专利名称：一种对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法
技术领域：
本发明属于对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原技术领域，尤其涉及一种对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法。
背景技术：
免疫分析是基于抗原、抗体的特异性反应的一种分析方法，在医学上已广泛应用于微量物质的检测。免疫分析具有特异性强、灵敏度高，甚至更低、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点，近年来得到迅速发展。 建立免疫分析方法，首先必须制备出对农药特异性强亲和力高的抗体。一般农药的分子量小于1000，不具备刺激机体产生针对农药抗原决定簇的特异性抗体，为小分子半抗原，因此必须与大分子载体偶联后才具有免疫原性。要实现与大分子物质的偶联，半抗原分子上必须具备能共价结合到载体上的一个活性基团(如氨基、羧基、羟基和巯基等)，对多数不具备活性基团的农药则通常进行衍生化制备或由原料合成，也可以用其他代谢及降解产物作为半抗原。一般理想的半抗原应尽量具备与待测物类似的立体化学特征，以减少免疫交叉污染，而且应尽量保证半抗原与载体的大分子复合物的特征结构能最大限度地被免疫活性细胞所识别。典型的半抗原结构中应具备适当末端活性基团，如-NH2、-C00H、-0H、_SH等；同时活性基团与载体之间应具备一定长度的间隔臂，一般为4-6个碳链长度(0. 5-0. 8nm)。间隔臂一般为非极性，且除供偶联的活性基团外，不应有其它高免疫活性的结构，如苯环、杂环等，以降低抗体对间隔臂的识别和间隔臂对待测物结构特征的影响；间隔臂还应远离待测物的特征结构部分和官能团，有利于高选择性和高亲合性抗体的产生。半抗原合成以后，通过化学方法使半抗原分子与载体蛋白连接制备免疫原。用作载体的蛋白通常有牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、人血清白蛋白(HAS)和钥孔血蓝蛋白(KLH)等。农药人工抗原合成成功后通常需要经过透析或过柱的方法对其进行纯化。对纯化后人工抗原进行鉴定，一方面是定性判断半抗原与载体是否偶联成功；另一方面是定量测定结合比和蛋白质含量等。判断是否偶联成功最简单的方法为紫外扫描法，如果人工抗原的紫外吸收特征兼具有或不同于原半抗原和载体蛋白的紫外吸收特征，则可初步判断偶联成功。
发明内容
本发明目的是建立一种以溴氰菊酯为原料，通过硝化、还原、重氮化、引入羧基活性基团等四步反应合成半抗原方法，以利于制备出对拟除虫菊酯类农药特异性强亲和力高的抗体。本发明实施例是这样实现的，一种对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，该合成方法包括以溴氰菊酯为原料，通过硝化还原两步反应合成溴氰菊酯化合物；
通过重氮化反应,合成半抗原Hp-I ;利用活泼酯法将合成的溴氰菊酯半抗原Hp-I与载体蛋白BSA相偶联，制备溴氰菊酯人工免疫抗原。进一步，以溴氰菊酯为原料，通过硝化还原两步反应合成溴氰菊酯化合物，合成步骤如下向150mL的三口烧瓶中加入溴氰菊酯18g，23mL氯仿搅拌溶解，溶液呈透明黄色，取发烟硝酸10. 2ImL与16mL乙酸置于恒压滴液漏斗中充分混匀，缓慢向反应瓶中滴加，
I.5h滴加完毕，反应液控制在25V _30°C范围内，待滴加完毕，保持该条件继续搅拌反应3. 5h ;将反应液倒入200mL的冰水中，搅拌，出现大量淡黄色粘稠物质；用乙酸乙酯对水液进行萃取，然后再用蒸馏水反复洗涤多次，收集有机相，无水Na2SO4干燥过夜，抽滤，减压蒸馏得金黄色粘稠液体。粗产物未经纯化，直接进行下一步反应；
称取上一步得到的产物5g，溶于装有50mL乙醇的烧瓶中，加入9. 8gSnCl2 2H20，搅拌得白色的浊液，反应体系用N2保护，70°C -75°C下反应35min。反应液冷却后，倒入150mL H2O中，搅拌，乳白色浆状，加入200mL乙酸乙酯，并用10%的NaHCO3溶液调节pH =7，过程中溶液产生大量的气泡，随后加入适量的硅藻土，抽滤，再用蒸馏水和乙酸乙酯洗涤滤饼，收集滤液中的有机相，无水Na2SO4干燥，溶液逐渐由黄色变为红棕色溶液，抽滤，减压蒸馏除去溶剂得红褐色的油状物。粗产物通过硅胶柱层析，乙酸乙酯/石油醚=I 2，脱色纯化得淡黄色粘稠物，下一步进行重氮化反应。进一步,通过重氮化反应,合成半抗原Hp-I,合成步骤如下在半抗原Hp-I的基础上引入羧基活性基团，并加入连接臂；取上步反应产物溶于盐酸中，在冰冷却下保持温度在0_5°C之间，然后在搅拌情况下逐渐加入亚硝酸那溶液；反应时，酸的用量为产物量的3倍，反应式为Ar-NH2+2HCL+NaN02 = ArN2CL+NaCL+2H20重氮化反应后，取上步产物0. 4g，加4mol/L的HCL溶液0. 1925mL, 15min后加入
0.5mol/L的NaNO2溶液I. 54mL,反应45min，得淡黄色液体。后加入丁二酸酐I. 155g，反应2h以上，反应处于室温中磁力搅拌下进行，过夜后结束反应；反应液经减压蒸馏除去溶剂，残留固体用四氢呋喃处理，硅胶柱分离纯化，薄层硅胶板上表现为一个斑点乙酸乙酯石油醚=4 I, Rf = 0. 65 ；进一步，利用活泼酯法将合成的溴氰菊酯半抗原Hp-I与载体蛋白BSA相偶联，制备溴氰菊酯人工免疫抗原，具体步骤如下称取0. 31g半抗原Hp-1，再称取0. 131g NHS加到半抗原中，用400uLDMF溶解于反应装置中，反应在磁力搅拌下室内温度进行IOh ;反应终液置4°C冰箱冷却2h以上，经I. 2万rpm离心5分钟,取上清，即活泼酯液,并缓慢滴加到5mL6mg/mL的BSA溶液中反应；反应缓冲液为0. 2mol/L pH7. 4的磷酸盐缓冲液，反应在磁力搅拌下室内温度进行4小时；将反应终液置透析袋内，于0. 01mol/L pH7. 4的PBS溶液中4°C搅拌透析，每4_8小时换一次透析液，共透析3天，透析结束后将透析袋中的蛋白溶液，即为溴氰菊酯人工抗原Hp-1-BSA，分成若干等份分装于Iml离心管中，于_20°C冰箱中存放备用。本发明目的是建立一种以溴氰菊酯为原料，通过硝化、还原、重氮化、引入羧基活性基团等四步反应合成半抗原方法，以利于制备出对拟除虫菊酯类农药特异性强亲和力高的抗体。
图I溴氰菊酯化合物I合成路线；图2半抗原Hapten-I的合成路线；图3Hp-l-BSA、Hp-I和BSA的紫外扫描光谱。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例是这样实现的，一种以溴氰菊酯为原料，通过硝化还原两步反应合成溴氰菊酯化合物I。合成路线为向150mL的三口烧瓶中加入溴氰菊酯18g，23mL氯仿搅拌溶解，溶液呈透明黄色，取发烟硝酸10. 2ImL与16mL乙酸置于恒压滴液漏斗中充分混匀，缓慢向反应瓶中滴加，
I.5h滴加完毕，反应液控制在25V _30°C范围内，待滴加完毕，保持该条件继续搅拌反应3. 5h。将反应液倒入200mL的冰水中，搅拌，出现大量淡黄色粘稠物质。用乙酸乙酯对水液进行萃取，然后再用蒸馏水反复洗涤多次，收集有机相，无水Na2SO4干燥过夜，抽滤，减压蒸馏得金黄色粘稠液体。粗产物未经纯化，直接进行下一步反应。称取上一步得到的产物5g，溶于装有50mL乙醇的烧瓶中，加入9. 8gSnCl2 2H20，搅拌得白色的浊液，反应体系用N2保护，70°C -75°C下反应35min。反应液冷却后，倒入150mL H2O中，搅拌，乳白色浆状，加入200mL乙酸乙酯，并用10%的NaHCO3溶液调节pH =7，过程中溶液产生大量的气泡，随后加入适量的硅藻土，抽滤，再用蒸馏水和乙酸乙酯洗涤滤饼，收集滤液中的有机相，无水Na2SO4干燥，溶液逐渐由黄色变为红棕色溶液，抽滤，减压蒸馏除去溶剂得红褐色的油状物。粗产物通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/石油醚=I 2)，脱色纯化得淡黄色粘稠物。下一步进行重氮化反应。I. I. 15. 2重氮化反应半抗原Hp-I的合成路线如下，在半抗原Hp-I的基础上引入羧基活性基团，并加入
连接臂。取上步反应产物溶于盐酸中，在冰冷却下保持温度在0_5°C之间，然后在搅拌情况下逐渐加入亚硝酸那溶液。反应时，酸的用量为产物量的3倍，反应式为Ar-NH2+2HCL+NaN02 = ArN2CL+NaCL+2H20重氮化反应后，取上步产物0. 4g，加4mol/L的HCL溶液0. 1925mL, 15min后加入0. 5mol/L的NaNO2溶液I. 54mL,反应45min，得淡黄色液体。后加入丁二酸酐I. 155g，反应2h以上，反应处于室温中磁力搅拌下进行，过夜后结束反应。反应液经减压蒸馏除去溶剂，残留固体用四氢呋喃处理，硅胶柱分离纯化，薄层硅胶板上表现为一个斑点(乙酸乙酯石油醚=4 : I, Rf = 0.65)。免疫抗原的合成，利用活泼酯法将合成的溴氰菊酯半抗原Hp-I与载体蛋白BSA相偶联，制备溴氰菊酯人工免疫抗原。具体步骤如下
称取0. 31g半抗原Hp-1，再称取0. 131g NHS加到半抗原中，用400uLDMF溶解于反应装置中，反应在磁力搅拌下室内温度进行10h。反应终液置4°C冰箱冷却2h以上，经I. 2万rpm离心5分钟,取上清(即活泼酯液)，并缓慢滴加到5mL6mg/mL的BSA溶液中反应。反应缓冲液为0. 2mol/L pH7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS液)，反应在磁力搅拌下室内温度进行4小时(从加样结束开始记时)。将反应终液置透析袋内，于0. 01mol/L pH7. 4的PBS溶液中4°C搅拌透析，每4-8小时换一次透析液，共透析3天。透析结束后将透析袋中的蛋白溶液(即为溴氰菊酯人工抗原Hp-I-BSA)，分成若干等份分装于Iml离心管中，于_20°C冰箱中存放备用。溴氰菊酯人工抗原鉴定采用活泼酯方法，将合成半抗原分别偶联到载体蛋白BSA，制备成溴氰菊酯免疫抗原。
人工抗原、载体蛋白和半抗原的紫外扫描结果见图3人工抗原在305nm处出现强吸峰，明显不同于载体蛋白及半抗原的吸收曲线，这说明在载体蛋白上偶联上了溴氰菊酯分子，抗原合成成功。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，该合成方法包括 以溴氰菊酯为原料，通过硝化还原两步反应合成溴氰菊酯化合物； 通过重氮化反应，合成半抗原Hp-I ； 利用活泼酯法将合成的溴氰菊酯半抗原Hp-I与载体蛋白BSA相偶联，制备溴氰菊酯人工免疫抗原。
2.如权利要求I所述的对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，以溴氰菊酯为原料，通过硝化还原两步反应合成溴氰菊酯化合物，合成步骤如下 向150mL的三口烧瓶中加入溴氰菊酯18g，23mL氯仿搅拌溶解，溶液呈透明黄色，取发烟硝酸10. 2ImL与16mL乙酸置于恒压滴液漏斗中充分混匀，缓慢向反应瓶中滴加，I. 5h滴加完毕，反应液控制在25V _30°C范围内，待滴加完毕，保持该条件继续搅拌反应3. 5h ;将反应液倒入200mL的冰水中，搅拌，出现大量淡黄色粘稠物质；用乙酸乙酯对水液进行萃取，然后再用蒸馏水反复洗涤多次，收集有机相，无水Na2SO4干燥过夜，抽滤，减压蒸馏得金黄色粘稠液体。粗产物未经纯化，直接进行下一步反应； 称取上一步得到的产物5g，溶于装有50mL乙醇的烧瓶中，加入9. 8gSnCl2 · 2H20，搅拌得白色的浊液，反应体系用N2保护，70°C -75°C下反应35min。反应液冷却后，倒入150mLH2O中，搅拌，乳白色浆状，加入200mL乙酸乙酯，并用10%的NaHCO3溶液调节pH = 7，过程中溶液产生大量的气泡，随后加入适量的硅藻土，抽滤，再用蒸馏水和乙酸乙酯洗涤滤饼，收集滤液中的有机相，无水Na2SO4干燥，溶液逐渐由黄色变为红棕色溶液，抽滤，减压蒸馏除去溶剂得红褐色的油状物。粗产物通过硅胶柱层析，乙酸乙酯/石油醚=I 2，脱色纯化得淡黄色粘稠物，下一步进行重氮化反应。
3.如权利要求I所述的对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，通过重氮化反应，合成半抗原Ηρ-l,合成步骤如下 在半抗原Hp-I的基础上引入羧基活性基团，并加入连接臂； 取上步反应产物溶于盐酸中，在冰冷却下保持温度在0-5°C之间，然后在搅拌情况下逐渐加入亚硝酸那溶液；反应时，酸的用量为产物量的3倍，反应式为Ar-NH2+2HCL+NaN02 = ArN2CL+NaCL+2H20 重氮化反应后，取上步产物O. 4g，加4mol/L的HCL溶液O. 1925mL, 15min后加入O.5mol/L的NaNO2溶液I. 54mL,反应45min，得淡黄色液体。后加入丁二酸酐I. 155g，反应2h以上，反应处于室温中磁力搅拌下进行，过夜后结束反应；反应液经减压蒸馏除去溶剂，残留固体用四氢呋喃处理，硅胶柱分离纯化，薄层硅胶板上表现为一个斑点乙酸乙酯石油醚=4 I, Rf = O. 65。
4.如权利要求I所述的对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，利用活泼酯法将合成的溴氰菊酯半抗原Hp-I与载体蛋白BSA相偶联，制备溴氰菊酯人工免疫抗原，具体步骤如下 称取O. 31g半抗原Hp-I，再称取O. 131g NHS加到半抗原中，用400uLDMF溶解于反应装置中，反应在磁力搅拌下室内温度进行IOh ;反应终液置4°C冰箱冷却2h以上，经I. 2万rpm离心5分钟,取上清，即活泼酯液,并缓慢滴加到5mL6mg/mL的BSA溶液中反应；反应缓冲液为O. 2mol/L pH7. 4的磷酸盐缓冲液，反应在磁力搅拌下室内温度进行4小时；将反应终液置透析袋内，于O. 01mol/L pH7. 4的PBS溶液中4°C搅拌透析，每4_8小时换一次透析液，共透析3天，透析结束后将透析袋中的蛋白溶液，即为溴氰菊酯人工抗原Hp-1-BSA，分成若干等份分装于Iml 离心管中，于_20°C冰箱中存放备用。
全文摘要
本发明公开了一种对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，该合成方法包括以溴氰菊酯为原料，通过硝化还原两步反应合成溴氰菊酯化合物；通过重氮化反应，合成半抗原Hp-1；利用活泼酯法将合成的溴氰菊酯半抗原Hp-1与载体蛋白BSA相偶联，制备溴氰菊酯人工免疫抗原。本发明目的是建立一种以溴氰菊酯为原料，通过硝化、还原、重氮化、引入羧基活性基团等四步反应合成半抗原方法，以利于制备出对拟除虫菊酯类农药特异性强亲和力高的抗体。
文档编号C07C255/39GK102807615SQ20121029535
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月20日 优先权日2012年8月20日
发明者李相前, 任世英 申请人:淮阴工学院