专利名称：一种gm-csf-her2重组蛋白及其方法和应用的制作方法
—种GM-CSF-HER2重组蛋白及其方法和应用本发明涉及GM-CSF-HER2重组蛋白及其方法和应用，具体涉及一种能够用于治疗肿瘤药物的GM-CSF-HER2重组蛋白及其制备方法、制作DC疫苗的方法和应用。 肿瘤发生发展的根本原因之一是机体的免疫系统不能对其生长进行有效地控制，对此加以纠正，使机体的免疫系统能有效产生对肿瘤细胞的免疫排斥反应是近百年来人们一直研究的课题。肿瘤疫苗是该方面研究的主要内容，在众多的肿瘤疫苗中，根据抗原提呈细胞在肿瘤免疫中的重要作用而设计的树突状细胞(dendritic cells, DC)瘤苗是目前研究最热门方向。机体的免疫应答首先由抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)捕获、加工和处理抗原，再将抗原递呈给T、B淋巴细胞，从而引发一系列的免疫应答。树突状细胞(dendritic cell,DC)作为功能最强的APC，能激活静息型T细胞(naive T cell)，激发初始免疫应答，在体内发挥强大的免疫监视功能。肿瘤患者体内DC功能缺陷，不能有效递呈肿瘤抗原，导致免疫无能或免疫耐受，使肿瘤得以发生发展。应用DC瘤苗治疗肿瘤最引人瞩目的研究工作是应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏(pulsing) DC，然后将之回输或免疫接种至行瘤宿主，进行肿瘤免疫治疗，已证明该疗法能显著地诱导机体产生抗原特异性CTL，产生保护性免疫反应并能治疗已建立的荷瘤模型，这些研究为肿瘤的治疗提供了新的思路，将DC过继回输已在临床用于肿瘤病人的治疗，取得了一定疗效，表明该疗法具有一定的临床应用的可行性。DC的抗原递呈功能是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的基础，DC的体外大量诱导扩增是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的前提，DC瘤苗的体外构建是DC瘤苗的抗肿瘤免疫治疗的关键。随着DC体外诱导扩增技术的发展及分子生物学技术和基因工程技术应用于DC瘤苗构建方法的发现，使得产量增大、纯度提高、制备更容易等优点，更能满足实验和临床研究的需要。DC瘤苗用于肿瘤免疫治疗的实验和临床研究更趋成熟，DC瘤苗有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效方式。故本发明以构建肿瘤特异性抗原结合细胞因子等刺激DC细胞制备DC疫苗可有效激发体内的抗原特异性免疫反应，并用于肿瘤的预防及治疗。针对现阶段应用常规方法所诱导的DC细胞具有抗原特异性不高以及过早凋亡等方面的不足。本发明提供了一种GM-CSF-HER2重组蛋白的制备方法，使诱导的DC细胞在抗原特异性和生存周期上都有了很大程度的提高，为后续的特异性免疫应答提供了很好的基础条件。本发明为肿瘤免疫治疗奠定了良好的基础。为实现上述目的，设计一种GM-CSF-HER2重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。—种制备上述重组蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成a.将GM-CSF的基因序列和HER2的基因序列通过酶切克隆到质粒pCEP4中构建重组质粒，b.重组质粒转染人胚胎肾293细胞进行重组蛋白的表达，c.纯化收集所述的重组蛋白。所述的酶切为在GM-CSF的基因序列两端添加酶切点位Hind III和Xho I，在HER2的基因序列两端添加酶切点位Xho I和BamH I。通过N1-NTA柱进行所述的分离纯化。所述重组蛋白可以用作生产治疗肿瘤的药物。所述的肿瘤为乳腺癌。一种所述重组蛋白制备DC疫苗的方法，其特征在于用所述的重组蛋白刺激诱导 健康C57BL/6小鼠经由骨髓制备的DC细胞，制得DC疫苗。用于刺激诱导的重组蛋白的浓度为25 100ug/ml。用于刺激诱导的重组蛋白的浓度为25 50ug/ml。与常规利用肿瘤细胞裂解物诱导DC细胞的方法相比，本发明具有以下优点(I)利用基因工程方法将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了 DC细胞存活时间的延长以及特异性免疫应答的启动；(2) GM-CSF-HER2重组蛋白的成功制备，避免了常规DC细胞培养中GM-CSF的额外添加，解决了培养周期中GM-CSF不足的缺点，并且共表达GM-CSF还可促进细胞毒作用；(3)增强了肿瘤抗原的特异性，针对性的解决了以HER2为标志性抗原的肿瘤免疫治疗，为肿瘤临床治疗提供了新的依据。
图1为不同疫苗刺激机体ELISPOT检测IFN-gama斑点数；图2为不同疫苗刺激机体特异性反应ELISPOT检测IFN-gama斑点；图3为不同组肿瘤块体积对比图；图4为不同剂量重组蛋白刺激机体特异性反应ELISPOT检测分析图；图5为4T1-HER2细胞毒实验比较图；图6为4T1细胞毒实验比较图；图7为质粒pCEP4图谱。图7的图谱详情如下CMV 启动子1-588多克隆位点619-676SV40多腺苷酸化信号位点685-926复制起始位点1344-3319EBNA-1 基因(互补链)位点3620_5545氨苄青霉素抗性基因位点6171-7031复制起始位点7040-7815TK 启动子8183-8345潮霉素抗性基因位点8409-9419
TK多腺苷酸化信号位点9431-9702[具体实施方式
]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1:将人乳腺癌细胞SKBr3特异性抗原HER2的特异编码序列与粒细胞集落刺激生长因子GM-CSF编码序列进行重组。其中，粒细胞集落刺激生长因子GM-CSF来自NCBI，其序列号为AAA52578，其编码序列为
tqpwehvnai qearrllnls rdtaaemnet vevisemfdl qeptclqtrl elykqglrgs60ltklkgpltm mashykqhcp ptpetscatq i itf esfken lkdfl lvipf dc112GM-CSF基因序列两端加酶切位点Hind III和Xho I ；人乳腺癌细胞SKBr3特异性抗原HER2来自NCBI，其序列号为NP_004439，其编码序列为gcpaeqrasp ltsiisavvg illvvvlgvv fgilikrrqq kirk 44在HER2基因序列两端加酶切位点Xho I和BamH I ；利用基因重组技术将上述两段基因片段通过酶切克隆到质粒pCEP4构建重组质粒，质粒PCEP4图谱如图7所示，；将重组质粒pCEP4转染人胚胎肾293细胞，进行GM-CSF-HER2重组蛋白的表达；然后利用Ni — NTA柱分离纯化GM-CSF-HER2重组蛋白；构建表达人源HER2的小鼠乳腺癌细胞株4T1，即4T1-HER2细胞株，并用RPM1-1640培养基，添加1. 5g/L的NaHCO3, 2. 5g/L的葡萄糖，O. llg/L的丙酮酸钠，10%热灭活的胎牛血清，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素进行培养；选取BALB/C小鼠，构建4T1-HER2动物模型；取健康BALB/C小鼠四肢骨骨髓制备成单细胞悬液，去除红细胞，加入完全培养基、细胞因子，体外诱导出小鼠DC细胞，再加入已制得的GM-CSF-HER2重组蛋白，经诱导激活制备出GM-CSF-HER2重组蛋白激活的DC疫苗。㈠常规方法与GM-CSF-HER2重组蛋白诱导DC激发机体免疫反应能力的对比常规方法是指，利用肿瘤细胞株裂解物去诱导DC细胞。取两种方法诱导的DC疫苗回输BALB/C小鼠，利用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测疫苗回输后T细胞产生IFN-gama的量，以及CD4+和CD8+ T细胞应答产生IFN-gama的量去评估机体产生特异性免疫反应的能力。图1数据显示，GM-CSF-HER2重组蛋白诱导机体产生免疫反应的能力要高于常规方法，且两者之间的差异具有统计学意义(P < O. 05)。图2数据显示，GM-CSF-HER2重组蛋白刺激机体产生HER2特异性免疫反应的能力要高于常规方法，且两者之间的差异具有统计学意义(P < O. 05)。㈡GM-CSF-HER2重组蛋白最佳剂量
4T1-HER2细胞株是由携带人源HER2的cDNA经逆转录病毒转染小鼠乳腺癌4T1细胞株构建而成的。选取BALB/C小鼠构建4T1-HER2乳腺癌动物模型，按照空白、生理盐水、融合蛋白浓度为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml五组分别注射小鼠，每组10只，每5天测量并计算肿瘤块体积大小(mm3)V = (a*b2)/2，a、b为肿瘤块的大小中心轴的直径。图3数据显示，GM-CSF-HER2重组蛋白可明显抑制肿瘤的生长，抑制效果跟注射剂量相关，并且之间具有统计学意义(P < O. 05)。利用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测按以上五组分别注射小鼠后使T细胞产生IFN-gama的量。根据图4显示的数据表明，低剂量GM-CSF-HER2重组蛋白就可以诱导机体发生特异性免疫应答。㈢细胞毒实验 分别以4T1-HER2和4T1细胞作为靶细胞。分别取注射常规蛋白和GM-CSF-HER2重组蛋白7天后的BALB/C小鼠脾细胞,经4%多聚甲醒孵育后以作为效应细胞。按照不同效靶比将细胞混合培养，每组做三个平行，5天后利用铬释放法检测特异性细胞毒性。由图5数据显示，GM-CSF-HER2重组蛋白杀伤表达特异性HER2细胞的效果要高于常规法，两者之间具有统计学意义，且不同效靶比之间的差异性也具有统计学意义(P< O. 05)。由图6数据显示，表明常规法和GM-CSF-HER2重组蛋白均可杀伤乳腺癌4T1细胞，两者之间无明显差异性，并且不同效靶比之间也无明显差异。
权利要求
1.一种GM-CSF- HER2重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一种制备权利要求1所述重组蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成a.将GM-CSF的基因序列和HER2的基因序列通过酶切克隆到质粒pCEP4中构建重组质粒，b.重组质粒转染人胚胎肾293细胞进行重组蛋白的表达，c.纯化收集所述的重组蛋白。
3.如权利要求2所述的制备重组蛋白的方法，其特征在于所述的酶切为在GM-CSF的基因序列两端添加酶切点位Hind III和Xho I，在HER2的基因序列两端添加酶切点位Xho I 和 BamH I。
4.如权利要求2所述的制备重组蛋白的方法，其特征在于通过N1-NTA柱进行所述的分离纯化。
5.一种权利要求1所述重组蛋白用于肿瘤治疗药物的应用。
6.如权利要求5所述的重组蛋白用于治疗肿瘤药物的应用，其特征在于所述的肿瘤为乳腺癌。
7.—种权利要求1所述重组蛋白制备DC疫苗的方法，其特征在于用所述的重组蛋白刺激诱导健康C57BL/6小鼠经由骨髓制备的DC细胞，制得DC疫苗。
8.如权利要求7所述重组蛋白制备DC疫苗的方法，其特征在于用于刺激诱导的重组蛋白的浓度为25 100ug/ml。
9.如权利要求7所述重组蛋白制备DC疫苗的方法，其特征在于用于刺激诱导的重组蛋白的浓度为25 50ug/ml。
全文摘要
本发明涉及GM-CSF-HER2重组蛋白及其方法和应用，具体涉及一种能够用于治疗肿瘤药物的GM-CSF-HER2重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示；还包括其制备方法将GM-CSF的基因序列和HER2的基因序列通过酶切克隆到质粒pCEP4中构建重组质粒，重组质粒转染人胚胎肾293细胞进行重组蛋白的表达，纯化收集所述的重组蛋白，该重组蛋白可以用于生产治疗肿瘤药物，如乳腺癌，本发明用基因工程方法将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了DC细胞存活时间的延长以及特异性免疫应答的启动，GM-CSF-HER2重组蛋白避免了常规DC细胞培养中GM-CSF的额外添加，解决了培养周期中GM-CSF不足的缺点，并且共表达GM-CSF还可促进细胞毒作用。
文档编号C07K19/00GK102993312SQ20121054443
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者张超, 叶永清, 苏国新 申请人:上海柯莱逊生物技术有限公司