专利名称：壳聚糖在卵黄脂肪沉淀脱脂技术中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及壳聚糖在卵黄脂肪脱脂技术中的应用。
背景技术：
禽卵黄抗体是禽类B淋巴细胞在抗原物质刺激下所产生并沉积在卵黄中的一种蛋白质，主要成分为免疫球蛋白IgY (Immunoglobulin of yolk),由禽类血清免疫球蛋白转移而来，功能上相当于哺乳动物IgG (Immunoglobulin G),结构上具有典型的免疫球蛋白空间构象，但不含绞链区。与哺乳动物免疫球蛋白IgG相比，禽类卵黄抗体具有很多优越性其一，由于禽类与哺乳动物种系发生学的距离，禽类免疫球蛋白IgY不会激活哺乳动物的补体系统，不与哺乳动物免疫球蛋白IgG细胞表面Fe受体结合，更适合于生产用于检测哺乳动物抗原的特异性抗体，在免疫检测与诊断中具有重要意义；其二，禽类免疫球蛋白IgY具有较高的稳定性，耐酸，耐碱，耐热，耐冷藏，抗反复冻融，抗胃蛋白酶降解，方便生产、 加工、储存和运输，还可用于幼龄动物的经口给服；其三，卵黄中抗体浓度能长期维持或超过血清中抗体浓度，产量高，成本低，便于规模化生产；其四，从禽类卵黄中制备抗体可免去动物采血，符合现代动物保护规则，降低劳动成本；其五，产生有效免疫反应所需抗原量少，尤其是对高度保守的哺乳动物蛋白质。作为一种高产优质的多克隆抗体，卵黄抗体IgY具有十分广泛的用途和良好的开发应用前景，可以应用于人类和畜禽多种疾病的临床治疗、诊断和预防，可以作为免疫检测工具应用于生物科学研究，可以用作饲料添加剂、保健品和无公害防腐剂等等。近年来，用卵黄生产制备多克隆抗体的技术已逐渐兴起。除水分外，卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例约为I :2，其中大部分蛋白为脂蛋白，不溶于水，虽然免疫球蛋白IgY是水溶的，但在卵黄中它与脂类、磷蛋白等形成稳定的乳化状态。所以，提取卵黄抗体IgY首先必须将卵黄中脂类组分和水溶性组分(蛋白)进行分离，即进行卵黄脱脂处理。IgY的分离纯化曾一度成为难题，主要困难就在于如何去除高浓度的脂类。自从20世纪60年代Williams发现卵黄中存在大量的抗体以来，用于提取卵黄抗体的卵黄脱脂技术就得到了关注。1980年Polson等(Immunol Commun (Invest),1980,9 (5) : 475-493 )首先提出聚乙二醇沉淀法，1990年又改良为氯仿沉淀法(ImmunoIInvest, 1990，19 (3):253-258)。1981 年 Jensenius 等(Journal of ImmunologicalMethods, 1981, 46:63-68)提出硫酸葡聚糖沉淀法。1984 年 Bade 和 Stegemann (JImmunol Methods, 1984，72 (2) :421-426)用预冷的异丙醇和丙酮沉淀蛋白并去除脂类。1988年Hatta等(J Food Sci，1988，53 (2) : 425-427)用海藻酸钠分离卵黄脂蛋白和水溶性组分，1990年又通过比较几种天然树胶的脱脂效果提出K-角叉藻聚糖法和黄原胶法，K-角叉藻聚糖脱脂效果较好但免疫球蛋白产量不如黄原胶(Agric BiolChem, 1990，54(10):2531-2535)。1992 年 Akita 等(J. Food Sci.，1992，(57):629-634)最早采用水稀释法，并于1993年比较了水稀释法、聚乙二醇法、硫酸葡聚糖法和黄原胶法的提纯效果，结果表明水稀释法产量最高，依次为硫酸葡聚糖法、黄原胶法和聚乙二醇法(J Immunol Methods, 1993，160 (2) : 207-214)。但水稀释法用水量较大(10倍稀释)且操作繁琐。1993 年 Horikoshi 等(Journal of Food Science. 1993, 58(4) :739742)报道了冷乙醇法，但免疫球蛋白得率仅40%，且耗能高。1994年McLaren等(J ImmunolMethods, 1994，177:175-184)提出了辛酸法。2000 年 Deigan (Food and AgriculturalImmunology, 2000, 12:77-85)在比较了 5种脱脂方法后，提出了他认为简单而经济的反复冻融法，但其产率低于硫酸葡聚糖法近20% ;同年，Bizhanov等(Vet ResCommun, 2000, 24(2) : 103-113)采用蓝色葡聚糖法获得与聚乙二醇法相当的产率。2004年徐锡殿等(山东家禽，2004， 2:10-11)报道了泊洛沙姆对鸡卵黄的脱脂作用。2009年邓碧华(动物医学进展，2009, 30(1) :38-40)比较了泊洛沙姆和聚乙二醇的脂脱效果，认为二者没有明显区别，当浓度过高时都破坏抗体蛋白的水化膜从而影响抗体效价，且泊洛沙姆成本高于聚乙二醇。2011年张伦等(中国动物检疫，2011，28(3) :49-51)进行了泊洛沙姆一辛酸法对鸡卵黄脱脂条件的研究，发现随辛酸浓度加大蛋白回收率和抗体效价都逐渐降低。2012年吴博等(中国兽药杂志，2012，46(6) :42-45)比较了五种提取卵黄抗体的方法，回收率从高到低依次为辛酸法、酚沉淀法、水稀释法、乙酸一乙酸钠法和海藻酸钠法，但所得卵黄抗体效价从高到低依次为辛酸法、海藻酸钠法、水稀释法、酚沉淀法和乙酸一乙酸钠法。1995年，公开号为CN1117974A的中国专利公开了一种提取卵黄中抗体的新方法-甲醛脱脂法；1998年，公开号为CN1202496A的中国专利公开了一种利用苯酚使卵黄溶液破乳的苯酚脱脂法。但上述方法存在以下问题使用大量无机或有机试剂，甚至有毒有机溶剂，有毒有害试剂的残留很难去除；脱脂的同时也消耗蛋白，IgY损失率高，甚至会导致抗体失活；需要使用大量仪器设备，增加了脱脂成本。于是，脱脂剂无毒、无害且仪器设备使用量少以减少脱脂成本等成为卵黄脱脂技术追求的目标。公开号为CN101225103A的中国专利公开了卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，安全、无毒，不使用大型仪器设备，但该方法使用的脱脂剂为聚乙二醇，利用的是聚乙二醇的强吸水能力打破卵黄的乳化状态，脱脂试剂使用量较大，IgY损失率较高。
发明内容
本发明的目的在于提供壳聚糖的新用途，即壳聚糖在卵黄脂肪沉淀脱脂技术中的应用，通过对壳聚糖进行了卵黄脂肪沉淀脱脂的实验研究，并对不同壳聚糖浓度的脱脂效果进行了研究，为壳聚糖更好地应用提供了理论依据。本发明是这样构成的壳聚糖在卵黄脂肪沉淀脱脂技术中的应用。所述的应用，其方法为对壳聚糖或壳聚糖溶液与卵黄原液或卵黄稀释液的混合溶液进行机械搅拌，使卵黄中的脂类组分与卵黄中的水溶性组分分离，再静置沉淀和/或离心分离，使卵黄脂类组分凝集沉淀。所述的应用，其具体方法为在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，取卵黄原液，加水、生理盐水或酸性溶液做η倍稀释，制成卵黄稀释液，然后将壳聚糖用水或酸性溶液进行溶解，制成m倍体积的壳聚糖溶液，将卵黄稀释液与壳聚糖溶液混合得到混合溶液，充分搅拌混匀，静置沉淀和/或离心分离，底部沉淀即为卵黄脂类组分，上清液为水溶性组分，即富含卵黄抗体免疫球蛋白IgY和其它蛋白的混合溶液，其中0〈n< 10，100〈m ( 10000。
所述的应用，另一种具体方法为在4 50°C环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后,打破卵黄膜，取卵黄原液，加水、生理盐水或酸性溶液做η倍稀释制成卵黄稀释液，然后与壳聚糖混合得到混合溶液，充分搅拌混匀，静置沉淀和/或离心分离，底部沉淀即为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即富含卵黄抗体免疫球蛋白IgY和其它蛋白的混合溶液，其中0<η ≤10。所述的应用，又一种具体方法为在4 50°c环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后,打破卵黄膜，取卵黄原液，然后将壳聚糖用水或酸性溶液进行溶解，制成m倍体积的壳聚糖溶液，将卵黄原液与壳聚糖溶液混合得到混合溶液，充分搅拌混匀，静置沉淀和/或离心分离，底部沉淀即为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即富含卵黄抗体免疫球蛋白IgY和其它蛋白的混合溶液，其中100〈m≤10000。所述的应用，又一种具体方法为在4 50°c环境中,将卵黄从鸡蛋中取出后,打破卵黄膜，取卵黄原液，将卵黄原液与壳聚糖混合，然后向卵黄原液和壳聚糖混合物中加水、生理盐水或酸性溶液做η倍稀释得到混合溶液，充分搅拌混匀，静置沉淀和/或离心分离，底部沉淀即为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即富含卵黄抗体免疫球蛋白IgY和其它蛋白的混合溶液，其中0〈η ( 10。所述的混合溶液中，壳聚糖与混合溶液的重量体积比(w/v)为O. 000Γ0. 005。所述的静置沉淀的时间为O. 5 48h。所述的离心分离的离心速率为4000 12000rpm/min,离心时间为I lOmin。本发明中的壳聚糖，是由自然界中广泛存在的几丁质(又名甲壳素)经过脱乙酰作用而成，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡聚糖，具有较好的生物相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能，已广泛应用于医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域。壳聚糖在1%乙酸或盐酸中溶解度大于1%。壳聚糖在酸性溶液中可吸附脂类物质并发生沉淀。一般认为，壳聚糖吸附油脂的机理是通过自身的氨基与脂肪酸的羧基发生静电桥联作用。本发明的要点在于将壳聚糖作为脱脂剂应用在卵黄脂肪沉淀脱脂技术中，利用机械搅拌和壳聚糖对脂类的吸附能力从而打破卵黄的乳化状态，使卵黄中的脂类组分与水溶性组分分离，从而达到卵黄脱脂的目的。与现有技术相比，本发明具有以下优点(I)本发明对已知化合物壳聚糖发掘了新的用途，开拓了一个新的应用领域，效果可靠，简单易行；(2)本发明脱脂完全、脱脂效率高，安全，无毒，对卵黄蛋白成分的影响较小，IgY损失少；( 3 )本发明对环境条件要求低，应用过程无需大型设备仪器，且试剂用量少，费用、成本低；(4)本发明既适合于实验室制备制备卵黄抗体和纯化免疫球蛋白，也适合于企业大规模批量生产。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的应用范围不限于如下实施例。实施例I在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，量取卵黄原液100ml，置于500ml烧杯中。精确称取O. 4g壳聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，搅拌至完全溶解得到壳聚糖溶液，然后将壳聚糖溶液倒入卵黄原液中并混匀，静置沉淀24h。沉淀后的混合液分为两层，底部沉淀为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即含免疫球蛋白IgY的混合溶液。实施例2在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，量取卵黄原液100ml，置于500ml烧杯中，并添加IOOml蒸馏水稀释，混匀，制成卵黄稀释液。精确称取O. 6g壳聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，搅拌至完全溶解。将壳聚糖溶液倒入卵黄稀释液中充分搅拌混匀，然后液静置沉淀3h。沉淀后的混合液分为两层，底部沉淀为卵黄脂类组分，上 清液为卵黄水溶性组分，即免疫球蛋白IgY与其他蛋白的混合溶液。实施例3在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，量取卵黄原液100ml，加入O. 8g壳聚糖、300ml的1%(V/V)醋酸溶液，充分搅拌，然后将混合液静置沉淀过夜。沉淀后的混合液分为两层，底部沉淀为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即免疫球蛋白IgY与其他蛋白的混合溶液。实施例4在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，量取卵黄原液100ml，置于500ml烧杯中，然后添加300ml的1%(V/V)醋酸溶液、O. Sg壳聚糖，充分搅拌混匀，然后静置沉淀30min，8000转/分离心5分钟。沉淀后的溶液分为两层，底部为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即免疫球蛋白IgY与其他蛋白的混合溶液。实施例5在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，量取卵黄原液100ml，置于500ml烧杯中，并添加200ml生理盐水稀释，混匀，制成卵黄稀释液。精确称取I. Og壳聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，搅拌至完全溶解。将IOOml壳聚糖溶液倒入卵黄稀释液中充分搅拌混匀，然后静置沉淀18h。沉淀后的混合液分为两层，底部沉淀为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即免疫球蛋白IgY与其他蛋白的混合溶液，具体见表I、表2。实施例6在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，量取卵黄原液100ml，置于500ml烧杯中，并添加200ml生理盐水稀释，混匀，制成卵黄稀释液。精确称取O. 5g壳聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，搅拌至完全溶解。将IOOml壳聚糖溶液倒入卵黄稀释液中充分搅拌混匀，然后静置沉淀18h。沉淀后的混合液分为两层，底部沉淀为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即免疫球蛋白IgY与其他蛋白的混合溶液，具体见表I、表2。实施例7在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，量取卵黄原液100ml，置于500ml烧杯中，并添加200ml生理盐水稀释，混匀，制成卵黄稀释液。精确称取O. 25g壳聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，搅拌至完全溶解。将IOOml壳聚糖溶液倒入卵黄稀释液中充分搅拌混匀，然后静置沉淀18h。沉淀后的混合液分为两层，底部沉淀为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即免疫球蛋白IgY与其他蛋白的混合溶液，具体见表I、表2。实施例8在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，量取卵黄原液100ml，置于500ml烧杯中，并添加200ml生理盐水稀释，混匀，制成卵黄稀释液。精确称取O. 125g壳聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，搅拌至完全溶解。将IOOml壳聚糖溶液倒入卵黄稀释液中充分搅拌混匀，然后静置沉淀18h。沉淀后的混合液分为两层，底部沉淀为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即免疫球蛋白IgY与其他蛋白的混合溶液，具体见表I、表2。实施例9在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，量取卵黄原液100ml，置于500ml烧杯中，并添加200ml生理盐水稀释，混匀，制成卵黄稀释液。精确称取O. 0625g壳聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，搅拌至完全溶解。将IOOml壳聚糖溶液倒入卵黄稀释液中充分搅拌混匀，然后静置沉淀18h。沉淀后的混合液分为两层，底部沉淀为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即免疫球蛋白IgY与其他蛋白的混合溶液，具体见表I、表 2。对比例I在4 5(TC环境中，将卵黄从鸡蛋中取出后，打破卵黄膜，量取卵黄原液100ml，置于500ml烧杯中，并添加200ml生理盐水稀释，混匀，制成卵黄稀释液。精确称取O. 3125g壳聚糖溶于IOOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，搅拌至完全溶解。将IOOml壳聚糖溶液倒入卵黄稀释液中充分搅拌混匀，然后静置沉淀18h。沉淀后的混合液分为两层，底部沉淀为卵黄脂类组分，上清液为卵黄水溶性组分，即免疫球蛋白IgY与其他蛋白的混合溶液，具体见表
I、表 2。表I壳聚糖浓度对卵黄脱脂效果的影响
权利要求
1.壳聚糖在卵黄脂肪沉淀脱脂技术中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，对壳聚糖或壳聚糖溶液与卵黄原液或卵黄稀释液的混合溶液进行机械搅拌，使卵黄中的脂类组分与卵黄中的水溶性组分分离，再静置沉淀和/或离心分离，使卵黄脂类组分凝集沉淀。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的混合溶液中，壳聚糖与混合溶液的重量体积比为O. 000Γ0. 005。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的静置沉淀的时间为O.5 48h。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的离心分离的离心速率为4000 12000rpm/min,离心时间为 I lOmin。
全文摘要
本发明公开了一种壳聚糖在卵黄脂肪沉淀脱脂技术中的应用。该应用的方法为对壳聚糖或壳聚糖溶液与卵黄原液或卵黄稀释液的混合溶液进行机械搅拌，使卵黄中的脂类组分与卵黄中的水溶性组分分离，再静置沉淀和/或离心分离，使卵黄脂类组分凝集沉淀。本发明对已知化合物壳聚糖发掘了新的用途，开拓了一个新的应用领域，效果可靠，简单易行；本发明脱脂完全、脱脂效率高，安全，无毒，对卵黄蛋白成分的影响较小，IgY损失少；本发明对环境条件要求低，应用过程无需大型设备仪器，且试剂用量少，费用、成本低；本发明既适合于实验室制备制备卵黄抗体和纯化免疫球蛋白，也适合于企业大规模批量生产。
文档编号C07K1/30GK102924593SQ20121047689
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者梁永利, 周东顺, 吕素军, 金东庆, 王可洲 申请人:梁永利