专利名称：人卵透明带蛋白-4的表位最小基序肽及其扩展短肽和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程和免疫学技术领域，具体涉及人卵透明带蛋白-4能被特异单抗识别的表位最小基序肽及其扩展短肽和应用。
背景技术：
除了小鼠,包括人类在内的哺乳动物卵透明带(zona pellcida,ZP)都由四个糖蛋白(分别被命名为ZP1，ZP2，ZP3和ZP4)组成。作为抗生育环节之一，阻断人精卵结合受精从而导致不孕无疑是不会引起争议的最理想途径。因此，40多年来世界上许多实验室一直在开展ZP避孕疫苗的研究。虽然以小鼠和兔等为动物模型的许多研究证实了 ZP或単一 ZP3蛋白抗原主动免疫的抗生育充分有效性，但受试动物都发生卵巣炎、卵泡和卵巢萎缩或卵子发生衰減等病理现象。对人类而言，ZP疫苗这方面的免疫副作用显然是不可接受的。为此，如何克服ZP疫苗的这ー严重缺陷是相关研究人员始终关注的焦点，也获得了ー些重要进展。例如，美国NIH的Dean实验室首先用一单克隆抗体(以下简称单杭)鉴定出小鼠精子受体ZP3蛋白羧基端的一个线性B细胞表位(以下简称表位)，并以其表位化学合成肽作为免疫原获得了不完全的抗生育效果(Millar SE, et al. Vaccination with a syntheticzona pellucida peptide produces long-term contraception in female mice. Science1989; 246: 935-938)。随后发现该表位合成肽在其他一些近交系小鼠品系仍然出现卵巢炎，并证明它是由其长表位肽中的一 ZP特异致病性T细胞表位造成，剔除此T细胞表位的合成肽疫苗则可消除小鼠ZP免疫卵巣炎(Lou YH, et al. A zona pellucida 3peptiae vaccine induces antibodies and reversible infertility without ovarianpathology. J Immunol 1995; 155: 2715-2720)。已知 T 细胞表位通常由 9 30 个氨基酸残基构成，而B细胞表位则由3 8个残基組成，显然通过鉴定B细胞表位最小基序就能排除在ー长表位肽中可能存在的T细胞表位(Bagavant H, et al. Immunogenicityand contraceptive potential of a human zona pellucida J peptide vaccine. Bio丄Reprod 1997; 56: 764-770)。化学合成肽疫苗曾被寄希望能成为疫苗发展史上第三个里程碑。但是，由于受现有线性B细胞表位鉴定方法的限制，各靶蛋白上被鉴定的表位极为有限，因而导致研制的化学合成肽疫苗都难以达到有效的病毒感染或疾病预防或治疗效果，以致至今未产生能应用于人类临床的合成肽疫苗。许多ZP合成肽疫苗研究论文也都提及需要研制多表位肽疫苗，以实现ZP合成肽疫苗抗生育效果的充分有效性。而要实现这样的目标，显然有赖于能更多地鉴定ZP蛋白的表位，特别是它们的最小基序。现在已清楚人ZP4蛋白也能诱导人精子顶体反应和与之结合(Chiu PC, et al. Effects of native human zona pellucida glycoprotein-3 and -4 on acrosome reaction and zona pellucida binding of humanspermatozoa. Biol Reprod 2008;79:869-877)。另外，也已制备了 抗重组人 ZP4 的单抗(Bukovsky A, Gupta SK, et al. Production of monoclonal antibodies againstrecombinant human zona pellucida glycoproteins: utility in immunolocalizationof respective zona proteins in ovarian follicles. J Reprod Tmmunol 2008; 78:102-114)，其中MA-1662 ( (IgG2a)和MA-1671 (IgGl)具有与人卵子的反应性和抑制ZP4 介导人精子顶体反应的特性(Xu WX, et al. Mapping of epitopes relevant forinduction of acrosome reaction on human zona pellucida glycoprotein-4 usingmonoclonal antibodies.论文投稿中)。因此，鉴于今后研制重组ZP多表位肽检测抗原和/或人用避孕疫苗免疫原，以及阐明人ZP4蛋白具有生物学意义功能域的需要，本发明用以上两个单抗鉴定了它们可识别的精细表位氨基酸序列。本发明的技术背景或主要基础是已建立了更方便更经济的线性表位，包括最小基序鉴定的改良生物合成肽法(Xu WX, etal. Minimal motif mapping of a known epitope on numan zona pelluciaa protein-4using a peptide biosynthesis strategy. J Reprod Tmmunol 2009; 81:9—16; Xu WX,et al. Mapping of minimal motifs of B-cell epitopes on human zona pellucidaglycoprotein-3. Clin Dev Tmmunol doi: 10: II55/20I2/831010) 在研制重组多表位肽疫苗方面已有这方面研究报道，如:组合疟原虫7个特异 抗原的 11 个表位月太疫苗(Shi YP, et al. Immunogenicity and in vitro protectiveefficacy of a recombinant multistage Plasmodium ialciparum candidate vaccine.Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 1615 -1620)和组合三个表位的人绒毛膜促性腺没苗石开究(Xu WX, et al. Immunogenic comparison for two different recombinantchimeric peptides (CPI2 and CP22) containing one or two copies of three linearB cell epitopes from -hCG subunit. J Biothech 2011; 151: 15-21)等。但是，就单个靶抗原而言，以上研究受以往线性表位鉴定数的限制，因组合表位数有限而都还难以在线性抗体水平达到合成肽疫苗充分的预防或治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供用两个单抗人卵透明带蛋白-4 (huZP4)单抗(MA-1662和MA-1671)鉴定的两个线性表位的最小基序肽，并提供可用化学合成或与GST载体蛋白融合表达的含所述最小基序肽的扩展短肽(8肽)或长于该短肽(8肽)的抗原；还提供所述最小基序肽、最小基序肽的扩展短肽(8肽)或长于该短肽(8肽)的抗原的应用。本发明提供的人卵透明带蛋白-4 (huZP4)的两个线性表位的最小基序肽，其氨基酸序列分别为SEQ. ID No. I和SEQ. ID No. 2所示，前者记为huZP4147—151，其一字简写氨基酸序列为PARDR (SEQ. ID No. I);后者记为huZP4256_26°，其一字简写氨基酸序列为ENELV (SEQ.ID No. 2)。本发明提供的含上述的最小基序肤的短肤，其氨基酸序列分别为SEQ. ID No. 3和SEQ. ID No. 4所示。记为huZP4-l，其扩展的人ZP4145—152或人ZP4146—153表位8聚肽一字简写的氨基酸序列为SIPARDRL (SEQ. ID No. 3)或IPARDRLP (SEQ. ID No. 4)。在化学合成或融合表达该8肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其他残基替代。本发明提供的含上述的最小基序肤的短肤，其氨基酸序列也可为SEQ. ID No. 5和SEQ. ID No. 6所示。记为huZP4-2，其扩展的人ZP4254—261或人ZP4255—262表位8聚肽一字简写的氨基酸序列为VYENELVA (SEQ. ID No. 5)或YENELVAT (SEQ. ID No. 6)。在化学合成或融合表达该8肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其他残基替代。本发明还提供上述线性表位的最小基序肽在设计研制人用ZP多表位肽避孕疫苗中应用；进ー步还提供含上述最小基序肽的短肽(表位8肽)或其融合蛋白単独或组合用作临床诊断由ZP自身免疫导致妇女不孕病因的血清识别表位标志物的应用。本发明的内容进ー步具体描述如下
1，人ZP4蛋白(曾被先后命名为ZPB和ZPl)编码基因克隆[Harrist JD, et al.しloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs irom a varietyof mammalian species: the ZPA, ZPB and ZPC gene families. DNA Seq 1994; 4:361-393; Skinner SM, et al. Mapping of dominant B cell epitopes of a human zonapellucida protein (ZPl) · Biol Reprod 1999; 61: 1373-1380]由美国国立卫生院细胞和发育生物学实验室提供。用常规PCR方法从huZP4 cDNA克隆中扩增出编码huZP4成熟蛋白N端大片段(去除N端信号肽的氨基酸残基58-234，简称为huZP4N58_234)和C端大片段(去除C端跨膜区的残基227-463，简称为huZP4C227—463 )的cDNAs，然后分别重组插入pSY621表达质粒[沈芸，应康，徐万祥，谢毅大肠杆菌高效表达载体PSY621的构建.复旦学报(自然科学版)2000 ；39 (3) : 313 - 317]，分别转化大肠杆菌后进行热诱导表达，结果在免疫印迹试验中MA-1671单抗识别重组huZP4N蛋白，而MA-1662单抗识别重组huZP4C蛋白(结果未显示)。，先前发明人已构建了专门用于抗原表位扫描作图的短肽生物合成的PXXGST-IM虫本 kXu WX, et al. Minimal motif mapping of a known epitope on humanzona pellucida protein-4 using a peptide biosynthesis strategy. J ReprodImmunol, 81: 9-16，2009)。因此，在鉴定上述两个单抗识别表位氨基酸序列之前，首先分别构建ニ组分别跨越huZP4N和huZP4C全长度相互重叠10个残基的系列18聚短肽(以GST188蛋白为融合表达载体。具体操作步骤外送合成所设计的系列18聚肽并含两端BamHI和Sal I粘性末端的编码DNA正负链片段；DNA正负链片段配对退火后重组插入表达质粒；转化大肠杆菌BL21 (DE3)宿主菌；挑选重组克隆测序验证插入片段DNA序列；以及热诱导表达目的GST188-18肽融合蛋白)。进而实施两个单抗的第一轮识别18聚肽的蛋白印迹鉴定，即将分别含huZP4N的21个18聚肽(编号Pl P21)和含huZP4C的28个18聚肽(编号P22 P49)融合蛋白的各诱导菌总蛋白进行SDS-PAGE，继而电转移到硝酸纤维素膜上，最后用MA-1662和MA-1671单抗完成印迹鉴定。结果MA_1671单抗识别Pll和P12短肽(融合蛋白)，而MA-1662单抗识别P25短肽(融合蛋白)(图未显示)。，按前述系列18聚短肽融合蛋白构建表达步骤，进ー步表达GST188为载体跨越Pll和P12合并长度以及P25长度相互重叠7个残基的系列8聚肽融合蛋白(前者编号P50 P62，后者编号P63 P70)，继而实施第二轮MA-1662和MA-1671单抗识别表位的精细基序免疫印迹鉴定(步骤同第一轮18聚表位肽鉴定)。结果MA-1671单抗识别的最小基序依据四个免疫反应性8聚肽中共有序列确定为PARDR五肽(图1)，而MA-1662单抗识别的最小基序同样依据四个反应性8肽共有序列确定为ENELV五肽(图2)。以上用MA-1662和MA-1671两个特异单抗的人ZP4蛋白上两个功能性表位最小基序的鉴定，为今后设计研制无ZP特异性T细胞表位(导致ZP免疫卵巢功能障碍的关键病因)人用ZP多表位肽疫苗提供了两个重要候选表位。另外，这两个精细表位和/或可扩展8肽的化学合成肽或与GST188融合表达短肽，也可用作开发诊断妇女ZP自身免疫不孕病因用多表位肽检测抗原的候选表位或表位肽，或单独和/或组合用作诊断ZP自身免疫疾病的表位标志物。
图I. MA-1671单抗识别表位最小基序的免疫印迹鉴定(A)和列表共有序列分析(B)。注印迹膜上显示Lanes 50_62代表表达的P50-P62短肽融合蛋白。图A注箭头分别指示印迹反应性8聚肽(P53-P56)。图B黄色阴影蛋白反应性8聚肽中共有氨基酸序列(位于Pll和P12短肽之间的10个残基重叠区内)。图2. MA-1662单抗识别表位最小基序的免疫印迹鉴定(A)和列表共有序列分析(B)。注印迹膜上显示Lanes 63-70代表表达的P63-P70短肽融合蛋白。图A注箭头分别指示印迹反应性8聚肽(P64-P67)。图B黄色阴影蛋白反应性8聚肽中共有氨基酸序列。
具体实施例方式本发明可进ー步通过下列实例描述。列举实例并不意味限制本发明所涉及的范围，该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及[美]J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔編著黄培堂等翻译的第三版“分子克隆实验室手册”(科学出版社，2002)和[美]E.哈洛和D.莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南”(科学出版社，2002)中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。实施例I :鼠抗人ZP4单抗MA-1671的精细表位鉴定 材料和方法
I.人ZP4基因克隆由美国国立卫生院细胞和发育生物学实验室提供。热诱导表达质粒pSY621和pXXGST-Ι由本专利发明人构建[沈芸，应康，徐万祥，谢毅大肠杆菌高效表达载体PSY621的构建·复旦学报(自然科学版')2000 ；39(3) :313 - 317 ；Xu WX, et al.Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucida protein—4 usinga peptide biosynthesis strategy. J Reprod Immunol 2009; 81:9-16]。大肠杆菌BL21(DE3)菌株由复旦大学遗传工程国家重点实验室保藏。2.鼠抗 huZP4 单抗 MA-1662 和 MA-1671 由发明人制备(Bukovsky A, GuptaSKj et al. Production of monoclonal antibodies against recombinant human zonapellucida glycoproteins: utility in immunolocalization of respective zonaproteins in ovarian follicles. J Reprod Immunol 2008; 78: 102-114)。3.限制性内切酶EcoR KBamH I、Sal I、Taq酶和T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa Biotechnology公司，预染蛋白分子量标准、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠ニ抗(IgG /HRP)、ニ氨基联苯胺(DAB)和0.2 Wn硝酸纤维素膜购自上海生エ生物技术服务公司。免疫印迹化学发光ECL检测试剂盒购自GE公司。
4. QIAprep spin miniprep Kit质粒抽提试剂盒、QIAquick PCR产物纯化试剂盒和quick凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司。5.两端分别为BamH I和Sal I粘性末端，中间为各8_18肽编码DNA序列加TAA終止密码子的正负链DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。6.系列8/18妝编码DNA序列依据人ZP4蛋白编码基因和蛋白质氣基酸序列公开 1百 ノ窗、(Harrist JD, et al.し丄oning ana characterization of zona pellucidagenes and cDNAs from a variety of mammalian species: the ZPA, ZPB and ZPC genefamilies. DNASeq 1994; 4: 361-393)。 制备过程摘要如下从huZP4基因克隆质粒中通过PCR扩增出去除信号肽和跨膜区的两端为EcoR I和Sal I限制酶位点的huZP4N(氨基酸残基58-234)和huZP4C (残基227-463)两个编码基因片段；双酶切后重组插入pSY621热诱导质粒，重组质粒经DNA测序验证后转化大肠杆菌宿主菌；诱导表达huZP4N和huZP4C蛋白供MA-1662和MA-1671单抗鉴定表位肽用。用MA-1671单抗的人卵透明带蛋白_4 (huZP4)精细表位鉴定的具体步骤如下
I.依据huZP4 (曾命名为ZPB和ZPl)基因序列公开信息，PCR扩增出huZP4N和
huZP4C两个大片段蛋白编码基因，重组插入pSY621热诱导原核表达质粒，诱导表达后进行SDS-PAGE分析和用MA-1662和MA-1671单抗完成免疫印迹鉴定，确定两个单抗可识别huZP4N 和 huZP4C 区段。2.设计跨越可被MA-1671识别的huZP4N全长度序列相互重叠10个氨基酸残基的系列18肽(编号P1-P21)编码DNA正负链片段(正链5’ -端加5’ -gatcc，3’ -端加taag-3’ ；负链5’ _端加5’ _tcgactta,3’ -端加g_3’),外送DNA化学合成。3.将I或2个OD的互补正负链片段用ddH20溶解成20 μ mol/μ I储存液(根据DNA合成报告单数据)；各取10 μ I储存液和20 ddH20于L 5 ml Eppendorf管中，94°C水浴加热5min,自然降至室温后,在15 μ I反应体积中吸入2 μ I退火片段、I μ I约200ng/ μ I经BamH I和Sal I双酶切的pXXGST-Ι质粒、I μ I Τ4 DNA连接酶和其1.5 μ I缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21 (DE3)宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37V培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆转接3 ml LB培养液诱导表达，以由pXXGST-2表达的GST188蛋白为对照，各表达的GST188-18肽(P1-P21)融合蛋白经15%SDS-PAGE分析确认(与对照蛋白电泳迁移率相差约2个kDa)，挑取各重组克隆外送进行DNA测序验证。4.将插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3 ml LB培养液中，于30°C振荡培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，30°C振荡培养2 3 h至菌体浓度达到0.6 0.8 OD后，调高温度至42°C热诱导4 h，离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5 min备用。5.将诱导的细菌总蛋白样品同时走15% SDS-PAGE，电泳结束后，ー块凝胶用考马斯亮蓝染色，ニ块凝胶进行硝酸纤维素膜电(100 mA)转移2 h，用丽春红染色转印迹膜2min,在目的短肽融合蛋白条带处用针头打孔标记，用水冲洗掉丽春红染色。6.印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5%脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8 10 ml反应液中加入I μ I—抗MA-1671单抗，室温反应2 h，PBS缓冲液洗涤后加入5 μ I ニ抗羊抗鼠IgG /HRP (I: 2000稀释)，室温反应I h，用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色，依据免疫印迹结果确认Pll和P12为反应性18聚肽(融合蛋白)。7.设计覆盖可被MA-1671识别的Pll和P12两个重叠18聚肽残基序列总长度相互重叠7个氨基酸残基的系列8肽(11个，编号P50-P62)编码DNA正负链片段(正链5’-端加 5，-gatcc, 3，-端カロ taag-3’ ；负链 5，-端カロ 5，-tcgactta, 3，-端カロ g_3，),外送 DNA 化学合成。8.如前述3-5操作步骤，完成13个系列短肽融合蛋白的构建表达及其表位最小基序免疫印迹鉴定，确认被MA-1671单抗识别的P53-P56供四个反应性8聚肽融合蛋白(图1A)。9.依据上述四个反应性8聚肽(融合蛋白)中黄色阴影显示的共有氨基酸残基数，最终确定鼠抗huZP4单抗MA-1671识别的表位最小基序为PARDR，其五肽残基序列位于18聚短肽Pll和P12的10个残基重叠区内。 另外，MA-1662单抗识别huZP4蛋白的精细表位鉴定，也采用上述同样的方法和步骤。简述如下首先设计跨越可被MA-1662识别的huZP4C全长度序列相互重叠10个氨基酸残基的系列18肽(编号P22-P49)编码DNA正负链片段，重组表达系列18聚短肽融合蛋白，用MA-1662单抗进行第一轮反应性18聚肽扫描作图鉴定；继而表达覆盖P25反应性18聚肽相互重叠7个残基的系列8聚肽(P63-P70)融合蛋白，进行第二轮精细表位鉴定，最終依据MA-1662单抗识别P64-P67四个短肽中的共有残基，确定其表位最小基序为ENELV。尽管本发明描述了人卵透明带蛋白-4 (huZP4)可被单抗MA-1662和MA-1671识别的两个线性抗原表位最小基序和它们扩展的8肽，它们既可以单独和/或组合用作研制安全、有效且可逆的人用ZP重组多表位疫苗候选表位，也能通过化学合成或融合表达或单独或组合用作由ZP自身免疫导致妇女不孕病因诊断的候选表位抗原或表位标志物(检测患者血清组合ZP抗体)，但有一点对于相关领域研究技术人员来说是显而易见的，即在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的最小表位肽和其扩展的8肽或8肽融合蛋白作各种变化改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种人卵透明带蛋白-4的表位最小基序肽，其特征在于氨基酸序列为SEQ. IDNo. I所示，记为huZP4147-151 ;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 2所示，记为huZP4256-260。
2.ー种含如权利要求I所述的表位最小基序肽的扩展短肽，其特征在于其氨基酸序列为SEQ. ID No. 3和SEQ. ID No. 4所示，在化学合成或融合表达该8肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其他残基替代； 或者其氨基酸序列为SEQ. ID No. 5和SEQ. ID No. 6所示，在化学合成或融合表达该8肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其他残基替代。
3.如权利要求I所述的表位最小基序肽在制备人用ZP多表位肽避孕疫苗中应用。
4.如权利要求2所述的表位最小基序肽的扩展短肽単独或组合制备作为临床诊断由ZP自身免疫导致妇女不孕病因的血清识别表位标志物的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药与生物检测技术领域，具体为一种人卵透明带蛋白-4(ZP4)上能被抗人ZP4蛋白单克隆抗体MA-1662和MA-1671识别的两个线性抗原表位最小基序肽及其扩展8肽和用途。本发明提供了2个可用于研制人类免疫生育调控重组多表位肽疫苗原的候选表位肽，其氨基酸序列为SEQ.IDNo.l所示，记为huZP4147-151，或者为SEQ.IDNo.2所示，记为huZP4256-260；还提供了可用作研制诊断ZP自身免疫不育妇女血清ZP抗体的新型高特异性高灵敏度重组多表位肽检测抗原的候选表位，其氨基酸序列为SEQIDNo.3~SEQIDNo.6所示。
文档编号C07K7/06GK102659923SQ201210145968
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月13日 优先权日2012年5月13日
发明者唐海平, 季朝能, 山奇塔·乔德哈瑞, 徐万祥, 王健, 谢毅, 贝纳·布罕达瑞, 赛提旭·古普塔, 顾少华 申请人:上海市计划生育科学研究所, 复旦大学