一种新的l-赖氨酸碱溶液的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，属于生化药领域，主要涉及到L-赖氨酸的纯化及注射用腺苷蛋氨酸溶解剂的制备方法。本发明克服了传统L-赖氨酸纯化方法周期长、成本高、三废严重等弊病。此方法避免了高温的浓缩和干燥，保证了L-赖氨酸的含量和纯度。纯化中用到的强碱性阴离子交换树脂，需要处理成OH-型。以5-25％的赖氨酸盐酸溶液上样，收集穿过液即为溶解剂的原液。充氮气分装即得到目标溶液的小包装。该溶液在制备注射用腺苷蛋氨酸的实践中有广泛的应用前景。
【专利说明】一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生化药领域，涉及氨基酸的纯化技术。
【背景技术】
[0002]腺苷蛋氨酸是存在于动物组织和体液中的一种生理活性因子，它作为甲基供体(转甲基作用)和生理性巯基化合物(如半胱氨酸、牛磺酸、谷胱甘肽和辅酶A等)的前体(转硫基作用)参与体内重要的生化反应。在肝内，通过使质膜磷脂甲基化而调节肝脏细胞膜的流动性，而且通过转硫基反应可以促进解毒过程中硫化产物的合成。只要肝内腺苷蛋氨酸的生物利用度在正常范围内，这些反应就有助于防止肝内胆汁郁积。现已发现，肝硬化时肝腺苷蛋氨酸的合成明显下降，这是因为腺苷蛋氨酸合成酶(催化必需氨基酸蛋氨酸向腺苷蛋氨酸转化)的活性显著下降(-50% )所致。这种代谢障碍使蛋氨酸向腺苷蛋氨酸转化减少，因而削弱了防止胆汁郁积的正常生理过程。结果使肝硬化患者饮食中的蛋氨酸血浆清除率降低，并造成其代谢产物，特别是半胱氨酸、谷胱甘肽和牛磺酸利用度的下降。而且这种代谢障碍还造成高蛋氨酸血症，使发生肝性脑病的危险性增加。有研究证明体内蛋氨酸累积可导致其降解产物(如硫醇，甲硫醇)在血中的浓度升高，而这些降解产物在肝性脑病的发病机理中起重要作用。由于腺苷蛋氨酸以使巯基化合物合成增加，但不增加血循环中蛋氨酸的浓度，给肝硬化患者补充腺苷蛋氨酸可以使一种在肝病时生物利用度降低的必需化合物恢复其内源性水平。药用SAMe由德国基诺药厂首先生产(商品名:思美泰)并应用于临床，目前该药在意大利、西班牙、俄罗斯、法国等国主要用于治疗肝硬化前和肝硬化所致肝内胆汁郁积及妊娠性肝内胆汁郁积、药物性胆汁淤积、PBC、病毒性肝炎和酒精性胆汁淤积等肝病、胰腺 炎和抗抑郁。此外，该药还可有效预防和治疗各种器官移植术后的肝损害。
[0003]注射用腺苷蛋氨酸是以稳定的丁二磺酸盐的形式存在。现在市售注射用腺苷蛋氨酸丁二磺酸盐，是冻干粉针的形式，其溶液的PH值是1.0-2.0，无法直接注射使用，必须为每支粉针配一支PH值为10.0-10.6的L-赖氨酸(碱)溶液的专用溶解溶剂来中和腺苷蛋氨酸丁二磺酸盐，使其PH值达到6.0-8.0安全范围。
[0004]赖氨酸是构成蛋白质的基本单位，是合成人体激素、酶及抗体的原料，参与人体新陈代谢和各种生理活动，赖氨酸是人体必需氨基酸，在各种氨基酸输液配方中基本上都有。赖氨酸还可作为利尿药的辅助治疗剂，治疗因血中氯化物减少所致的铝中毒；可与酸(如水扬酸)作用生成盐，以减轻不良反应；与蛋氨酸合用能抑制重高血压病；同时赖氨酸也是优良的血栓预防剂。在其他用途如多肽合成化学、生化研究、赖氨酸衍生物制备等方面，L-赖氨酸的需求也日益增加。目前，L-赖氨酸一般以L-赖氨酸盐酸盐的形式供应市场，游离的L-赖氨酸极易潮解，因具有游离氨基而易发黄变质，并有刺激腥味，难于长期保存。L-赖氨酸盐酸盐则比较稳定,不易潮解,便于保存。但在临床应用上,如人体注射等赖氨酸盐酸盐不能完全取代赖氨酸发挥作用，所以获得高纯度且稳定的L-赖氨酸是非常必要的。
[0005]游离L-赖氨酸可由L-赖氨酸盐酸盐制备，目前国内L-赖氨酸的提取工艺普遍采用强阳离子交换法，也有少量研究用阴离子交换法，但都是需要吸附和洗脱两步，存在周期长、收率低、成本高、三废严重等弊病。且在浓缩和干燥过程中的高温加快了 L-赖氨酸碱的氧化。
[0006]文献报道过的L-赖氨酸的制备方法主要有:
[0007]英国曾经成功地开发了将胱氨酸发酵液通过732阳离子交换柱分离出精氨酸、组氨酸和赖氨酸的方法。
[0008]前苏联有过用732阳离子交换法从胱氨酸发酵液中提取精氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸的报道。
[0009]精细有机化学品技术手册(下册)，科学出版社，1992年第一版，1207页所述的赖氨酸制备方法是；赖氨酸盐酸盐溶液(PH2-3)上强阳离子交换柱,赖氨酸被吸附后用氨水洗脱，然后通过减压蒸馏方法除去多余的氨水进行浓缩。
[0010]陈金河和翁连进曾尝试过L-赖氨酸在pH 5~6之间上732阳离子交换树脂，结果吸附平衡时间为15min。
[0011]杨海燕和冯长根等研究过L-赖氨酸在强酸离子交换纤维上的吸附和解离情况。强酸离子交换纤维是一种纤维状的离子交换材料，它具有与732型树脂相同的官能团-S03H，因此也可用于氨基酸的吸附分离。自制的强酸离子交换纤维可用于赖氨酸的吸附、解吸。在pH值为7.0时，纤维对物质的量浓度为lmmol/L的赖氨酸静态吸附速度快于树脂。赖氨酸溶液的浓度影响纤维的吸附量，浓度越高，吸附量越大。本实验条件下，对于浓度为30mmol/L的上柱液，以pH值为2.0，上柱速度为25mL/min时效果较好。用0.1mol/L的氨水可将所吸附的赖氨酸充分地解吸下来。再生后的纤维仍具有很好的吸附性能。
[0012]现有腺苷蛋氨酸丁二磺酸盐专用溶解剂的制备方法:采用L-赖氨酸加氢氧化钠调PH值到10.0-10.6。游离的L-赖氨酸极易潮解,因具有游离氨基而易发黄变质,并有刺激腥味，难于长期保存，国内生产L-赖氨酸的厂家因采用阳离子树脂吸附赖氨酸、然后用解吸剂解吸树脂所吸附的赖氨酸的方法制备的，周期长、收率低、成本高，纯度较低。
【发明内容】
[0013]本发明克服上述方法的周期长、成本高、三废严重等弊病，且避免了浓缩和干燥过程中的高温，保证了 L-Lys的含量和纯度。
[0014]本发明与传统方法最大的区别在于是收穿过液，比传统吸附洗脱方法操作简单；另一区别在于无浓缩干燥的过程，保证了 L-1ys含量的纯度。
[0015]转化原理:一定浓度的赖氨酸盐酸盐在中性溶液状态下以带负电的氯离子和带正电的赖氨酸存在，氯离子竞争性的将强碱性树脂上的氢氧根离子置换下来，赖氨酸直接穿过。结果得到流出液即为除去氯离子的赖氨酸碱溶液。
[0016]树脂的预处理:为了将赖氨酸盐酸盐转化成赖氨酸碱，需要将树脂处理成OH-型。处理:a.1M氢氧化钠以I倍柱床体积每小时的流速流过树脂，共流过3倍柱体积，然后纯水冲洗至PH值小于9.0 ；b.1M盐酸以I倍柱床体积每小时的流速流过树脂,共流过3倍柱体积，然后纯水冲洗至PH值大于5.0 ；c.重复上述a的过程，最后用纯水冲洗至中性。
[0017]制备工艺过程:在0_20°C条件下，以5-25%的赖氨酸盐酸溶液上强碱性阴离子交换树脂，柱环境PH值6.5-7.5。上样和收峰流速为0.5倍柱床体积每小时，接8823B紫外检测仪210nm，收集0.2A档数字显示550以上的穿过液即为原液。原液纯度≤98%，PH在
10.0-10.7之间，收率≤80%，明显好于市售品和其他文献报道的结果。收取的穿过液，对浓度和PH值微调后，经过滤、充氮气、分装入安瓿瓶中(规格为5ml/支)，即得到注射用腺苷蛋氨酸溶解剂。
[0018]检测方法:米用高效液相法，用Supelcosil LC-SCX (250_X 4.6mm, 5 μ m)阳离子交换色谱柱，以0.05M磷酸二氢钾(用磷酸调pH值至3.5):乙腈(65: 35)作为流动相，流速:0.5ml/min,检测波长210nm。
[0019]本发明采取5-25%的赖氨酸盐酸盐上强碱性阴离子交换树脂(可选717型，但不仅限于该型)是参考进口注射用腺苷蛋氨酸(思美泰)溶解剂中L-赖氨酸的浓度标准，而且经试验证明，10-15 %的赖氨酸盐酸盐上样后，氯离子转化成氢氧根的转化率明显高于5%和25%的赖氨酸盐酸盐上样后转化率。
[0020]L-赖氨酸的等电点pi = 9.7，用阴离子交换树脂除去氯离子让L-赖氨酸穿过，则必须使溶液的pH低于于L-赖氨酸的等电点9.7，让赖氨酸带正电。根据L-赖氨酸的解离曲线和实验结果证明柱环境在6.5-7.5的条件下氯离子转化成氢氧根的转化率最高。
[0021]由于L-赖氨酸具有游离氨基而易发黄变质不耐高温，旋转蒸发浓缩过程中易分解产生杂质，而且旋蒸浓缩后样品变黄。所以在上样收峰过程应在低温环境中，为避免浓缩的过程仅收集0.2A档数字显示750以上的部分(8823B紫外检测仪，210nm)，可保证收峰浓度在85mg/ml左右，PH在10.0-10.7之间。这样不用经过旋转蒸发浓缩过程，直接可以分装，收率≤80%。
[0022]从收率和纯度两方面考虑0.5倍柱床体积每小时的上样流速比较合适。流速太快了会降低收率，流速太慢了收峰时间过长会降低纯度。
[0023]由于L-赖氨酸具有游离氨基而易发黄变质，稳定性差，所以在分装(可选但不仅限于安瓿)时进行充氮气保护，减少L-赖氨酸与氧气的接触，提高了制剂的稳定性。分装时L-赖氨酸的浓度为84_86mg/ml, PH10.5。
[0024]全检溶解剂各项均合格，纯度明显高于市售思美泰样品。用溶解剂来溶解市售思美泰冻干粉针，结果混合溶液的PH为7.3左右，符合思美泰标准6.0-8.0。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1.过柱前L-Lys盐酸盐高效液相图谱(图上约10.8min位置为主峰，纯度为87.4% )
[0026]图2.过柱后L-Lys碱高效液相图谱(图上约10.8min位置为主峰，纯度为99.5% )
【具体实施方式】
[0027]根据本发明，一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法显示在下文中，实施例更为详尽地描述了本发明，但并不限制本发明。
[0028]实施例1
[0029]填料处理:称取5Kg717型强阴离子交换树脂，先用30_40°C纯水反复清洗，至泡沫消失；lMNaOH，以1-1.5倍柱床体积每小时的流速流过柱床，共流3倍柱床体积。然后用水冲洗至PH9.0以下；IMHCL以1_1.5倍柱床体积每小时的流速流过柱床，共流3倍柱床体积。然后用水冲洗至PH5.0以上；lMNaOH，以1-1.5倍柱床体积每小时的流速流过柱床，共流4倍柱床体积。然后用水冲洗至PH中性。
[0030]上样量:1L717强阴离子交换树脂能上110_120g L-赖氨酸盐酸盐。
[0031]上样流速:0.5倍柱床体积每小时。
[0032]上样过程:柱填料用纯水冲洗至PH6.5-7.5后，准备上样。称取L-赖氨酸盐酸盐850g，加纯水至8.5L，搅拌使溶解。以3.75L/h的流速上样，样品上完后用纯化水冲洗，流速同上样。 [0033]收峰；收流穿液，收峰速度同上样速度。接上210nm检测仪，0.2A档显示750以上开始收集，750以下停止收集。收集的流穿液赖氨酸碱含量84-87mg/ml，PH在10.0-10.7之间，即为L-赖氨酸碱溶液。
[0034]实施例2
[0035]实施例1中收到的L-赖氨酸碱溶液检测浓度和PH后交到百级配液间。将PH微调至10.5，浓度调至86!^/!111。然后用0.45和0.22微米的尼龙膜过滤除菌。配液好的半成品检测内毒素含量合格后进行分装安瓿。分装量为5.2ml/支，封装过程充氮气保护。分装后的样品经检漏等成品检测合格后，即得到目标溶液的小包装。
[0036]实施例3
[0037]实施例2中得到的样品，检测纯度为99.0%明显高于市售思美泰样品87.9%的纯度；浓度、渗透压和PH值与市售思美泰基本一致；用溶解剂来溶解市售思美泰注射用腺苷蛋氨酸冻干粉针，结果混合溶液的PH为7.34，符合思美泰标准。
【权利要求】
1.一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，其特征在于:在低温环境下，赖氨酸盐酸盐溶液上阴离子交换树脂，使赖氨酸盐酸盐转化为L-赖氨酸(碱)流出树脂柱，收集穿过液，即为L-赖氨酸碱的原液，原液调整浓度和PH后，在充氮气的条件下分装入安瓿瓶中，即得到注射用腺苷蛋氨酸溶解剂。
2.权利I中所述的一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，其一个特征是:环境温度为0-20。。。
3.权利I中所述的一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，其又一个特征是:上样前应将柱环境PH值调整为低于9.7。
4.权利I中所述的一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，其又一个特征是:上样前柱环境PH值6.5-7.5效果最好。
5.权利I中所述的一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，其再一个特征是:使用的阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂。
6.权利I中所述的一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，其又一个特征是:使用的强碱性阴离子交换树脂必须经预处理后使树脂带-OH根。
7.权利I中所述的一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，其又一个特征是:使用的强碱性阴离子交换树脂最优选的为717型。
8.权利I中所述的一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，其又一个特征是:上样前赖氨酸盐酸盐溶液的浓度应为5-25%。
9.权利I中所述的一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，其又一个特征是:赖氨酸盐酸盐溶液的浓度在10-15%上样`时收率更高，最优选为10%。
10.权利I中所述的一种新的L-赖氨酸碱溶液的制备方法，其又一个特征是:在制备注射用腺苷蛋氨酸溶解剂中的应用。
【文档编号】C07C227/18GK103787904SQ201210429364
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月1日 优先权日:2012年11月1日
【发明者】秦富景, 陈献华, 贾东晨, 王俊玲, 吴彦卓, 徐明波 申请人:北京双鹭药业股份有限公司, 北京双鹭生物技术有限公司