法测量马钱子碱的含量。2、测定结果如下表:
权利要求
1.一种马钱子总碱的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤如下: (1)酸水提取-有机溶剂萃取法:取马钱子粉碎成粗粉，加酸水提取，合并提取液，过滤，浓缩，碱化后加有机溶剂萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂，干燥，粉碎，即得马钱子总喊； (2)溶剂提取法:步骤(I)中得到的马钱子总碱加溶剂溶解提取，提取液过滤，滤液加有机溶剂萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子碱粗品; (3)盐酸盐-硫酸盐分步结晶法:步骤(2)中得到的马钱子碱粗品加盐酸溶液，放置，使士的宁形成结晶，过滤，滤液碱化后再加入硫酸使之形成马钱子碱硫酸盐，通过重结晶法纯化即可得到马钱子碱。
2.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(I)中的酸水是指0.5mol/L-5mol/L 的盐酸、0.5mol/L_2mol/L 的硫酸、0.5mol/L_5mol/L 盐酸乙醇溶液、0.5mol/L_2mol/L硫酸乙醇溶液中的一种。
3.根据权利要求2所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(I)中的酸液是指Imo I/L的盐酸。
4.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(I)中酸液用量为5-12倍量，加热回流次数为1-3次，每次0.5-2小时。
5.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中提取马钱子总碱粗品的溶剂是指甲醇、水、碱水溶液中的一种。
6.根据权利要求5所述的提取分离纯化方 法，其特征在于，步骤(2)中提取马钱子总碱粗品的溶剂是指碱水溶液。
7.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(I)的酸水提取-有机溶剂萃取法用醇提取-有机溶剂萃取法代替，具体是指:取马钱子粉碎成粗粉，加乙醇回流提取，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加有机溶剂萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱。
8.根据权利要求1或7所述的提取分离纯化方法，其特征在于，所述的有机溶剂是指甲苯、氯仿、乙酸乙酯中的一种。
9.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(I)的酸水提取-有机溶剂萃取法用碱化-有机溶剂提取法代替，具体是指:取马钱子粉碎成粗粉，加碱液湿润药材粉末，再用有机溶剂提取，合并提取液，减压回收有机溶剂，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱。
10.根据权利要求9所述的提取分离纯化方法，其特征在于，所述的碱液是指氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、稀氨水溶液中的一种。
11.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)的溶剂提取法用柱层析法代替，具体是指:步骤(I)中得到的马钱子总碱粗品溶于适量溶剂，上大孔吸附树脂柱吸附，收集洗脱液，减压浓缩，蒸干，即得马钱子碱粗品。
12.根据权利要求11所述的提取分离纯化方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂柱用阳离子交换树脂柱或硅胶柱代替。
13.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)的溶剂提取法用盐酸盐-硫酸盐分步结晶法代替。
14.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)采取溶剂提取法时，步骤(3)采取盐酸盐-硫酸盐分步结晶法、柱层析法中的一种。
15.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)采取柱层析法时，步骤(3)采取盐酸盐-硫酸盐分步结晶法。
16.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)采取盐酸盐-硫酸盐分步结晶法时，步骤(3)采取柱层析法。
17.根据权利要求1或13或14或15或16所述的提取分离纯化方法，其特征在于，盐酸盐-硫酸盐分步结晶法中马钱子总碱或马钱子碱粗品加入有机溶剂甲醇、乙醇、丙酮中的一种溶解后通过重结晶步骤进行精制。
18.根据权利要求1或7或9或11或13或14或15或16所述的提取分离纯化方法，其特征在于，制得的马钱子碱纯度> 90%。
19.根据权利要求1或7或9或11或13或14或15或16所述的一种马钱子总碱的提取分离纯化方法，其特征在于，将所制得的马钱子碱加入适量辅料按常规工艺制成药剂学上可接受 的制剂。
全文摘要
本发明公开了一种马钱子总碱的提取分离纯化方法，属于药品的技术领域。该方法包括但不限于将马钱子粗粉经酸水提取-有机溶剂萃取法或碱化-有机溶剂提取法或醇提取-有机溶剂萃取法处理后得到马钱子总碱，总碱经过溶剂-分步提取法或柱层析法或盐酸盐-硫酸盐分步结晶法进行纯化，再经过盐酸盐-硫酸盐分步结晶法或柱层析法等步骤制备得到纯度90％以上的马钱子碱。
文档编号C07D491/22GK103159774SQ20111040843
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者胡杰, 姜志宏, 王静蓉 申请人:北京因科瑞斯医药科技有限公司