专利名称：一种乌拉贝宁的提取纯化方法
技术领域：
本发明属于天然药物提取技术领域，涉及一种乌拉贝宁的提取纯化方法。
背景技术：
乌拉贝宁(Uralenin)，又名爱斯形刺桐素B，分子式为C2tlH2tlO6，分子量为356. 37，mp. 217-218°C,主要存在于豆科植物爱斯形刺桐sigmoidea Hua的莖皮.、甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的地上部分及叶中，其中甘草叶中含量最高。药理研究表明，乌拉贝宁具有较强的抗格兰阳性菌作用，对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑菌浓度为50ppm ;在固体培养基中对环状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌作用比Sigmoidin A强，在液体培养基的抑制作用比Sigmoidin A弱。另外，乌拉贝宁还具有抗氧活性，可抑制巨噬细胞超氧化物的产生。 现有技术中，尚没有适用于高纯度乌拉贝宁工业化大生产的制备工艺报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乌拉贝宁的提取纯化方法，这种方法不仅避免了大量有毒试剂的使用，提高了乌拉贝宁的提取率，而且成本低、方法简便经济。本发明的技术方案是
1)以甘草叶为原料，粉碎，加入萃取釜，采用超临界CO2萃取，以丙酮为夹带剂，萃取2-5小时，解析萃取液回收试剂，得萃取物；
2)将萃取物按比例加入硫酸铵和乙醇双水相系统，加热混合均匀，分为上、下两相，力口下相降温、结晶回收硫酸铵晶体，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，混合均匀，取含有乌拉贝宁的上相，减压浓缩；
3)将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，乙醇水溶液洗脱，脱色、重结晶得乌拉贝宁。步骤I)中所述夹带剂为体积百分比65-80%的丙酮水溶液，加入量为药材量的I5-28%ο步骤I)中所述超临界CO2萃取过程中，设定萃取釜压力为24_36MPa，温度为46-60°C，分离釜压力为5-9MPa，温度为30-45°C。步骤2)中所述浓缩液与乙醇体积比为(6 9): I，加入的乙醇质量分数为18-26%，加入的硫酸铵质量分数为10-22% ;分相温度为30-50°C，静置时间为4-8小时。步骤2)中所述乙酸乙酯反萃取中，分相温度为20_30°C，静置时间为2-4小时。步骤3)中所述聚酰胺树脂为100-200目，用量是药材量的l/3-l/2(V/W)，用3-8BV体积百分比为65-85%的乙醇水溶液洗脱。步骤3)中所述重结晶前用活性炭脱色，所述活性炭与乌拉贝宁的质量比为5:1-10:1，所述重结晶溶剂为体积百分比为20-30%的乙醇水溶液，于(TC-4°C条件下析晶。本发明的有益效果在于本发明采用超临界CO2萃取乌拉贝宁，具有萃取率高、高效无污染等特点；采用双水相萃取条件温和、操作安全、乙醇和硫酸铵易回收重复利用，不会造成污染；结晶前采用活性炭脱色，以除去产品中的杂质，提高产品纯度，增加产品稳定性，避免产生副作用等。
具体实施例方式 实施例I:
将甘草叶粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加热萃取釜至50 V、解析釜达到32 °C，通入CO2,流量为20L/h，打开加压泵升高萃取釜压力至29MPa、解析釜压力至9MPa，关闭CO2钢瓶阀门。打开循环，加入80%的丙酮作为夹带剂(加入量为药材量的15%)至夹带剂储罐中，打开夹带剂高压泵阀门，使夹带剂泵入萃 取釜，保持恒压、恒温萃取2. 5h，收集从解析釜放出的萃取物，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，浓缩液与乙醇体积比为9 :1，加入的乙醇质量分数为18%，加入的硫酸铵质量分数为22%，加热混合均匀，在30°C条件下放置4h，静置，分为上、下两相，取下相降温、结晶回收硫酸铵晶体，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为25%，氯化钠的质量分数为10%，余量为水，混合均匀，系统在20°C下静置2h，分相，取含有乌拉贝宁的上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，用6BV70%乙醇溶液洗脱，收集含有乌拉贝宁的流分，洗脱液加入IOg药用活性炭煮沸10分钟，趁热过滤，滤液冷却至4°C静置，析晶，用20%乙醇溶液重结晶，干燥即得得产品，经HPLC检测，其纯度为96. 7%。实施例2
将甘草叶粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加热萃取釜至54°C、解析釜达到43°C，通入CO2,流量为20L/h，打开加压泵升高萃取釜压力至32MPa、解析釜压力至8MPa，关闭CO2钢瓶阀门。打开循环，加入80%的丙酮作为夹带剂(加入量为药材量的28%)至夹带剂储罐中，打开夹带剂高压泵阀门，使夹带剂泵入萃取釜，保持恒压、恒温萃取4. 5h，收集从解析釜放出的萃取物，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，浓缩液与乙醇体积比为6 :1，加入的乙醇质量分数为20%，加入的硫酸铵质量分数为18%，加热混合均匀，在40°C条件下放置6h，静置，分为上、下两相，取下相降温、结晶回收硫酸铵晶体，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为25%，氯化钠的质量分数为10%，余量为水，混合均匀，系统在22°C下静置4h，分相，取含有乌拉贝宁的上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，用5BV75%乙醇溶液洗脱，收集含有乌拉贝宁的流分，洗脱液加入8g药用活性炭煮沸10分钟，趁热过滤，滤液冷却至2°C静置，析晶，用30%乙醇溶液重结晶，干燥即得得产品，经HPLC检测，其纯度为98. 4%。实施例3:
将甘草叶粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加热萃取釜至52°C、解析釜达到40°C，通入CO2,流量为20L/h，打开加压泵升高萃取釜压力至36MPa、解析釜压力至6MPa，关闭CO2钢瓶阀门。打开循环，加入75%的丙酮作为夹带剂(加入量为药材量的20%)至夹带剂储罐中，打开夹带剂高压泵阀门，使夹带剂泵入萃取釜，保持恒压、恒温萃取3h，收集从解析釜放出的萃取物，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，浓缩液与乙醇体积比为7 :1，加入的乙醇质量分数为22%,加入的硫酸铵质量分数为14%,加热混合均匀,在35°C条件下放置7h,静置,分为上、下两相，取下相降温、结晶回收硫酸铵晶体，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为25%，氯化钠的质量分数为10%，余量为水，混合均匀，系统在27°C下静置4h，分相，取含有乌拉贝宁的上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，用8BV85%乙醇溶液洗脱，收集含有乌拉贝宁的流分，洗脱液加入6g药用活性炭煮沸10分钟，趁热过滤，滤液冷却至(TC静置，析晶，用25%乙醇溶液重结晶，干燥即得得产品，经HPLC检测，其纯度为98. 2%ο实施例4:
将甘草叶粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加热萃取釜至55 °C、解析釜达到35 °C，通入CO2,流量为20L/h，打开加压泵升高萃取釜压力至34MPa、解析釜压力至5MPa，关闭CO2钢瓶阀门。打开循环，加入70%的丙酮作为夹带剂(加入量为药材量的25%)至夹带剂储罐中，打开夹带剂高压泵阀门，使夹带剂泵入萃取釜，保持恒压、恒温萃取5h，收集从解析釜放出的萃取物，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，浓缩液与乙醇体积比为8 :1，加入的乙醇质量分数为25%,加入的硫酸铵质量分数为16%,加热混合均匀,在45°C条件下放置4h,静置,分为上、下两相，取下相降温、结晶回收硫酸铵晶体，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为25%，氯化钠的质量分数为10%，余量为水，混合均匀，系统在20°C下静置4h，分相，取含有乌拉贝宁的上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，用3BV65%乙醇溶液洗脱，收集含有乌拉贝宁的流分，洗脱液加入12g药用活性炭煮沸10分钟，趁热过·滤，滤液冷却至4°C静置，析晶，用30%乙醇溶液重结晶，干燥即得得产品，经HPLC检测，其纯度为96. 4%ο实施例5:
将甘草叶粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加热萃取釜至60 V、解析釜达到30 V，通入CO2,流量为20L/h，打开加压泵升高萃取釜压力至24MPa、解析釜压力至5MPa，关闭CO2钢瓶阀门。打开循环，加入65%的丙酮作为夹带剂(加入量为药材量的15%)至夹带剂储罐中，打开夹带剂高压泵阀门，使夹带剂泵入萃取釜，保持恒压、恒温萃取4h，收集从解析釜放出的萃取物，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，浓缩液与乙醇体积比为9 :1，加入的乙醇质量分数为26%,加入的硫酸铵质量分数为10%,加热混合均匀,在50°C条件下放置7h,静置,分为上、下两相，取下相降温、结晶回收硫酸铵晶体，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为25%，氯化钠的质量分数为10%，余量为水，混合均匀，系统在24°C下静置3h，分相，取含有乌拉贝宁的上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，用8BV65%乙醇溶液洗脱，收集含有乌拉贝宁的流分，洗脱液加入9g药用活性炭煮沸10分钟，趁热过滤，滤液冷却至4°C静置，析晶，用25%乙醇溶液重结晶，干燥即得得产品，经HPLC检测，其纯度为97. 3%ο实施例6:
将甘草叶粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加热萃取釜至46°C、解析釜达到45°C，通入CO2,流量为20L/h，打开加压泵升高萃取釜压力至26MPa、解析釜压力至9MPa，关闭CO2钢瓶阀门。打开循环，加入65%的丙酮作为夹带剂(加入量为药材量的28%)至夹带剂储罐中，打开夹带剂高压泵阀门，使夹带剂泵入萃取釜，保持恒压、恒温萃取3. 5h，收集从解析釜放出的萃取物，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，浓缩液与乙醇体积比为7 :1，加入的乙醇质量分数为24%，加入的硫酸铵质量分数为12%，加热混合均匀，在30°C条件下放置8h，静置，分为上、下两相，取下相降温、结晶回收硫酸铵晶体，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为25%，氯化钠的质量分数为10%，余量为水，混合均匀，系统在30°C下静置2h，分相，取含有乌拉贝宁的上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，用4BV70%乙醇溶液洗脱，收集含有乌拉贝宁的流分，洗脱液加入7g药用活性炭煮沸10分钟，趁热过滤，滤液冷却至2°C静置，析晶，用20%乙醇溶液重结晶，干燥即得得产品，经HPLC检测，其纯度为97. 7%。实施例7:
将甘草叶粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加热萃取釜至52 °C、解析釜达到38 V，通入CO2,流量为20L/h，打开加压泵升高萃取釜压力至30MPa、解析釜压力至6MPa，关闭CO2钢瓶阀门。打开循环，加入80%的丙酮作为夹带剂(加入量为药材量的22%)至夹带剂储罐中，打开夹带剂高压泵阀门，使夹带剂泵入萃取釜，保持恒压、恒温萃取2h，收集从解析釜放出的萃取物，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，浓缩液与乙醇体积比为6 :1，加入的乙醇质量分数为26%,加入的硫酸铵质量分数为22%,加热混合均匀,在48°C条件下放置6h,静置,分为上、 下两相，取下相降温、结晶回收硫酸铵晶体，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为25%，氯化钠的质量分数为10%，余量为水，混合均匀，系统在28°C下静置3h，分相，取含有乌拉贝宁的上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，用5BV80%乙醇溶液洗脱，收集含有乌拉贝宁的流分，洗脱液加入12g药用活性炭煮沸10分钟，趁热过滤，滤液冷却至4°C静置，析晶，用30%乙醇溶液重结晶，干燥即得得产品，经HPLC检测，其纯度为98. 8%ο实施例8
将甘草叶粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加热萃取釜至48°C、解析釜达到41°C，通入CO2,流量为20L/h，打开加压泵升高萃取釜压力至35MPa、解析釜压力至7MPa，关闭CO2钢瓶阀门。打开循环，加入70%的丙酮作为夹带剂(加入量为药材量的18%)至夹带剂储罐中，打开夹带剂高压泵阀门，使夹带剂泵入萃取釜，保持恒压、恒温萃取5h，收集从解析釜放出的萃取物，加入硫酸铵和乙醇双水相系统，浓缩液与乙醇体积比为8 :1，加入的乙醇质量分数为18%,加入的硫酸铵质量分数为10%,加热混合均匀,在42°C条件下放置5h,静置,分为上、下两相，取下相降温、结晶回收硫酸铵晶体，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，其中乙酸乙酯的质量分数为25%，氯化钠的质量分数为10%，余量为水，混合均匀，系统在30°C下静置4h，分相，取含有乌拉贝宁的上相，减压浓缩得浸膏，将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，用3BV85%乙醇溶液洗脱，收集含有乌拉贝宁的流分，洗脱液加入6. 5g药用活性炭煮沸10分钟，趁热过滤，滤液冷却至(TC静置，析晶，用25%乙醇溶液重结晶，干燥即得得产品，经HPLC检测，其纯度为98. 5%。
权利要求
1.一种乌拉贝宁的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤 1)以甘草叶为原料，粉碎，加入萃取釜，采用超临界CO2萃取，以丙酮为夹带剂，萃取2-5小时，解析萃取液回收试剂，得萃取物； 2)将萃取物按比例加入硫酸铵和乙醇双水相系统，加热混合均匀，分为上、下两相，力口下相降温、结晶回收硫酸铵晶体，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠，混合均匀，取含有乌拉贝宁的上相，减压浓缩； 3)将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，乙醇水溶液洗脱，脱色、重结晶得乌拉贝宁。
2.根据权利要求I所述的提取纯化方法，其特征在于步骤I)中所述夹带剂为体积百分比65-80%的丙酮水溶液，加入量为药材量的15-28%。
3.根据权利要求I所述的提取纯化方法，其特征在于步骤I)中所述超临界CO2萃取过程中，设定萃取釜压力为24-36MPa，温度为46_60°C，分离釜压力为5_9MPa，温度为30-45。。。
4.根据权利要求I所述的提取纯化方法，其特征在于步骤2)中所述浓缩液与乙醇体积比为(6 9) :1，加入的乙醇质量分数为18-26%，加入的硫酸铵质量分数为10-22% ;分相温度为30-50°C，静置时间为4-8小时。
5.根据权利要求I所述的提取纯化方法，其特征在于步骤2)中所述乙酸乙酯反萃取中，分相温度为20-30°C，静置时间为2-4小时。
6.根据权利要求I所述的提取纯化方法，其特征在于步骤3)中所述聚酰胺树脂为100-200目，用量是药材量的1/3-1/2 (V/W)，用3-8BV体积百分比为65-85%的乙醇水溶液洗脱。
7.根据权利要求I所述的提取纯化方法，其特征在于步骤3)中所述重结晶前用活性炭脱色，所述活性炭与乌拉贝宁的质量比为5:1-10:1，所述重结晶溶剂为体积百分比为20-30%的乙醇水溶液，于(TC _4°C条件下析晶。
全文摘要
本发明涉及一种乌拉贝宁的提取纯化方法，方法步骤为1)以甘草叶为原料，粉碎，加入萃取釜，采用超临界CO2萃取，以丙酮为夹带剂，萃取2-5小时，解析萃取液回收试剂，得萃取物；2)将萃取物加入硫酸铵和乙醇双水相系统萃取，取上相加乙酸乙酯、水和氯化钠反萃取，将含有乌拉贝宁的上相减压浓缩得浓缩浸膏；3)将浓缩浸膏加入聚酰胺树脂柱，乙醇水溶液洗脱，脱色、重结晶得乌拉贝宁。本发明方法具有提取率高、成本低、环境污染小等优点。
文档编号C07D311/32GK102850315SQ20121036313
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者苏刘花 申请人:南京泽朗农业发展有限公司