专利名称：桑黄菌中一种苯乙酮的分离技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程制药领域。
背景技术：
桑黄，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1. 5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类一是只有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此发明可以精致到纯品。
发明内容
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌/%<977i/W5· igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中一种苯乙酮的分离技术。首先制备桑黄粗提物，然后进行正相硅胶层析以氯仿与甲醇梯度洗脱，使用TLC检测检测洗脱液，然后进行甲醇凝胶层析，再次进行TLC检测，接着使用反相硅胶层析，经过TLC检测，将产物减压蒸干既得无色油状物为 一种苯乙酮。本发明的技术方案如下
桑黄粗提物，由下述方法制得
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 O. 1-0. 5%酵母膏 O. 1-0. 5%
硫酸镁 O. 1-0. 5%磷酸二氢钾O. 01-0. 05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35°C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到2. 5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量O. 5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ；(4)用体积百分比为60 95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60 90% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。桑黄菌粗提物一乙醇沉淀一正相硅胶层析一氯仿与甲醇梯度洗脱一TLC检测一甲醇凝胶层析一TLC检测一反相硅胶层析一TLC检测一减压蒸干一无色油状物(一种苯乙酮)。具体方法为
(1)制备桑黄菌粗提物；
(2)将上述步骤(I)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，置于通风设备处干燥并搅拌；
(3)对上述步骤(2)后制备的 原料进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2至5次，得到洗脱液；
(4)将步骤(3)中的最后一次洗脱液等体积硅胶拌样，进行硅胶层析，使用洗脱剂洗
脱；
(5)收集步骤(4)的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(6)对步骤(5)得到的产物进行常压反相柱层析，使用洗脱剂洗脱；
(7)收集步骤(6)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为苯乙酮。本发明的显著优势本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的一种苯乙酮。技术路线成熟明确，高效精确。
图1为3’，4’ - 二羟基苯乙酮的结构式；
图2为3’，4’ - 二羟基苯乙酮的一维核磁共振H谱。
具体实施方式
实例1:
桑黄粗提物，由下述方法制得
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 O. 1%酵母膏 O. 1%
硫酸镁 O. 1%磷酸二氢钾0.01%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力O.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量O. 5-1. lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热I小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。将上述桑黄粗提物称取300g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，至于通风设备处干燥并搅拌，然后进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高lm，直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿甲醇=100:1，氯仿甲醇=500:1，氯仿甲醇=100:1.每种洗脱剂洗脱体积分别为2，3，3，3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-l，Fr-2，Fr-3，Fr-4。将Fr_4等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200目正相硅胶。洗脱剂为氯仿。收集上述洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析。使用TLC检测收集的洗脱液，合并收集出现红色斑点的洗脱液，减压蒸干，使 用20%甲醇溶解上述产物，进行常压反相柱层析，洗脱剂为20%-100%甲醇。收集洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，合并收集出现红色斑点的洗脱液。减压干燥，进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ 7. 43 (d, J = 8. 6 Hz, 19H),6. 81 (d, J = 7.9 Hz, 10H), 2. 49 (s, 27H)，2. 42 (s, 2H) ·说明其为 3’，4’ - 二羟基苯乙酮。
实例2
桑黄粗提物，由下述方法制得
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸镁 0.5%磷酸二氢钾0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30°C温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当pH值降到2. 5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30°C，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通气量O. 5-1.1vvm,搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在55°C条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10 ;
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
称取称取粗提物IOOg与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，至于通风设备处干燥并搅拌，然后进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高O. 5m，直径5cm，洗脱剂为分别为氯仿甲醇=100:1，氯仿甲醇=500:1，氯仿甲醇=100:1.每种洗脱剂洗脱体积分别为3，3，3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-l，Fr-2，Fr-3。将Fr_3等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200— 300目正相硅胶。洗脱剂为氯仿。收集上述洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析。使用TLC检测收集的洗脱液，合并收集出现红色斑点的洗脱液，减压蒸干，使用20%甲醇溶解上述产物，进行常压反相柱层析，洗脱剂为20%-100%甲醇。收集洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，合并收集出现红色斑点的洗脱液。减压干燥，进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为 δ 7. 43 (d, J = 8. 6 Hz, 19H)，6. 81 (d, J = 7. 9 Hz, 10H), 2. 49(s，27H), 2. 42 (s，2H) ·说明其为3’，4’- 二羟基苯乙酮。
权利要求
1.一种从桑黄菌中分离苯乙酮方法，其步骤顺序如下 (1)制备桑黄粗提物； (2)将上述步骤(I)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，置于通风设备处干燥并搅拌； (3)对上述步骤(2)后制备的原料进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2至5次，得到洗脱液； (4)将步骤(3)中的最后一次洗脱液等体积硅胶拌样，进行硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (5)收集步骤(4)的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (6)对步骤(5)得到的产物进行常压反相柱层析，使用洗脱剂洗脱； (7)收集步骤(6)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为苯乙酮。
2.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黄粗提物，由下述方法制得 (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 O. 1-0. 5%磷酸二氢钾O. 01-0. 05% (2)如权利要求1所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35 °C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到2. 5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量O. 5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物； (3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ； (4)用体积百分比为60 95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60 90% ； (5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ； (6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
3.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于所述的乙醇浓度为65%-95%食用乙醇，所用体积为3-6倍体积。
4.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的硅胶为100-200目正相硅胶。
5.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇。
6.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的硅胶用量为1-3倍体积，洗脱剂为氯仿。
7.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的凝胶为Sephadex LH-20,洗脱剂为甲醇或丙酮。
8.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于，步骤(6)所述的反相硅胶为反相C-8、C-18，洗脱剂为甲醇。
9.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于，步骤(7)中TLC检测要点是出现红色斑点，展开剂为氯仿甲醇=30 1-40 :1。
全文摘要
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinus igniarius(L ex Fr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus(Berk et Curt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii(Allesch et Schnabl)Imaz)中一种苯乙酮的分离技术。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析以氯仿与甲醇梯度洗脱，使用TLC检测检测洗脱液，然后进行甲醇凝胶层析，再次进行TLC检测，接着使用反相硅胶层析，经过TLC检测，将产物减压蒸干既得无色油状物为一种苯乙酮。
文档编号C07C45/79GK103044228SQ201210546060
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月15日 优先权日2012年12月15日
发明者宋爱荣, 赵晨, 孙效乐, 黄芳, 丁伟 申请人:青岛农业大学