液体阳离子交换剂的制作方法

液体阳离子交换剂的制作方法
【专利摘要】本申请涉及从水溶液中除去具有一个或多个正电荷的有机化合物的方法，包括步骤a)提供包含有机化合物的水溶液和包含液体阳离子交换剂的疏水性有机溶液，其中所述液体阳离子交换剂是疏水性的，且其中所述液体阳离子交换剂具有一个或多个负电荷和负的总电荷，b)使所述水溶液和所述有机溶液接触，和c)从所述水溶液中分离出所述有机溶液。
【专利说明】液体阳离子交换剂
[0001 ] 本申请涉及从水溶液中除去具有一个或多个正电荷的有机化合物的方法，其包含步骤a)提供含有有机化合物的水溶液和包含液体阳离子交换剂的疏水性有机溶液，其中所述液体阳离子交换剂是疏水性的且其中所述液体阳离子交换剂具有一个或多个负电荷和负的总电荷，b)使所述水溶液与所述有机溶液接触，和c)从所述水溶液中分离出所述有机溶液，其中所述液体阳离子交换剂是脂肪酸，且其中所述有机化合物具有至少两个氨基并且没有带负电的官能团，以及涉及相应的反应混合物。
[0002]由再生原料出发以生物技术生产精细化学品(其传统上由化石燃料合成)时的根本问题在于将最初获得的通常为存在于大体积水相中的产物转移到有机相中。进行这种转移一方面由此以浓缩制成的中间体或最终产物和任选以使得在随后的反应步骤中的合成加工能够在有机溶液中进行，另一方面以通过去除所需产物改进水相中的反应收率或使该反应能够完全在工业上有意义的范围内进行。从大体积的水溶液中直接热浓缩通常以低浓度存在的产物通常是不合适的。
[0003]化合物在包含不混溶的亲水性水相和疏水性有机相的两相体系中的分配决定性地取决于各化合物的物理化学性质。具有高比例的未取代烃或仅由未取代烃构成的化合物主要富集在疏水相中，而具有高比例极性基团，如含杂原子的官能团的化合物，且非常特别是带电荷的化合物主要或几乎仅存在于水相中，这使得转移到有机相中变得困难。
[0004]通常借助分配系数，例如根据能斯特方程
α _ c 相 i/c 相27
描述在达到平衡后化合物在所述两相体系中的分配。一种具体的分配系数是Kot，也称作P-值，其表征化合物在辛醇相与水相之间的分配平衡:
Kow = P = c 辛醇/C 水。
[0005]工业上非常需要的带正电荷的有机化合物的一个实例是12-氨基月桂酸(ALS)及其衍生物，特别是甲酯(ALSME)。ALS是聚合物生产中的重要原材料，例如用于生产管道系统和尼龙。传统上，ALS由化石原材料开始以具有低收率的工艺经由十二内酰胺来制备，其通过三聚化丁二烯、随后氢化形成环十二烷、随后氧化成环十二酮、与羟基月桂酸甘油酯(Hydroxylaurin)反应并随后进行贝克曼重排来合成。在DE10200710060705中描述了 ALS或ALSME的一种有前途的生物技术生产途径。
[0006]现有技术教导了通过使包含生物制剂的水性反应混合物与包含有机溶剂的有机相接触获得带正电荷的有机化合物。因此，例如，DE10200710060705描述了通过用乙酸乙酯摇振从水性反应混合物中获得产物ALSME。Asano等人(2008)公开了用甲苯从包含ALS合成酶的水性反应溶液中萃取ALS。
[0007]本发明的目的因此是开发从水性反应混合物中除去具有至少一个正电荷的带正电的有机化合物的方法，其中期望的是尽可能有利的反应混合物和用作萃取剂的疏水性有机相之间分配平衡的位置，即该分配平衡应尽可能远地位于疏水性有机相侧。
[0008]本发明的另一目的是开发使用疏水性有机相作为萃取剂从包含生物制剂的水溶液中除去具有至少一个正电荷的有机化合物的方法，其中分配平衡尽可能远地位于疏水性有机相侧。
[0009]本发明的另一目的是开发使用疏水性有机溶液作为萃取剂从水溶液中除去具有至少一个正电荷的有机化合物的方法，其尽可能少地不利影响和/或减慢生物技术相关的微生物，特别是大肠杆菌的生长和/或因此尽可能少地减少可分化和/或可存活的和/或呼吸活性细胞的数量。
[0010]最后，本发明的目的是找到使用疏水性有机相作为萃取剂从包含生物制剂的水溶液中除去具有至少一个正电荷的有机化合物的方法，其中考虑到总收率或更快的进程或在连续工艺的情况下，尽可能长的生物制剂可用性，整体优化对于基于生物技术的合成方法的收率、总转化率和快速可完成性而言决定性的性质，特别是有机相对生物制剂的毒性和该化合物在有机萃取剂中的吸收，特别是对于所述具有至少一个正电荷的有机化合物是在生物制剂的催化活性参与下合成的该合成方法的产物或中间体的情况而言。
[0011]通过本申请的主题，和特别是也通过所附独立权利要求的主题实现这些和其它目的，其中由从属权利要求得到实施方案。
[0012]第一方面通过从水溶液中除去具有一个或多个正电荷的有机化合物的方法解决作为本发明的基础的问题，所述方法包括下列步骤
a)提供含有有机化合物的水溶液和包含液体阳离子交换剂的疏水性有机溶液，
其中所述液体阳离子交换剂是疏水性的，
b)使所述水溶液和所述有机溶液接触,和
c)从所述水溶液中分离出所述有机溶液，
其中所述液体阳离子交换剂是脂肪酸，
且其中所述有机化合物具有至少两个氨基并且没有带负电的官能团。
[0013]在本发明的第一方面的第一实施方案中，步骤b)中的温度为28至70，优选30至37。。。
[0014]在本发明的第一方面的第二实施方案(其也是本发明的第一实施方案的一个实施方案)中，步骤b)中的pH-值为6至8，优选6.2至7.2。
[0015]在本发明的第一方面的第三实施方案(其也是本发明的第一至第二实施方案的一个实施方案)中，通过其中所述有机化合物是式H2N- (CH2) ,-NH2且X是I至20，优选6至10的化合物的方法解决该问题。
[0016]在本发明的第一方面的第四实施方案(其也是本发明的第一至第三实施方案的一个实施方案)中，通过其中所述有机二胺是具有至少两个氨基的环状糖，优选是二氨基异艾杜糖醇(i so i di to I)和二氨基异山梨醇的方法解决该问题。
[0017]在本发明的第一方面的第五实施方案(其也是本发明的第一至第四实施方案的一个实施方案)中，通过其中液体阳离子交换剂与有机化合物的物质的量的比为至少I的方法解决该问题。
[0018]在本发明的第一方面的第六实施方案(其也是本发明的第一至第五实施方案的一个实施方案)中，通过其中有机溶液与水溶液的体积比为1:10至10:1的方法解决该问题。
[0019]在本发明的第一方面的第七实施方案(其也是本发明的第一至第六实施方案的一个实施方案)中，通过其中所述液体阳离子交换剂是具有多于12个，优选具有14至22个，还更优选16至18个碳原子的脂肪酸的方法解决该问题。[0020]在本发明的第一方面的第八实施方案(其也是本发明的第一至第七实施方案的一个实施方案)中，通过其中所述液体阳离子交换剂是不饱和脂肪酸，优选油酸或芥酸的方法解决该问题。
[0021]在本发明的第一方面的第九实施方案(其也是本发明的第一至第七实施方案的一个实施方案)中，通过其中所述水溶液此外包含具有催化活性的生物制剂的方法解决该问题。
[0022]在本发明的第一方面的第十实施方案(其也是本发明的第一至第九实施方案的一个实施方案)中，通过其中所述生物制剂是细胞，优选是细菌细胞的方法解决该问题。
[0023]在本发明的第一方面的第十一实施方案(其也是本发明的第一至第十实施方案的一个实施方案)中，通过其中所述有机化合物是对细胞有毒的有机化合物的方法解决该问题。
[0024]在本发明的第一方面的第十二实施方案(其也是本发明的第一至第十一实施方案的一个实施方案)中，通过其中所述有机溶液此外包含至少一种有机溶剂，优选脂肪酸和/或脂肪酸酯的方法解决该问题。
[0025]在第二方面中通过包含水溶液和疏水性有机溶液的反应混合物实现作为本发明基础的目的，
其中所述疏水性有机溶液包含脂肪酸，更优选具有多于12个或14至22个或16至18个碳原子的脂肪酸，还更优选不饱和脂肪酸作为液体阳离子交换剂，
且其中所述水溶液包含具有至少两个氨基并且没有带负电的官能团的有机化合物。
[0026]在本发明的第二方面的第一实施方案中，通过其中所述水溶液此外包含具有催化活性的完整细胞，优选细菌细胞，更优选大肠杆菌的反应混合物解决该问题。
[0027]在本发明的第二方面的第二实施方案(其也是本发明的第一实施方案的一个实施方案)中，通过根据权利要求14至15之一的反应混合物解决该问题，其中所述有机化合物是式H2N-(CH2)x-NH2的化合物且X为I至20，优选6至10。
[0028]在本发明的第二方面的第三实施方案(其也是本发明的第一至第二实施方案的一个实施方案)中，通过其中所述有机二胺是具有至少两个氨基的环状糖，优选是二氨基异艾杜糖醇和二氨基异山梨醇的反应混合物解决该问题。
[0029]在第三方面中通过从水溶液中除去具有一个或多个正电荷的有机化合物的方法实现作为本发明的基础的目的，其包含步骤:
a)提供含有有机化合物的水溶液和包含液体阳离子交换剂的疏水性有机溶液，
其中所述液体阳离子交换剂是疏水性的，
且其中所述液体阳离子交换剂具有一个或多个负电荷和总负电荷，
b)使所述水溶液和所述有机溶液接触,和
c)从所述水溶液中分离出所述有机溶液。
[0030]在本发明的第三方面的一个实施方案(其也是本发明的第一实施方案的一个实施方案)中，该方法包含步骤:
d)后处理所述有机溶液，优选通过将所述有机化合物反萃到另一水溶液中。
[0031]在本发明的第三方面的第二实施方案(其也是本发明的第一实施方案的一个实施方案)中，根据本发明的方法的步骤b)中的温度为28至70°C，优选30至37°C。[0032]在本发明的第三方面的第三实施方案(其也是本发明的第一至第二实施方案的一个实施方案)中，根据本发明的方法的步骤b)中的pH-值为3至8，优选6至8，特别优选6.2 至 7.2。
[0033]在本发明的第三方面的第四实施方案(其也是本发明的第一至第三实施方案的一个实施方案)中，在该方法中的液体阳离子交换剂与有机化合物的物质的量的比为至少I。
[0034]在本发明的第三方面的第五实施方案(其也是本发明的第一至第四实施方案的一个实施方案)中，有机溶液与水溶液的体积比为1:10至10:1。
[0035]在本发明的第三方面的第六实施方案(其也是本发明的第一至第五实施方案的一个实施方案)中，所述有机化合物具有至少一个带正电荷的式(I)的取代基
-N+R2R3R4(I)
或者，如果选自R2、R3和R4的至少一个取代基是氢，则为其非质子化形式，
其中R2、R3和R4彼此独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、苄基、羟基、取代或未取代的和/或直链或支链或环状的烷基或烯基。
[0036]在本发明的第三方面的第七实施方案(其也是本发明的第一至第六实施方案的一个实施方案)中，所述有机化合物具有式(II)
Z-A- N+R2R3R4(II)
或者，如果选自R2、R3和R4的至少一个取代基是氢，则为其非质子化形式，
其中R2、R3和R4彼此独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、苄基、羟基、取代或未取代的和/或直链或支链或环状的烷基或烯基，
其中A是包含至少三个碳原子的烃链，优选是未取代的烯基，
且其中Z选自-C00H、- COOR5, - C0H、- CH2OH且包括其非质子化形式，
其中R5选自氢、甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、苄基、羟基、取代或未取代的和/或直链或支链或环状的烷基或烯基。
[0037]在本发明的第三方面的第八实施方案(其也是本发明的第一至第七实施方案的一个实施方案)中，所述有机化合物具有式III
NH3 a-COOR1(III)，
或其非质子化形式，其中R1是氢、甲基或乙基且A是具有至少三个碳原子的未取代的
直链亚烷基。
[0038]在本发明的第三方面的第九实施方案(其也是本发明的第一至第八实施方案的一个实施方案)中，所述液体阳离子交换剂具有至少一个含有至少六个碳原子的烷基或烯基以及包含选自-C00H、- OSO2H, - OPO(OH)2-和-OPO(OH)O-及其非质子化形式的端位取代基。
[0039]在本发明的第三方面的第十实施方案(其也是本发明的第一至第九实施方案的一个实施方案)中，所述液体阳离子交换剂是不饱和脂肪酸，优选油酸。
[0040]在本发明的第三方面的第十一实施方案(其也是本发明的第一至第十实施方案的一个实施方案)中，所述水溶液此外包含具有催化活性的生物制剂。
[0041]在本发明的第三方面的第十二实施方案(其也是本发明的第一至第十一实施方案的一个实施方案)中，所述生物制剂是细胞，优选细菌细胞。
[0042]在本发明的第三方面的第十四实施方案(其也是本发明的第一至第十二实施方案的一个实施方案)中，所述有机化合物的存在对催化活性具有不利作用。
[0043]在本发明的第三方面的第十五实施方案(其也是本发明的第一至第十三实施方案的一个实施方案)中，所述有机溶液此外包含至少一种有机溶剂，优选脂肪酸和/或脂肪酸酯。
[0044]在本发明的第三方面的第十六实施方案(其也是本发明的第一至第十四实施方案的一个实施方案)中，所述有机溶液包含20至80体积％，优选25至75体积％的油酸作为液体阳离子交换剂并包含月桂酸甲酯作为溶剂，且所述有机化合物是12-氨基月桂酸甲酯，且在所述水溶液中存在具有参与12-氨基月桂酸甲酯合成的催化活性的细菌细胞。
[0045]在本发明的第三方面的第十七实施方案(其也是本发明的第一至第十五实施方案的一个实施方案)中，所述有机化合物是具有至少一个氨基，优选具有至少两个氨基的环状糖。
[0046]在第四方面中，通过包含含生物制剂的水溶液和含液体阳离子交换剂的疏水性有机溶液的生物反应器解决作为本发明的基础的目的。在本发明的一个优选实施方案中，如本文所用的术语“生物反应器”被理解为是指在其中可在受控条件下培养生物技术上有用的微生物和/或可用于生物技术方法，优选用于合成有机化合物的所有容器。
[0047]在第四方面的第一实施方案(其也是本发明的第三方面的第一实施方案的一个实施方案)中，所述液体阳离子交换剂是脂肪酸，优选油酸。
[0048]在第四方面的第二实施方案(其也是本发明的第三方面的第一实施方案的一个实施方案)中，所述疏水性有机溶液此外包含脂肪酸酯，优选月桂酸甲酯。
[0049]在第四方面的第三实施方案(其也是本发明的第二方面的第一至第二实施方案的一个实施方案)中，所述疏水性有机溶液包含油酸作为阳离子交换剂并包含25至75体积％的月桂酸甲酯作为溶剂。
[0050]在第四方面的第四实施方案(其也是本发明的第一至第三实施方案的一个实施方案)中，所述有机化合物是根据本发明的第一方面的实施方案之一的化合物。
[0051]在第五方面中，通过制备具有一个或多个正电荷的有机化合物的方法实现作为本发明基础的目的，其中所述有机化合物对细胞而言是有毒的，所述方法包括在包含液体阳离子交换剂和任选有机溶剂的疏水性有机溶液存在下，在水溶液中，培养参与有机化合物合成的细胞，优选催化该合成的至少一个步骤的细胞。
[0052]在本发明的第五方面的第一实施方案中，所述有机化合物是12-氨基月桂酸或12-氨基月桂酸甲酯，所述有机溶剂是月桂酸甲酯。
[0053]本发明的发明人已经发现，如果这种有机溶液包含液体阳离子交换剂，则可以令人惊讶地提高将具有一个或多个正电荷的有机化合物从水溶液移除到疏水性有机溶液中的效率。不希望与任何理论相关联，但本发明的发明人推测，所述液体阳离子交换剂的一个或多个负电荷与所述有机化合物的一个或多个正电荷以离子方式相互作用，且这种相互作用导致掩蔽至少一个正电荷，这提高了有机相中的溶解度。
[0054]在一个优选实施方案中，本文所用的术语“液体阳离子交换剂”是指可溶于疏水性有机溶剂中的化合物，其由于一个或多个负的永久电荷而能与至少一个阳离子形成离子相互作用。通常，液体阳离子交换剂包含至少一个饱和或不饱和的烃链，其可以是直链或支链，以及带负电的基团，例如羧基。在一个优选实施方案中，所述液体离子交换剂是脂肪酸，在一个更优选的实施方案中是不饱和脂肪酸，例如油酸。在一个优选实施方案中，该液体离子交换剂是二(2-乙基己基)磷酸(也被称作DEHPA或D2EHPA)。
[0055]在一个优选实施方案中，该液体离子交换剂不仅具有负的总电荷，而且完全没有正电荷。在一个优选实施方案中，术语离子交换剂或其它分子的“总电荷”，如本文中所使用的，被理解为是指与该分子共价键合的所有官能团的电荷总和。例如，月桂酸具有负电荷作为总电荷，不取决于水溶液中存在的其它分子或抗衡离子的存在。
[0056]在本发明的一个优选实施方案中，本文所用的术语“接触”被理解为是指两相直接且尤其没有物理屏障，如膜的间隔而彼此相对暴露。在最简单的情况中通过将两相置于同一容器中并以合适的方式例如通过搅拌将它们彼此混合来进行所述接触。
[0057]在一个优选实施方案中，所述有机化合物具有正的总电荷。在另一优选的实施方案中，所述有机化合物没有负电荷。在一个优选实施方案中，所述有机化合物是ω-氨基羧酸。在一个优选实施方案中，表述“一个或多个”某类电荷是指至少一个相应电荷。
[0058]在一个优选实施方案中，本文所用的术语“具有电荷”是指如此指出的化合物在pHO至14，优选2至12，2至6，8至12，3至10，6至8，最优选在pH 7的水溶液中具有相应电荷。在一个优选实施方案中，其是永久存在的电荷。在另一优选的实施方案中，本文所用的术语“具有电荷”是指相应的官能团或化合物在PH 7主要具有相应电荷，即至少50，更优选90，还更优选99%。在另一优选的实施方案中，氨基(-NH2)在分子中被视为具有正电荷的基团，无论其是以完全质子化形式、部分质子化形式还是完全非质子化形式存在。
[0059]在本发明的一个优选实施方案中，可将术语“包含”按“包括”的意义理解，即非封闭地。在此意义上，包含A的混合物可具有除A外的其它成分。
[0060]在一个优选实施方案中，本文所用的术语“疏水性”被理解为是指一种液体在水相存在下形成与水相清晰分界的其自身的液相的性质。后者可以是连续液相或乳状液。在另一优选的实施方案中，本文所用的术语“疏水性”被理解为是指化合物基本上不溶于水的性质。最后，如本文所用，该术语在另一优选的实施方案中如此理解，即是指如此提及的化合物具有十进对数大于0，更优选大于0.5，还更优选大于I和最优选大于2白勺 P—{IXJ.Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals andPhysical Chemistry, Wiley Series in Solution Chemistry 卷 2, John Wiley & Sons,Chichester, 1997)。
[0061]在本发明的另一实施方案中，所述液体离子交换剂对生物技术相关的微生物没有或仅有适度毒效。本文所用的术语“毒效”在本发明的一个优选实施方案中被理解为是指化合物在与相应的微生物接触时降低它们的生长速率、降低它们的代谢活性、提高它们的能量消耗、降低它们的光学密度或能生长的细胞的数量和/或直接导致它们死亡和溶解的性质。在一个优选实施方案中，在毒性化合物的情况中，在低浓度下，优选在1000，更优选100,还更优选50或25,最优选5 mg/L的浓度下就已实现这些效应的至少一种。本领域技术人员已知许多可常规用于研究毒性的方法。这些包括例如经由O2-电极或微生物样品的对比析出和集落形成单位(cfus)的随后计数测量相应微生物的呼吸。在一个优选实施方案中，“适度毒效”被理解为是指位于生长期的微生物在该化合物存在下进一步生长和/或是代谢活性的，但程度低于在不存在相应化合物的相同条件下培养的对照物的情况，和/或具有延长的停滞期。[0062]水溶液和有机溶液的接触在合适的条件下进行，特别经过足以使所述有机化合物从水相充分转移到有机相中，理想地甚至建立相应平衡的时期。本领域技术人员可以在常规实验范围内确定该时间和条件。
[0063]在一个特别优选的实施方案中，所述具有一个或多个正电荷的有机化合物是端位胺化的脂肪酸，特别优选12-氨基月桂酸或其酯或这两种化合物的混合物。本领域技术人员会认识到，在包含酯酶活性的生物体系存在下，脂肪酸的酯可以部分以相应的酸的形式存在，并且就此而言，这两种化合物在这方面被视为等效。因此，如本文所用，在一个特别优选的实施方案中脂肪酸或脂肪酸衍生物还包括相应的酯，优选甲酯，反之亦然。
[0064]在一个特别优选的实施方案中，本文所用的术语“亚烷基”是式-(CH2)n-的基团，即是具有两个开放的，优选端位的取代基的链烷。这两个取代基可以是例如氨基和羧基。在一个优选实施方案中，η至少为3，还更优选至少为6，还更优选为11。在“取代的亚烷基链”中，至少一个氢原子被非氢原子的取代基或烷基残基，优选非氢原子的原子替代。在一个具体实施方案中，与此相反，本文所用的术语“未取代的亚烷基”是指没有这种取代基的式-(CH2)n -的烃链。
[0065]在本化合物的一个特别优选的实施方案中，所述具有一个或多个正电荷的有机化合物是环状糖。在另一特别优选的实施方案中，这种环状糖具有至少两个氨基。在一个还更优选的实施方案中，所述“环状糖”是选自二氨基-二脱水-二脱氧-己糖醇，特别是2，5- 二氨基-1，4:3, 6- 二脱水-2，5- 二脱氧-D-己糖醇,在最优选实施方案中是它的三种立体异构体:2，5- 二氨基-1，4:3,6- 二脱水-2，5- 二脱氧-D-甘露醇(I)、2，5- 二氨基-1，4:3，6-二脱水-2，5-二脱氧-D-葡萄糖醇(II)和2，5-二氨基-5 1，4:3，6-二脱水-2，5-二脱氧-L-艾杜糖醇(III)的糖，它们在2和5位的手性不同。基于该稠合五元环的椅式，氨基在此可以位于内，内(I)、内，外(II)或外，外(III)位置。
[0066]在本化合物的一个优选实施方案中，使用选自下述的化合物作为溶剂与作为待除去的有机化合物的环状糖结合:煤油(K)，苯甲酸苄酯(B)、月桂酸甲酯(ML)、顺式_9_十八碳烯-1-醇(OD)。
[0067]在一个特别优选的实施方案中，所述有机化合物是DAI(二氨基异艾杜糖醇)或DAS(二氨基异山梨醇)，所述液体阳离子交换剂是不饱和脂肪酸，优选油酸，且所述水相具有至少6.5或7，优选7至10，还更优选7.5至9.5的pH-值。
[0068]在一个特别优选的实施方案中，所述有机化合物是DAI或DAS，所述液体阳离子交换剂是DEHPA，且所述水相具有至少3或至少3.5，优选3至8，优选4至10，还更优选4.5至9，还更优选4.5至7或5至8的pH-值。
[0069]在一个优选实施方案中，为更好地相分离，将通过使水相和疏水相接触形成的混合物作为步骤c)的一部分或在附加步骤中暴露在升高的温度下，以促进相分离。例如，可以在标准压力下将温度提高到50、55、60、65、70、75、80、85、90或95°C以上。
[0070]步骤b)中的温度不仅取决于液体阳离子交换剂的性质，而且，特别对于随着反应进程在水相中发生水溶液与有机溶液的接触的情况而言，还取决于可能的在水相中发生的反应的温度要求。特别对于生物制剂，如活细胞在水相中具有催化活性的情况而言，该温度必须适合保持这种活性。在一个优选实施方案中，步骤b)中的温度为O至100°C，更优选20 至 80°C，28 至 70°C，30 至 37°C，35 至 40°C。[0071]步骤b)中的pH-值必须考虑可能的同时进行的反应的要求，原材料、产物、中间体或试剂的稳定性。在一个优选实施方案中，所述PH-值为3至8，更优选6至8，还更优选
6.2 至 7.2。
[0072]为了将有机化合物尽可能完全地从水相转移到有机相中，需要足量的液体阳离子交换剂。在本发明的一个优选实施方案中，在至少一个步骤中，在连续工艺中在整个反应进程范围合计的液体阳离子交换剂与有机化合物的物质的量的比为至少1，即每分子有机化合物使用至少I分子液体阳离子交换剂。在还更优选的实施方案中，该比率大于2、3、5、10、15或20，优选1.5至3。
[0073]在一个优选实施方案中，阳离子交换剂是否是液体阳离子交换剂取决于其在工艺温度下，优选在37°C下的聚集状态。如果在除阳离子交换剂外还具有其它化合物的有机相中使用该阳离子交换剂，则该混合物的聚集状态是决定性的。如果-任选使用由现有技术已知的常规方法-可以制备在工艺温度下，优选下37°C完全是液体并包含液体阳离子交换剂的混合物，则是足够的。例如，可能需要在比该方法中所用的温度更高的温度下溶解阳离子交换剂并将该混合物冷却至工艺温度。
[0074]有机溶液与水溶液的体积比与阳离子交换剂/有机化合物物质的量的比一起，对高效过程均是重要的。在一个具体实施方案中，其为100:1至1:100，更优选20:1至1:20，还更优选10:1至1:10,4:1至1:4,3:1至1:3或最优选1:2至2:1。
[0075]在本发明的一个优选实施方案中，使用脂肪酸作为液体阳离子交换剂。在本发明的一个优选实施方案中，本文所用的术语“脂肪酸”被理解为是指具有至少6，优选8，还更优选10，最优选12个碳原子的羧酸，优选链烷酸。在一个优选实施方案中，它们是直链脂肪酸，在另一实施方案中是支链脂肪酸。在一个优选实施方案中，它们是饱和脂肪酸。在一个特别优选的实施方案中，它们是不饱和脂肪酸。在另一个优选的实施方案中，其是含有双键，优选在9位的具有至少12个碳原子的直链脂肪酸。在另一个优选的实施方案中，其是单不饱和脂肪酸，其中双键在9位和/或11位。在另一个优选的实施方案中，所述液体阳离子交换剂是选自油酸、棕榈油酸和鳕油酸和二十碳烯酸(Icosensjiure)的不饱和脂肪酸。在最优选的实施方案中，其是油酸。在一个特别优选的实施方案中，其是具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26.27、28、29、30 个碳原子，优选多于12个，还更优选多于14个碳原子，还更优选具有14至28，14至22，最优选16至18个碳原子的脂肪酸。
[0076]在另一个优选的实施方案中，使用不同脂肪酸的混合物作为液体离子交换剂，例如以大豆油或球蓟油形式存在的不同脂肪酸的混合物。在这种情况下，可能还必须通过相应的酯的水解释放所述脂肪酸，这可以通过降低PH-值或本领域技术人员已知为常规程序的类似措施实现。
[0077]在本发明的一个特别优选的实施方案中，使用两种液体阳离子交换剂的组合，优选其中至少一种是脂肪酸。
[0078]本发明的一个特别的优点在于本发明的方法与生物技术方法和其中所用的生物制剂的相容性。在本发明的一个具体实施方案中，本文所用的术语“具有催化活性的生物制齐IJ”被理解为是指在从整个细胞到所分离的分子的所有提纯阶段中由细胞合成的生物催化齐U。在一个优选实施方案中，其是表达具有催化活性的酶的细胞。该细胞可以是原核的，包括古生菌，或真核的，优选选自假单胞菌、棒状杆菌和大肠杆菌。在一个更优选的实施方案中，该制剂是细菌细胞，还更优选是革兰氏阴性细菌细胞，最优选是大肠杆菌。在另一个优选的实施方案中，其是真核细胞，更优选是真菌细胞，还更优选是酵母细胞，最优选是酵母属或假丝酵母属、毕赤酵母属，特别是热带假丝酵母。在具体实施方案中，术语“细胞”在本申请中与术语“微生物”同义并可互换使用。此外，该细胞可以是经分离的细胞或培养物的混合物。
[0079]用作生物制剂的细胞可以是活的，或者可以是其制品，例如是细胞的膜部分或细胞溶质部分或粗提物。
[0080]如果所述生物制剂是在各种提纯阶段中分离的分子，这可以是由细胞产生的所有催化活性分子。在一个特别优选的实施方案中，其是选自肽、多肽、碳水化合物、核酸或其混合形式的分子。在一个还更优选的实施方案中，其是催化有效的多肽。在另一个优选的实施方案中，其是固定化分子。
[0081]合成生物技术方法所需的催化功能是多种多样的。在一个优选实施方案中，本文所用的术语“催化活性”是合成活性，即催化包含形成至少一个新的共价键的化学反应。在另一个优选的实施方案中，其是转运活性，即一个分子将另一分子从一个隔室转运至另一隔室的能力，例如将物质从水性介质经过细胞膜吸收到细胞内部。
[0082]在一个特别优选的实施方案中，所述生物制剂是在液体阳离子交换剂存在下用于催化的活细胞，优选地，以合成具有一个或多个正电荷的有机化合物，所述有机化合物随后或同时借助液体阳离子交换剂被移除进入到疏水性有机相中。
[0083]在一个特别优选的实施方案中，所述有机化合物的存在对催化活性具有不利影响。在一个实施方案中，这会降低存在的活性的量，其可以以酶的较低kMt意义表述。在另一实施方案中，在酶的提高的Km的意义上可涉及具有催化活性的制剂的亲合力。在另一实施方案中，可改变催化活性的特异性，例如以优选使其转化或优选转化非所需底物分子的底物分子的方式。在另一实施方案中，所述有机化合物对作为生物制剂的细胞具有毒效。
[0084]在另一实施方案中，所述有机化合物是降低基本共底物或辅酶的可用性的有机化合物。例如如果所述有机化合物抑制相应的再生反应，则可以是这样的情况。
[0085]除液体阳离子交换剂外，所述疏水性有机相此外可包含疏水性溶剂。这可用于提高液体阳离子交换剂在疏水相中的吸收能力和防止不想要的行为，例如絮凝。在一个优选实施方案中，所述溶剂是在水溶液中进行的反应的原料，最优选是在水溶液中进行的酶催化反应的底物。在一个优选实施方案中，其是脂肪酸酯。在一个特别优选的实施方案中，该溶剂是充当液体阳离子交换剂的脂肪酸的脂肪酸酯，优选甲酯。
[0086]如果存在，疏水性有机相的溶剂的比例在一个优选实施方案中为I至99体积百分t匕(体积％)。在一个优选实施方案中，该溶剂比例为10至90，还更优选20至80，最优选25至75体积％。
[0087]在该方法的最优选实施方案中，该机化合物是如DE10200710060705中所公开的在水相中由重组的大肠杆菌-菌株通过月桂酸甲酯的端位碳原子的逐步氧化制成的12-氨基月桂酸和/或12-氨基月桂酸甲酯，且该疏水相包含25至75%油酸作为液体阳离子交换剂，其溶解在作为反应底物的月桂酸甲酯中。
[0088]在一个优选实施方案中，所述有机化合物是SH2N-(CH2)x-NH2的化合物。在此，x可以取 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，优选I至20，还更优选I至10的值。
[0089]此外通过下列附图和非限制性实施例说明本发明，它们可以揭示本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。
[0090]图1显示用于证实LSME没有毒效的对照实验，其用大肠杆菌W3110-菌株研究并与作为阴性对照的磷酸钾缓冲液(Kpi)进行比较。
[0091]图2以该菌株在不存在液体阳离子交换剂的情况下和存在不同液体阳离子交换剂的情况下在O h、4 h和24 h后可形成的cfus数的形式显示菌株大肠杆菌W3110的存活力。
[0092]图3a显示使用D2EHPA作为液体阳离子交换剂从水相中除去二氨基异艾杜糖醇(DAI)和二氨基异山梨醇(DAS)的结果。
[0093]图3b显示使用油酸作为液体阳离子交换剂从水相中除去DAI和DAS的结果。
[0094]图3c显示不使用液体阳离子交换剂从水相中除去DAI和DAS的结果。
[0095]图4借助大肠杆菌-W3110菌株在ALSME 0.2%、用氨调节的DEHPA( “D2EHPNH32%”)或在存在ALSME 0.2%的DEHPA/LSME混合物(2%/98%) ( “D/L”)存在下的活细胞数的变化显示使用液体阳离子交换剂对毒性的影响。
[0096]图5显示不同液体阳离子交换剂对生产氨基月桂酸甲酯的大肠杆菌菌株的OTR的影响。如实施例5中所述进行该实验。
[0097]图6显示不同液体阳离子交换剂对具有合适基因变异的大肠杆菌菌株产生的氨基月桂酸甲酯收率的影响。如实施例5中所述进行该实验。
[0098]实施例1:研究与液体阳离子交换剂组合使用的溶剂LSME的毒性
用此实验表明LSME对生物技术相关微生物相对较低的毒性，这使LSME成为适用于本发明的方法的有机溶剂。
[0099]在能够进行CFU的测定之前，在板LB (10 g/L酪蛋白的胨、5 g/L酵母提取物、10g/L NaCl)上用大肠杆菌BW3110划线并温育24小时。在第二天晚上，该预先划线的板接种预培养物。这种预培养物具有50毫升LB培养基体积并温育过夜大约16小时。在第二天，将该预培养物用3%葡萄糖(w/v)以0.2的OD6tltl转接种在200毫升M9培养基(Na2HP04 6.79g/L ；KH2P04 3.0 g/L ; NaC I 0.5 g/L ；NH4C1 I g/L; I mL/L 痕量元素溶液，pH 7.4.痕量元素溶液:HCl 37% (= 455.8 g/L) 36.50 g/L ;MnC12*7H20 1.91 g/L ；ZnS04*7H20 1.87g/L ;Na-EDTA*2H20 (Titriplex III) 0.84 g/L ；H3B03 0.30 g/L ;Na2Mo04*2H20 0.25 g/L ;CaC12*2H20 4.70 g/L ;FeS04*7H20 17.80 g/L ;CuCl2*2H20 0.15 g/L)中并温育大约20小时。在温育主培养物后，收获细胞，在5258 g和4°C下离心10分钟并以30的OD6tltl再悬浮在10毫升pH-值7.4的50 mM Kp1-缓冲液(或25 mM HEPES缓冲液pH-值7.4，如果用ALSME进行CFU测定)中。所用的这两种缓冲液都含有5%葡萄糖(w/v)。然后将细菌悬浮液转移到摇瓶中并加入各自的底物溶液。在通过振摇烧瓶进行充分混合后，吸移出悬浮液并置于900毫升预先装入的无菌盐水中。这相当于在时间点h的取样。然后在250转/分钟和30°C下培养该制剂。经22小时测定CFUs。首先在时间点和t22取样。对于某些制剂，添加另一取样时间点tu,且此外,涂上(ausplattieren)另一个额外的稀释系列以使偏差最小化。[0100]OD600为60。将细胞再悬浮在10毫升Kpi缓冲液中，然后在烧瓶中与5毫升LSME98% (w/w)混合。每种制剂涂上一个稀释级。每毫升的CFU数在6小时内保持恒定。在22小时后，可记录到仅30.3%的活细胞计数降低百分比。
[0101]实施例2:与各种液体阳离子交换剂对生物技术相关微生物的毒性相关的对比实验
此实施例表明，相对于其它液体阳离子交换剂如DEHPA以及支链和直链饱和脂肪酸，直链脂肪酸毒性较低。
[0102]首先，在100晕升振荡烧瓶中用相应菌株的低温培养物接种包含20晕升LB培养基的预培养物。该培养物在37°C和在以200转/分钟摇振下培养过夜，并在第二天用于接种相同的主培养物至0.2的0D。主培养物(各30毫升LB培养基)随后在相同条件下进一步温育。在0.4至0.5的OD下，在每种情况下用相同体积(30毫升)的溶剂覆盖主培养物，然后进一步温育。
[0103]为了测定Cfu (集落形成单位)数，在下列实验中取样0.1毫升-样品并在无菌
0.9% NaCl溶液中稀释。将合适的稀释级涂在LB琼脂板上。在34°C下温育过夜后，计数形成的集落并测定cfus。
[0104]实验1:作为液体阳离子交换剂的DE2HPA与饱和脂肪酸之间的毒性比较
将50% DEHPA和月桂酸(15%)——各自溶解在LSME中并负载等摩尔或25摩尔％的ALSME——作为液体阳离子交换剂与大肠杆菌BL21 (DE3)菌株接触，并研究这两种化合物对菌株形成集落的能力的影响，以cfus表述。在初步实验中表明，所用菌株极好耐受月桂酸甲酯-其由于缺乏电荷而不能充当液体阳离子交换剂。
[0105]表1:
【权利要求】
1.从水溶液中除去具有一个或多个正电荷的有机化合物的方法，包括步骤a)提供含有所述有机化合物的水溶液和包含液体阳离子交换剂的疏水性有机溶液，其中所述液体阳离子交换剂是疏水性的，b)使所述水溶液和所述有机溶液接触,和c)从所述水溶液中分离出所述有机溶液，其中所述液体阳离子交换剂是脂肪酸，且其中所述有机化合物具有至少两个氨基并且没有带负电的官能团。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤b)中的温度为28至70，优选30至37°C。
3.根据权利要求1至2之一的方法，其中步骤b)中的pH-值为6至8，优选6.2至7.2。
4.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述有机化合物是式H2N-(CH2)x-NH2的化合物，且X为I至20，优选6至10。
5.根据权利要求1至4之一的方法，其中所述有机二胺是具有至少两个氨基的环状糖，优选是二氨基异艾杜糖醇和二氨基异山梨醇。
6.根据权利要求1至5之一的方法，其中液体阳离子交换剂与有机化合物的物质的量的比为至少I。
7.根据权利要求1至6之一的方法，其中有机溶液与水溶液的体积比为1:10至10:1。
8.根据权利要求1至7之一的方法，其中所述液体阳离子交换剂是具有多于12个，优选具有14至22个，还更优选16至18个碳原子的脂肪酸。
9.根据权利要求1至8之一的方法，其中所述液体阳离子交换剂是不饱和脂肪酸，优选油酸或芥酸。
10.根据权利要求1至9之一的方法，其中所述水溶液此外包含具有催化活性的生物制剂。
11.根据权利要求10的方法，其中所述生物制剂是细胞，优选细菌细胞。
12.根据权利要求10至11之一的方法，其中所述有机化合物是对所述细胞有毒的有机化合物。
13.根据权利要求1至12之一的方法，其中所述有机溶液此外包含至少一种有机溶剂，优选脂肪酸和/或脂肪酸酯。
14.包含水溶液和疏水性有机溶液的反应混合物，其中所述疏水性有机溶液包含脂肪酸，更优选包含具有多于12个或14至22个或16至18个碳原子的脂肪酸，还更优选包含不饱和脂肪酸作为液体阳离子交换剂，且其中所述水溶液包含具有至少两个氨基并且没有带负电的官能团的有机化合物。
15.根据权利要求14的反应混合物，其中所述水溶液此外包含具有至少一种催化活性的完整细胞，优选细菌细胞，更优选是大肠杆菌。
16.根据权利要求14至15之一的反应混合物，其中所述有机化合物是式H2N-(CH2),-NH2的化合物，且X为I至20，优选6至10。
17.根据权利要求14至15之一的反应混合物，其中所述有机二胺是具有至少两个氨基的环状糖，优选是二氨基异艾杜糖醇和二氨基异山梨醇。
【文档编号】C07C227/40GK103459032SQ201180070166
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2011年12月1日 优先权日:2011年2月16日
【发明者】F.埃尔哈特, T.哈斯, M.鲁斯, D.德米科利, M.皮特, A.舒贝尔特, J.C.普费弗, T.塔克, H.黑格, A.普芬尼希, M-D.普日比尔斯基-弗罗伊恩德 申请人:赢创德固赛有限公司