专利名称：禽蛋中卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法
技术领域：
本发明涉及食品工程技术领域，特别是涉及一种禽蛋中卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法。
背景技术：
PVS即卵黄高磷蛋白是蛋黄中主要的磷蛋白，约占蛋黄蛋白质的7%，有a-PVS(37、42和45Ku)和β-PVS (45Ku)两种，其中β-PVS含量较a-PVS多，卵黄高磷蛋白具有独特的物化特性，其分子中磷的含量约10%，是已知蛋白质中磷酸化程度最高的，主要原因在于其分子中约50%的氨基酸残基是丝氨酸残基，且90%丝氨酸残基被磷酸化，正是由于其高度磷酸化性质，使其具有很强的乳化性、抗氧化性、杀菌性以及金属离子螯合力(蛋黄中所含的约95%的铁离子与其结合)，可应用于制药、食品以及化妆品等诸多领域。卵黄高磷蛋白最早是由Mecham和Olcott从鸡蛋黄中分离出来。经过半个多世纪的发展，现有的分离方法主要有盐沉淀法、盐浸提法、膜分离技术以及利用具有亲和活性的铁系无机纳米材料来富集卵黄高磷蛋白，其纯化方法都是采用色谱技术。1986年，WalIace和Morgan利用水溶液来提取卵黄高磷蛋白，其后的纯化采用疏水作用色谱。尽管获得了很高的纯度，但其分离方法繁琐，得率仅为O. 96% (占蛋黄干重)。1994年，Losso和Nakai在此基础上建立了一种更为简便的盐浸提方法，但其过程费时费力，大量使用有机溶剂(正己烷)，影响到最终产品的生物安全性。2003年，Castellani等利用卵黄高磷蛋白可以与镁离子形成沉淀的特性来提取该蛋白质，所得蛋白质纯度仅为85%，后续纯化采用阴离子高效液相色谱得到高纯度的卵黄高磷蛋白，但该技术不适于扩大规模生产。2007年，徐芳等人用具有铁原子亲和活性位点的铁系无机纳米材料与粗制卵黄脂蛋白相互作用，得到特异性吸附有卵黄高磷蛋白的铁系纳米材料，最后经煮沸处理得到卵黄高磷蛋白。与传统技术比，该发明操作过程简单，但是纳米材料价格昂贵，其最后的纯度也仅有80%。2010年，日本和加拿大的研究人员尝试使用膜超滤法来大规模富集卵黄高磷蛋白，并同时达到脱盐的目的。尽管该方法简单易行，但其终产品纯度不高，N/P比最高仅为
6.64，与sigma标准品的2. 49相差甚远。2011年，Ko等利用乙醇脱脂，10%的NaCl或(NH4)SO4来大规模提取卵黄高磷蛋白，回收率高达97%，整个分离过程可在一天内完成。尽管文献提到其蛋白质含量大于85%，但是其检测方法使得检测结果不准确文献中使用的是6. 25这样一个总氮含量转换系数，因卵黄高磷蛋白中含有大量的磷，因此，并不能确切的表明其纯度。而按照Ko的方法经过多次实验制备的卵黄高磷蛋白，采用比较科学的N/P的表示方法，其N/P比只有4. 44，仍需要进一步的纯化，不足以应用于食品医药等对纯度要求较高的行业。2012年，加拿大学者Bo等人直接利用阴离子交换色谱法来纯化卵黄高磷蛋白，获得了很高的纯度(N/P比为2. 5)但回收率仅为35. 4%,另外所使用的昂贵的高效液相色谱仪限制了其在食品工业上的应用
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种可直接在食品、医药等纯度要求较高的行业应用，所得产品纯度高，操作简单，易于产业化生产的禽蛋中卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法。为实现本发明的目的所采用的技术方案是—种禽蛋中卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤( I)取禽蛋中的卵黄去除水溶性物质，采用乙醇脱脂后，用高浓度盐溶液浸提得到卵黄闻憐蛋白粗品；(2)利用阴离子交换层析法纯化上述卵黄高磷蛋白粗品并除盐，得到高纯度的卵黄闻憐蛋白。所述卵黄去除水溶性物质的过程为取禽蛋中的卵黄加入1-3倍体积(w/v)、温度为l-10°c的去离子水，在l-10°c低速搅拌O. 5-2h;然后在l-10°c、4000-6000Xg离心10-30min,弃掉含有水溶性物质的上清液，取沉淀得到粗制卵黄脂蛋白。 所述乙醇脱脂的过程为向粗制卵黄脂蛋白中加入3-6倍体积(w/v)的乙醇，3000-6000rpm均质 l_5min，然后在 1_10°C、4000-6000 X g离心 10_30min，取沉淀，重复上述脱脂过程1-3次，得到脱脂后的卵黄脂蛋白；所述乙醇浓度为60-90%。所述高浓度盐溶液浸提的过程为用5-15倍体积(w/v)、浓度为8-12%的盐溶液浸提上述脱脂后的卵黄脂蛋白，并用HCl溶液调节pH值为3. 0-7. 0，于1-10°C搅拌O. 5_2h，然后在l-10°C、4000-6000Xg离心10_30min，弃沉淀取含有卵黄高磷蛋白的上清液，将含有卵黄闻憐蛋白的上清液脱盐冻干，得到卵黄闻憐蛋白粗品。所述盐溶液为NaCl溶液或(NH4) 2S04溶液。所述阴离子交换层析法包括下述步骤a、将卵黄高磷蛋白粗品溶于pH值为5. 0-7. 0、20-50mmol/L含NaCl的平衡缓冲液，至卵黄高磷蛋白终浓度为10_50mg/mL，得到卵黄高磷蛋白溶液；b、将上述卵黄高磷蛋白溶液以恒定流速加入装有阴离子交换树脂且已用平衡缓冲液平衡的层析柱内，然后再以平衡缓冲液洗脱层析柱；C、采用pH值为5.0-7.0、20-50mmol/L含NaCl的洗脱液进行一步洗脱，收集洗脱峰，透析冻干后得到高纯度的卵黄高磷蛋白；所述洗脱峰是指在PH值为5. 0-7.0、20-50mmol/L且NaCl浓度为O. 5-1. OmoI/L的洗脱液下紫外吸收峰对应的流出液。所述平衡缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾或乙酸-乙酸钠缓冲液，所含NaCl的浓度为O. 2-0. 4mol/L。所述洗脱液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾或乙酸-乙酸钠缓冲液。所述阴离子交换树脂为指交联葡聚糖系、琼脂糖系或大孔苯乙烯系。所述高纯度的卵黄高磷蛋白，经SDS-PAGE电泳鉴定，主要条带有三条，符合该蛋白质的电泳图谱特征，其N/P摩尔比为2. 78，接近于sigma标准品的N/P (2. 49)，回收率57. 6%，直接证明了本方法的有效性。与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明的方法采用阴离子交换层析法对卵黄高磷蛋白粗品进行纯化，因卵黄高磷蛋白含有大量的磷酰丝氨酸残基，在大于其等电点的PH条件下，所带的净负电荷要远高于卵黄中其它的蛋白质。在pH值为5-7的条件下，卵黄高磷蛋白带有大量的净负电荷，同其它带有净负电荷的蛋白质吸附在层析柱上，而带有净正电荷的蛋白质会直接穿柱而出。本发明通过调整平衡缓冲液中NaCl的浓度，可以使那些吸附作用弱的杂蛋白随同平衡缓冲液一起流出，而留在柱子上的则是吸附作用强的卵黄高磷蛋白，然后通过一步洗脱便可得到纯度较高的卵黄高磷蛋白。本发明的方法通过各个参数的选择和合理的工艺路线的确定，与传统工艺中的连续梯度洗脱相比，本发明采用单一洗脱液一步洗脱，简化了生产工艺，所得产品的纯度高，产率得到了很大的提升。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。实施例II、卵黄高磷蛋白的分离鲜鸡蛋蛋黄8个(共112g)加2倍体积温度为4°C的去离子水于4°C下低速搅拌lh，然后在4000Xg、4°C条件下离心30min，弃上清液取沉淀得到粗制卵黄脂蛋白。所得沉淀加入4倍体积(w/v)80%的乙醇后3000rpm条件下均质2min，在4000 X g、4°C条件下再离心lOmin，取沉淀重复上述脱脂过程3次，所得沉淀为脱脂后的卵黄脂蛋白。所得沉淀用9倍体积10%的NaCl溶液浸提，并用HCl溶液调节pH值至4. 0，于4°C下搅拌30min后在4000Xg、4°C条件下离心30min,弃沉淀取上清液。上清液再经透析、冻干得卵黄高磷蛋白粗品(Ρ\)2. 335g，利用凯氏定氮法测定氮含量和蛋白质含量，采用钥蓝法测磷含量，经测定计算得蛋白质含量63. 04%，磷含量(百分比)为5. 629%，N/P为3. 967，回收率为97. 80%，得率为2. 08%ο2、卵黄高磷蛋白的纯化Q Sepharose FF (QSFF)离子交换层析纯化卵黄高磷蛋白粗品层析所采用层析柱规格为01. O cmx IOcmjQ Sepharose FF强碱型阴离子交换树脂填充高度为8cm，平衡缓冲液为NaAc/HAc (20mM、pH值为5. O,NaCl的浓度为O. 3mol/L)，使用前用该平衡缓冲液平衡层析柱。将步骤I所提取的卵黄高磷蛋白粗品I. OOg溶于平衡缓冲液中，配成卵黄高磷蛋白浓度为lOmg/mL的得到卵黄高磷蛋白溶液，然后以lmL/min的速度用恒流泵加所配溶液3mL于层析柱内，再使用平衡缓冲液洗脱层析柱，最后采用NaCl浓度为O. 6mol/L的NaAc/HAc (20mM、pH值为5. O)作为洗脱液进行一步洗脱，流速lmL/min，收集该洗脱液下紫外光对应的洗脱峰，透析冻干后得到纯化后的卵黄高磷蛋白O. 277g，经测量计算后得蛋白质含量85. 30%，磷含量(百分比)为10. 79%, N/P为2. 80，回收率57. 34%，得率O. 64%。实施例2I、卵黄高磷蛋白的分离。鲜鸡蛋蛋黄5个(共80g)，加3倍体积温度为10°C的去离子水于10°C下低速搅拌30min,然后在4500 X g、10°C条件下离心20min,弃上清液取沉淀得到粗制卵黄脂蛋白。所得沉淀加入5倍体积(w/v)85%的乙醇后4000rpm条件下均质Imin,在4500 X g、10°c条件下再离心lOmin，取沉淀重复上述脱脂过程2次，所得沉淀为脱脂后的卵黄脂蛋
白。·
所得脱脂沉淀用10倍体积9%的NH4SO4溶液浸提，并用HCl溶液调pH值至5. 0，于10°C下搅拌Ih后在4500Xg、10°C条件下离心20min，弃沉淀取上清液。上清液再经透析、冻干得卵黄高磷蛋白粗品(PVi) I. 998g，利用凯氏定氮法测定氮含量和蛋白质含量，采用钥蓝法测磷含量，经测定计算得蛋白质含量58. 75%，磷含量(百分比)为4. 49%，N/P为4. 64，回收率93. 40%,得率2. 50%ο2、卵黄高磷蛋白的纯化。QAE Sephadex A-25离子交换层析纯化卵黄高磷蛋白层析所采用层析柱规格为
02.O cmx 20cm, QAE Sephadex A-25阴离子交换树脂填充高度为18cm，平衡缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(50mM、pH值为7. O、NaCl的浓度为O. 2mol/L),使用前用该平衡缓冲液平衡层析柱。将步骤I所提取卵黄高磷蛋白粗品I. OOg溶于平衡缓冲液中，配成卵黄高磷蛋白 浓度为20mg/mL的卵黄高磷蛋白溶液，然后以2mL/min的速度用恒流泵加所配溶液50mL于层析柱内，再使用平衡缓冲液洗脱层析柱，最后采用NaCl浓度为O. 6mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸(50mM、pH值为7. O)作为洗脱液进行一步洗脱，流速为2mL/min，收集该洗脱液下的紫外光对应的洗脱峰，透析冻干后得到纯化后的卵黄高磷蛋白O. 567g，经测量计算后得蛋白质含量84. 90%，磷含量(百分比)为10. 74%，N/P为2. 73，回收率56. 70%，得率O. 64%。实施例3I、卵黄高磷蛋白的分离。鲜鸡蛋蛋黄7个(共103g)，加I倍体积温度为4°C的去离子水于4°C下低速搅拌
I.5h,然后在5000Xg、8°C条件下离心IOmin,弃上清液取沉淀得到粗制卵黄脂蛋白。所得沉淀加入3倍体积(w/v)75%的乙醇后5000rpm条件下均质Imin,在5000 X g、8°C条件下再离心lOmin，取沉淀重复上述脱脂过程I次，所得沉淀为脱脂后的卵黄脂蛋白。所得脱脂沉淀用11倍体积12%的NaCl溶液浸提，并用HCl溶液调pH值至6. O，于8°C下搅拌IOmin后在5000 X g、8°C条件下离心IOmin,弃沉淀取上清液。上清液再经透析、冻干得卵黄高磷蛋白粗品(PVi) 2. 459g，利用凯氏定氮法测定氮含量和蛋白质含量，采用钥蓝法测磷含量，经测定计算得蛋白质含量63. 29%，磷含量(百分比)为4. 76%，N/P为4. 71，回收率94. 70%，得率2. 39%ο2、卵黄高磷蛋白的纯化。D301大孔树脂交换层析纯化卵黄高磷蛋白，层析所采用层析柱规格为02. OX 20cni,D3Ol交换树脂填充高度为18cm，平衡缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(50mM、pH值为6. O、NaCl的浓度为O. 3mol/L)。使用前用该平衡缓冲液平衡层析柱。将步骤I所提取卵黄高磷蛋白粗品I. OOg溶于平衡缓冲液中，配成卵黄高磷蛋白浓度为50mg/mL的卵黄高磷蛋白溶液，然后以2mL/min的速度用恒流泵加所配溶液20mL于层析柱内，再使用平衡缓冲液洗脱层析柱，最后采用NaCl浓度为O. 7mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(50mM、pH值为6. O)作为洗脱液进行一步洗脱，流速2mL/min，收集该洗脱液下紫外光对应的的洗脱峰，透析冻干后得到纯化后的卵黄高磷蛋白O. 586g，经测量计算后得蛋白质含量86. 78%，磷含量(百分比)为10. 98%，N/P为2. 81，回收率58. 60%，得率
O.65%。本发明与传统技术相比，采用改进后的利用廉价无毒的乙醇和盐提取卵黄高磷蛋白的方法，不仅避免采用非食品级的有机溶剂实现卵黄高磷蛋白与脂质的分离，而且其很高的卵黄高磷蛋白回收率为下一步的纯化奠定了良好的基础。介于上一步产品中，卵黄高磷蛋白纯度偏低(N/P比为4. 44)，不足以应用于食品医药等对纯度要求较高的行业，采用阴离子交换树脂纯化卵黄高磷蛋白，大幅提高了卵黄高磷蛋白的纯度(N/P比为2. 73、
2.81、2. 80)，而且其回收率也较高。本工艺各环节操作简单，设备成本低廉，易于实现产业化生产，所得卵黄高磷蛋白可直接用于食品医药行业。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种禽蛋中卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)取禽蛋中的卵黄去除水溶性物质，采用乙醇脱脂后，用高浓度盐溶液浸提得到卵黄闻憐蛋白粗品； (2)利用阴离子交换层析法纯化上述卵黄高磷蛋白粗品并除盐，得到高纯度的卵黄高憐蛋白。
2.根据权利要求I所述的卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法，其特征在于，所述卵黄去除水溶性物质的过程为取禽蛋中的卵黄加入1-3倍体积(w/v)、温度为1-10°C的去离子水，在1-10°C低速搅拌O. 5-2h ;然后在1-10°C、4000-6000Xg离心10_30min，弃掉含有水溶性物质的上清液，取沉淀得到粗制卵黄脂蛋白。
3.根据权利要求2所述的卵黄高磷蛋白提取及纯化工艺，其特征在于，所述乙醇脱脂的过程为向粗制卵黄脂蛋白中加入3-6倍体积(w/v)的乙醇,3000-6000rpm均质l_5min,然后在1-1CTC、4000_6000 X g尚心10_30min,取沉淀,重复上述脱脂过程1-3次，得到脱脂后的卵黄脂蛋白；所述乙醇的浓度为60-90%。
4.根据权利要求3所述的卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法，其特征在于，所述高浓度盐溶液浸提的过程为用5-15倍体积(w/v)、浓度为8-12%的盐溶液浸提上述脱脂后的卵黄脂蛋白，并用HCl溶液调节pH值为3. 0-7. O,于1-10°C搅拌O. 5_2h，然后在1_10°C、4000-6000 X g离心10-30min，弃沉淀取含有卵黄高磷蛋白的上清液，将含有卵黄高磷蛋白的上清液脱盐冻干，得到卵黄高磷蛋白粗品。
5.根据权利要求4所述的卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法，其特征在于，所述盐溶液为NaCl溶液或(NH4)2SO4溶液。
6.根据权利要求I所述的卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析法包括下述步骤 a、将卵黄高磷蛋白粗品溶于pH值为5.0-7.0、20-50mmol/L含NaCl的平衡缓冲液，至卵黄高磷蛋白终浓度为10_50mg/mL，得到卵黄高磷蛋白溶液； b、将上述卵黄高磷蛋白溶液以恒定流速加入装有阴离子交换树脂且已用所述平衡缓冲液平衡的层析柱内，然后再以所述平衡缓冲液洗脱层析柱； C、采用pH值为5. 0-7. 0、20-50mmol/L含NaCl的洗脱液进行一步洗脱，收集洗脱峰，透析冻干后得到高纯度的卵黄高磷蛋白；所述洗脱峰是指在PH值为5. 0-7. 0、20-50mmol/L且NaCl浓度为O. 5-1. OmoI/L的洗脱液下紫外吸收峰对应的流出液。
7.根据权利要求6所述的卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾或乙酸-乙酸钠缓冲液，所含NaCl 的浓度为 O. 2-0. 4mol/L0
8.根据权利要求6或7所述的卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法，其特征在于，所述洗脱液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾或乙酸-乙酸钠缓冲液，所述洗脱液中NaCl的浓度为O. 5-1. OmoI/Lο
9.根据权利要求8所述的卵黄高磷蛋白提取及纯化工艺，其特征在于，所述阴离子交换树脂为指交联葡聚糖系、琼脂糖系或大孔苯乙烯系。
全文摘要
本发明公开了一种禽蛋中卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法，而提供一种可直接在食品医药等纯度要求较高的行业应用，所得产品纯度高，操作简单，易于产业化生产的禽蛋中卵黄高磷蛋白的提取及纯化方法。包括如下步骤取禽蛋中的卵黄去除水溶性物质，采用乙醇脱脂后，用高浓度盐溶液浸提得到卵黄高磷蛋白粗品；利用阴离子交换层析法纯化上述卵黄高磷蛋白粗品并除盐，得到高纯度的卵黄高磷蛋白。本发明的方法采用阴离子交换树脂纯化卵黄高磷蛋白，大幅提高了卵黄高磷蛋白的纯度，而且其回收率也较高。本工艺各环节操作简单，设备成本低廉，易于实现产业化生产，所得卵黄高磷蛋白可直接用于食品医药行业。
文档编号C07K14/465GK102936280SQ20121047578
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者吴子健, 王亮, 吕瑜峰, 李建颖, 孙佩佩 申请人:天津商业大学