利用包含mhc i类的复合物通过循环中的病毒特异性细胞毒性t细胞清除靶细胞的制作方法
【专利摘要】本文中报告一种复合物，其包含特异性结合靶抗原的抗体衍生部分（作为第一部分）和连接至MHC?I类蛋白质复合物的病毒衍生肽（作为第二部分）。凭借本文中报告的复合物，通过给个体现有的、循环中的病毒特异性细胞毒性T细胞（T记忆细胞或T效应细胞）装饰模拟急性病毒感染的MHC?I类复合物，能将这些细胞引导至表达（共价复合物的抗体衍生部分特异性结合的）靶抗原的细胞。如此，本文中报告的一个方面是一种复合物，特征在于它包含一条融合多肽，其以N至C端方向包含(i)β2-微球蛋白，和(ii)相对频率小于1%的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，或(i)病毒衍生肽，(ii)β2-微球蛋白，和(iii)相对频率为1%或更多的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，和通过一个或多个二硫键连接的两条多肽链，其中第一二硫化物连接的多肽链以N至C端方向包含(i)免疫球蛋白轻或重链可变域，(ii)免疫球蛋白轻或重链恒定域，和(iii)抗体重链铰链区多肽，且第二二硫化物连接的多肽链包含抗体重链铰链区多肽，其中该融合多肽共价结合至二硫化物连接的多肽链之一的C端或N端，或共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链可变域互补的抗体可变域的N端。
【专利说明】利用包含MHC I类的复合物通过循环中的病毒特异性细胞毒性T细胞清除靶细胞
[0001]本文中报告一种包含抗体和MHC I类成分的融合多肽及其通过靶向吸引循环中的病毒特异性细胞毒性T细胞用于清除肿瘤细胞的用途。
[0002]发明背景
[0003]MHC I类蛋白质由α链(α-1至3和跨膜域)和β2_微球蛋白组成。它是多基因的(单倍体基因组中有MHC-1类蛋白质的3个基因座)，产生六种不同MHC I类蛋白质α链(在人中，两种HLA-A、两种HLA-B、两种HLA-C)。MHC还是多态的。人HLA-A等位基因Α*0201在高加索群体中的流行度为约 30% 至 50%(Player, et al., J Immunother.Emphasis TumorImmunol.19 (1996) 357-363)。
[0004]人巨细胞病毒HCMV(=人疱疹病毒5，HHV_5)是最大的人病毒之一。它的基因组包含230，OOObp左右线性双链DNA且编码超过160种蛋白质(Davison，A.J.，et al., J.Gen.Virol.84 (2003) 17-28)。
[0005]CMV已经进化成为人基因组的极端寄生物，而且它是一种有力的免疫原，触发来自免疫系统所有分支的强免疫应答。这种病毒表现为人免疫系统已知的免疫显性最高的抗原之一，而且刺激程度空前的⑶8+-T细胞应答。
[0006]CMV “潜伏”依赖于CMV病毒的慢性免疫遏制，而非病毒转录样式的改变(Moss&Khan, Human Immunology65 (2004) 456-464)。
[0007]⑶8+-T细胞免疫应答并非均匀针对所有CMV蛋白，而是有聚焦的。CMV蛋白pp65和 IE-1 是主要革巴物(McLaughlin-Taylor, E.，et al.，].Med.Virol.43 (1994) 103-110 ；Moss&Khan, Human Immunology65 (2004) 456-464)。
[0008]CMV特异性T细胞的真实频率很高，各肽的频率的数量级高达总CD8+-T细胞全集的 I 至 2%(Moss&Khan, Human Immunology,见上文；Wills,M.R., et al., J.Virol.70( 1996)7569-7579)。
[0009]CMV特异性⑶8+-T细胞应答随年龄显著升高，而且总⑶8+-T细胞库中超过10%频繁有各 HLA 肽四聚体染色(Khan，N.，et al.，J.1mmunol.169 (2002) 1984-1992)。
[0010]健康老年供体中的总⑶8+-T细胞应答可占⑶8+-T细胞全集的大约50%。
[0011]巨大的CD8+-T细胞扩增常常是在克隆方面很受局限的，而且估算CMV是随衰老在外周血在看到的克隆⑶8+-T细胞扩增中的至少30%的原因。超过60岁的CMV血清阳性供体中的总⑶8+-T细胞计数高达CMV血清阴性同龄组的两倍(Looney，R.J.，et al.，Clin.1mmunol.90 (1999) 213-219)。
[0012]Mottez 等人(Eur.J.Tmmunol.21( 1991 )467-471 )；Godeau 等人(J.Biol.Chem.267(1992) 24223-24229)和 Mage 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.89 (1992) 10658-10662)报告了可溶性HLA和β 2-微球蛋白的融合物。Mottez等人(J.Exp.Med.181 (1995) 493-502)报告了病毒衍生肽与可溶性HLA和β 2-微球蛋白的融合物。Dal Porto等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (1993)6671-6675)报告了免疫球蛋白重链与可溶性HLA和共表达β 2-微球蛋白的融合物。Robert等人(Eur.J.1mmun.30(2000)3165-3170)记载了化学偶联至Fab的生物素化肽-可溶性HLA和β-2-微球蛋白与链霉亲合素的四聚体复合物。Robert等人(Cancer Immunityl(2001)2)报告了化学偶联的Fab及病毒衍生肽与可溶性HLA和β 2-微球蛋白的融合物。Greten等人(J.1mmunol.Methods271 (2002) 125-135)报告了病毒衍生肽与可溶性HLA和β 2-微球蛋白对鼠单克隆抗体重链的融合物。Lev等人(J.1mmunol.169(2002)2988-2996)；Lev 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.101 (2004)9051-9056)和 Novak 等人(Int.J.Cancerl20 (2006)329-336)报告了没有肽的scFv融合物的大肠杆菌表达、体外重折叠和肽加载。Mous等人(Leukemia20 (2006) 1096-1102)报告了加载有肽且偶联至融合有链霉亲合素的Fab或scFv抗体的生物素化可溶性MHC的使用。
[0013]在W02005/099361中报告了具有经修饰β 2_微球蛋白的MHC I类肽-抗体缀合物。W02005/099361中报告的例示性缀合物是通过体外缀合MHC复合物(HLA)的α链或通过同一细胞中来自分开的基因的共表达而获得的。
[0014]在US2004/0091488中报告了主要组织相容性复合物I类抗原及特定载体分子的抗原构建物。本文中报告了缺乏铰链区的融合多肽。
[0015]发明概述
[0016]本文中报告一种用于重组生产复合物的方法以及该复合物自身，其中该复合物包含特异性结合靶抗原的抗体衍生部分(作为第一部分)和共价连接至MHC I类蛋白复合物的病毒衍生肽(作为第二部分)。
[0017]凭借本文中报告的复合物，通过给个体现有的、循环中的病毒特异性细胞毒性T细胞(Τ记忆细胞和/或T效应细胞)装饰(通过连接至MHC I类蛋白质复合物的病毒衍生肽)模拟急性病毒感染的MHC I类复合物，能将这些细胞引导至表达靶抗原(即复合物的抗体衍生部分特异性结合的靶抗原)的细胞。
[0018]本文中报告的一个方面是一种用于在真核细胞中重组生产复合物的方法，该复合物包含:i) β 2-微球蛋白和I类MHC分子胞外域α 1、α2和α3的融合多肽，ii) 一对各自包含抗体铰链区的二硫化物连接的多肽链，和iii)至少一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，该方法包括下述步骤:i)培养包含一种或多种编码该复合物的核酸的真核细胞，并ii)自该细胞或培养基回收该复合物，其中该复合物包含β 2-微球蛋白和I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3的正好一条融合多肽。
[0019]在一个实施方案中，该复合物包含正好一条MHC衍生多肽或正好一条包含MHC衍生分子的融合多肽。
[0020]在一个实施方案中，在培养基中以lmg/ml或更多的浓度获得该复合物。在一个实施方案中，在培养基中以4mg/ml或更多的浓度获得该复合物。
[0021]在一个实施方案中，该真核细胞为哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞为人胚肾细胞或中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞或小鼠骨髓瘤细胞。
[0022]在一个实施方案中，该融合多肽以N至C端方向包含β 2-微球蛋白和相对发生频率小于1%的I类MHC分子的胞外域α 1、α 2和α 3。
[0023]在一个实施方案中，该融合多肽包含T细胞应答引发肽、β 2-微球蛋白和相对发生频率为1%或更多的I类MHC分子的胞外域α 1、α 2和α 3。
[0024]在一个实施方案中，该一对自抗体铰链区衍生的二硫化物连接的多肽链的多肽i)通过一个或多个二硫键连接，ii)第一二硫化物连接的多肽链以N至C端方向包含免疫球蛋白轻或重链可变域、免疫球蛋白轻或重链恒定域、和抗体重链铰链区多肽，且第二二硫化物连接的多肽链包含抗体重链铰链区多肽。
[0025]在一个实施方案中，该融合多肽i)共价结合至该二硫化物连接的多肽链之一的C端或N端，或ii)共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的关联重或轻链可变域互补的抗体可变域的N端，或iii)共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链恒定域互补的抗体恒定域的C端。
[0026]在一个实施方案中，该T细胞应答引发肽为病毒衍生肽。
[0027]在一个实施方案中，该融合多肽以N至C端方向包含
[0028]⑴具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:09的氨基酸序列的病毒衍生肽，
[0029](ii)具有选自SEQ ID NO:16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第一接头肽，
[0030](iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的β 2_微球蛋白，
[0031](iv)具有选自SEQ ID NO: 16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第二接头肽，
[0032](V)具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3，和`
[0033](vi)具有选自SEQ ID NO:12，16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第三接头肽。
[0034]在一个实施方案中，第一二硫化物连接的多肽链和第二二硫化物连接的多肽链包含i)包含选自SEQ ID勵:31，32和33的氨基酸序列的人1861012域，和包含选自SEQ IDNO:34,35和36的氨基酸序列的人IgGlCH3域。
[0035]在一个实施方案中，该复合物包含i)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一接头肽，和/或ii)有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二接头肽，和/或iii)具有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的第三接头肽，和/或iv)具有SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和/或V)第一二硫化物连接的多肽中具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的人IgGlCH3域和第二二硫化物连接的多肽中具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的人IgGlCH3域。
[0036]本文中报告的一个方面是复合物，特征在于它包含
[0037]-—条融合多肽，其以N至C端方向包含
[0038](i)3 2-微球蛋白，和
[0039](ii)相对频率小于1%的I类MHC分子的胞外域α 1、α 2和α 3，
[0040]或
[0041](i) T细胞应答引发肽，
[0042](ii) β2_微球蛋白，和
[0043](iii)相对频率为1%或更多的I类MHC分子的胞外域α 1、α 2和α 3，
[0044]和
[0045]-通过一个或多个二硫键连接的两条多肽链，
[0046]其中第一二硫化物连接的多肽链以N至C端方向包含
[0047](i)免疫球蛋白轻或重链可变域，
[0048](ii)免疫球蛋白轻或重链恒定域，和
[0049](iii)抗体重链铰链区多肽，
[0050]且[0051]其中第二二硫化物连接的多肽链包含抗体重链铰链区多肽，其中该融合多肽
[0052]-共价结合至该二硫化物连接的多肽链之一的C端或N端，或
[0053]-共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链可变域互补的抗体可变域的N端，或
[0054]-共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链恒定域互补的抗体恒定域的C端。
[0055]在所有方面的一个实施方案中，该复合物为抗原结合复合物。
[0056]在所有方面的一个实施方案中，该复合物为共价复合物。
[0057] 在所有方面的一个实施方案中，该相对频率为1%或更多的I类MHC分子具有10%或更多的相对频率。在一个实施方案中，该相对频率为10%或更多的I类MHC分子为HLA-A*0201 或 HLA-A*1101 或 HLA_A*2402 或 HLA_A*340101 或 HLA-00304 或 HLA-00401或 HLA-00702。
[0058]在所有方面的一个实施方案中，如下根据要施用该复合物的个体的区域来选择该相对频率为10%或更多的I类MHC分子:
[0059]-对于欧洲裔的个体，I类MHC分子选自下组:HLA-A*0101，HLA_A*0201，HLA-A*0301，HLA-B*0702，HLA_B*0801，HLA_B*4402，HLA-00401，HLA-00501，HLA-00701，和 HLA-00702，
[0060]-对于澳洲裔的个体，I类MHC分子选自下组:HLA-A*0201，HLA-A^l101,HLA-A*2402，HLA_A*340101，HLA-B*1301, HLA_B*1521，HLA_B*5601，HLA_B*5602，HLA-00102，HLA-00401，HLA-00403，和 HLA-01502，
[0061]-对于北美裔的个体，I类MHC分子选自下组:HLA-A*0201，HLA_A*2402，HLA-00202，HLA-00304，HLA-00401，和 HLA-00702，且
[0062]-对于东南亚裔的个体，I类MHC分子选自下组:HLA-A*1101，HLA_A*2402，HLA-B*1504, HLA-00102，HLA-00304，HLA-00702，和 HLA-00801。
[0063]在所有方面的一个实施方案中，如下根据要施用复合物的个体的区域来选择相对频率为10%或更多的I类MHC分子:
[0064]-对于欧洲裔的个体，I类MHC分子为HLA_A*0201，
[0065]-对于澳洲裔的个体，I类MHC分子选自下组:HLA-A*2402，HLA-B*1301,HLA-OO102，和 HLA-00401，
[0066]-对于北美裔的个体，I类MHC分子选自下组:HLA-A*2402，和HLA-00304，且
[0067]-对于东南亚裔的个体，I类MHC分子为HLA_A*2402。
[0068]在所有方面的一个实施方案中，以N至C端方向包含β 2-微球蛋白和相对频率小于1%的I类MHC分子的胞外域α 1、α 2和α 3的融合多肽在其N端进一步包含结合MHC肽结合沟的肽。
[0069]在所有方面的一个实施方案中，该T细胞应答引发肽为CD8+-T细胞应答引发肽。在一个实施方案中，该T细胞应答引发肽为病毒衍生肽。
[0070]在所有方面的一个实施方案中，相对频率小于1%的I类MHC分子选自下组:HLA-B*4201，HLA_B*5901，HLA_B*6701，和 HLA_B*7802。
[0071 ] 在所有方面的一个实施方案中，该融合多肽包含[0072](i)病毒衍生肽，
[0073](ii) β2_微球蛋白，和
[0074](iii)可溶性 HLA-A 等位基因 A*0201。
[0075]在所有方面的一个实施方案中，该病毒选自腺病毒，人疱疫病毒I，人疱疫病毒2,人疱疫病毒4 (埃巴二氏病毒)，乙肝病毒,丙肝病毒，人巨细胞病毒，人免疫缺陷病毒，16型人乳头瘤病毒，18型人乳头瘤病毒，31型人乳头瘤病毒，33型人乳头瘤病毒，35型人乳头瘤病毒，39型人乳头瘤病毒，45型人乳头瘤病毒，51型人乳头瘤病毒，52型人乳头瘤病毒，56型人乳头瘤病毒，58型人乳头瘤病毒，59型人乳头瘤病毒，68型人乳头瘤病毒，73型人乳头瘤病毒，82型人乳头瘤病毒，I型人T细胞亲淋巴病毒，人甲型流感病毒，人乙型流感病毒，痘苗病毒，登革热病毒。
[0076]在所有方面的一个实施方案中，该病毒衍生肽选自NLVPMVATV (SEQ ID NO:01),SLYNTVATL (SEQ ID NO:02), GLCTLVAML (SEQ ID NO:03), GILGFVFTL (SEQ ID NO:04),STNRQSGRQ (SEQ ID NO:05), LLFGYPVYV (SEQ ID NO:06), FAEGFVRAL (SEQ ID NO:07),LIVIGILIL (SEQ ID NO:08)，或 ILHTPGCV (SEQ ID NO:09), WYAQIQPHW (SEQ ID NO:52),AFSGVSffTM (SEQ ID NO:53), ILIGVVITff (SEQ ID NO:54), MMIPTWAF (SEQ ID NO:55),PFPQSNAPI (SEQ ID NO:56), LLLTLLATV (SEQ ID NO:57), IVLEHGSCV (SEQ ID NO:58),LLFKTENGV (SEQ ID NO:59), PLNEAIMAV (SEQ ID NO:60), NLVRLQSGV (SEQ ID NO:61),LVISGLFPV (SEQ ID NO:62), LLLVAHYAI (SEQ ID NO:63), LALLAAFKV (SEQ ID NO:64),VILAGPMPV (SEQ ID NO:65), HVLGRLITV (SEQ ID NO:66), VTEHDTLLY (SEQ ID NO:67),NTDFRVLEL (SEQ ID NO:68), CVETMCNEY (SEQ ID NO:69), VLEETSVML (SEQ ID NO:70),NLVPMVATV (SEQ ID NO:71), RIFAELEGV (SEQ ID NO:72), IIYTRNHEV (SEQ ID NO:73),VLAELVKQI (SEQ ID NO:74), AVGGAVASV (SEQ ID NO:75), TVRSHCVSK (SEQ ID NO:76),IMREFNSYK (SEQ ID NO:77), GPISHGHVLK (SEQ ID NO:78), ATVQGQNLK (SEQ ID NO:79),VYALPLKML (SEQ ID NO:80), AYAQKIFKIL (SEQ ID NO:81), QYDPVAALF (SEQ ID NO:82),YVKVYLESF (SEQ ID NO:83), DIYRIFAEL (SEQ ID NO:84), VFETSGGLVV (SEQ ID NO:85),KARDHLAVL (SEQ ID NO:86), QARLTVSGL (SEQ ID NO:87), KARAKKDEL (SEQ ID NO:88),QIKVRVDMV (SEQ ID NO:89), RRRHRQDAL (SEQ ID NO:90), ARVYEIKCR (SEQ ID NO:91),KMQVI⑶QY (SEQ ID NO:92),NVRRSffEEL (SEQ ID NO:93),CPSQEPMSIYVY (SEQ ID NO:94),KPGKISHIMLDVA (SEQ ID NO:95), ELRRKMMYM (SEQ ID NO:96), IPSINVHHY (SEQ ID NO:97)，FEQPTETPP (SEQ ID NO:98)，YAYIYTTYL (SEQ ID NO:99),QEFFffDANDIY (SEQ ID NO:100)，YEQHKITSY(SEQ ID NO:101),QEPMSIYVY(SEQ ID NO: 102),SEHPTFTSQY(SEQ ID NO:103),QAIRETVEL (SEQ ID NO: 104),TRATKMQVI (SEQ ID NO:105)，DALPGPCI (SEQ ID NO:106),CEDVPSGKL (SEQ ID NO: 107),HERNGFTVL (SEQ ID NO: 108),PTFTSQYRIQGKL (SEQ IDNO:109), QMWQARLTVCSEQ ID NO:110),HELLVLVKKAQL(SEQ ID NO: 111)，或 DDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO:112)，或其包含I至3处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体。
[0077]在所有方面的一个实施方案中，该β 2-微球蛋白为人β 2-微球蛋白。在一个实施方案中，该β 2-微球蛋白为野生型人β 2-微球蛋白。在一个实施方案中，该β2-微球蛋白由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成或是其包含I至10处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体。[0078]在所有方面的一个实施方案中，该β 2-微球蛋白为人β 2-微球蛋白且相对频率为10%或更多的I类MHC分子为人HLA-A*0201。在一个实施方案中，I类MHC分子的胞外域α 1、α 2和α 3由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列组成或是其包含I至10处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体。
[0079]在所有方面的一个实施方案中，经第一接头肽将病毒衍生肽融合至β2_微球蛋白。在一个实施方案中，将病毒衍生肽融合至β 2-微球蛋白的N端。
[0080]在所有方面的一个实施方案中，经第二接头肽将β 2-微球蛋白融合至I类MHC分子的胞外域α I。
[0081]在所有方面的一个实施方案中，经第三接头肽将I类MHC分子的胞外域α 3融合至二硫化物连接的多肽链之一。
[0082]在所有方面的一个实施方案中，第一、第二、和第三接头肽是相同或不同的。
[0083]在所有方面的一个实施方案中，第一接头肽、第二接头肽、和第三接头肽彼此独立选自氨基酸序列 GS(SEQ ID NO:12)、GGS(SEQ ID NO:13)、GGGS(SEQ ID NO:14)、GGGSGGGS(SEQ ID NO:15)、GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO:16)、GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID N0:17)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO:18)、GGGGS (SEQ ID NO:19)、GGGGSGGGGS (SEQ IDNO:20)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:22)、和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:23)。
[0084]在所有方面的一个实施方 案中，第一接头肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
[0085]在所有方面的一个实施方案中，第二接头肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
[0086]在所有方面的一个实施方案中，第三接头肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0087]在所有方面的一个实施方案中，抗体重链铰链区多肽选自IgG类或IgE类人抗体的抗体重链铰链区多肽。
[0088]在所有方面的一个实施方案中，抗体重链铰链区多肽选自IgGl或IgG2或IgG3或IgG4亚类人抗体的抗体重链铰链区多肽。
[0089]在所有方面的一个实施方案中，抗体重链铰链区多肽包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成:EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:24),EPKSADKTHTCPPCP(SEQ ID NO:25),ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:26), ERKCAVECPPCP (SEQ ID NO:27), ERKACVECPPCP (SEQ IDNO:28), ELKTPLGDTTHTCPRCP (EPKSCDTPPPCPRCP) 3 (SEQ ID NO:29), ESKYGPPCPSCP (SEQID NO:30), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:47), VECPPCP (SEQ ID NO:48), AVECPPCP (SEQ IDNO:49), DTTHTCPRCP (SEQ ID NO:50)，或 PPCPSCP (SEQ ID NO:51)。
[0090]在所有方面的一个实施方案中，第一二硫化物连接的多肽和/或第二二硫化物连接的多肽包含人起源的CH2域和/或CH3域。在一个实施方案中，人起源的CH2域和CH3是IgG或IgE类人抗体的。在一个实施方案中，CH2域和CH3域是IgGl，或IgG2，或IgG3，或IgG4亚类人抗体的。在一个实施方案中，CH2域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一个实施方案中，CH2域是IgGl或IgG2亚类人抗体的且包含E233，L234，L235，G236，D265，D270, N297, E318, K320, K322, A327, P329, A330，和 / 或 P331 中的至少一处突变(编号方式依照Kabat的EU索引)。在一个实施方案中，CH2域是IgGl亚类或人IgG2亚类人抗体的且具有突变L234A和L235A，和/或突变D265A和N297A，和/或包含PVA236突变，和/或包含突变P329G。在一个实施方案中，CH2域是IgGl亚类人抗体的且具有突变L234A和L235A和/或P329G。在一个实施方案中，CH2域是IgG4亚类人抗体的且具有突变S228P和/或L235E。在一个实施方案中，CH2域包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一个实施方案中，CH3域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
[0091]在所有方面的一个实施方案中，第一二硫化物连接的多肽包含SEQ ID N0:35的氨基酸序列且第二二硫化物连接的多肽包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
[0092]在所有方面的一个实施方案中，第一和第二二硫化物连接的多肽包含SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
[0093]在所有方面的一个实施方案中，第一二硫化物连接的多肽或第二二硫化物连接的多肽由SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成。
[0094]在所有方面的一个实施方案中，第一二硫化物连接的多肽包含SEQ ID N0:39的氨基酸序列和且第二二硫化物连接的多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。 [0095]在所有方面的一个实施方案中，通过一个或多个二硫键连接的多肽链是通过两个或三个或四个二硫键连接的。
[0096]在所有方面的一个实施方案中，该复合物特征在于该融合多肽以N至C端方向包含
[0097]⑴具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:09的氨基酸序列的病毒衍生肽，
[0098](ii)具有选自SEQ ID NO: 16，17，18，21，22，和23的氨基酸序列的第一接头肽，
[0099](iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列或是其包含I至10处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体的β 2-微球蛋白，
[0100](iv)具有选自SEQ ID勵:16，17，18，21，22，和23的氨基酸序列的第二接头肽。
[0101](V)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列或是其包含I至10处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3，和
[0102](vi)具有选自SEQ ID NO:12，16，17，18，21，22，和23的氨基酸序列的第三接头肽。
[0103]在所有方面的一个实施方案中，第一二硫化物连接的多肽和第二二硫化物连接的多肽进一步包含
[0104]-包含选自SEQID勵:31，32，和33的氨基酸序列的人1861012域，和
[0105]-包含选自SEQID NO:34，35，和36的氨基酸序列的人IgGlCH3域。
[0106]在所有方面的一个实施方案中，该复合物特征在于它包含
[0107]-一条融合多肽，其以N至C端方向包含
[0108]⑴有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:09的氨基酸序列的病毒衍生肽，
[0109](ii)具有选自SEQ ID N0:16，17，18，21，22，和23的氨基酸序列的第一接头肽，
[0110](iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列或是其包含I至10处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体的β 2-微球蛋白，
[0111](iv)具有选自SEQ ID NO: 16，17，18，21，22，和23的氨基酸序列的第二接头肽，
[0112](V)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列或是其包含I至10处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3，和
[0113](vi)具有选自SEQ ID NO:12，16，17，18，21，22，和23的氨基酸序列的第三接头肽，[0114] 和
[0115] -通过一个或多个二硫键连接的两条多肽链，
[0116]其中第一二硫化物连接的多肽链以N至C端方向包含
[0117](i)免疫球蛋白轻或重链可变域，
[0118](ii)免疫球蛋白轻或重链恒定域，
[0119](iii)包含选自 SEQ ID NO:24 至 SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO:47-51 的氨基酸序列的抗体重链铰链区多肽，
[0120](iv)包含选自SEQ ID NO:31，32，和33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和
[0121](V)包含选自SEQ ID NO:34，35，和36的氨基酸序列的人IgGlCH3域，
[0122]且第二二硫化物连接的多肽链以N至C端方向包含
[0123](i)包含选自 SEQ ID NO:24 至 SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO:47-51 的氨基酸序列的抗体重链铰链区多肽，
[0124](ii)包含选自SEQ ID NO:31，32，和33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和
[0125](iii)包含选自SEQ ID NO:34，35，和36的氨基酸序列的人IgGlCH3域，
[0126]其中该融合多肽
[0127]-共价结合至第二二硫化物连接的多肽链的C端或N端。
[0128]在所有方面的一个实施方案中，第一和第二二硫化物连接的多肽链包含相同的抗体重链铰链区多肽。
[0129]在所有方面的一个实施方案中，病毒衍生多肽包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列，第一接头肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，第二接头肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，第三接头肽包含SEQ ID N0:12的氨基酸序列，人IgGlCH2域包含SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列，且一条二硫化物连接的多肽的人IgGlCH3域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列且另一条二硫化物连接的多肽的人IgGlCH3域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
[0130]在所有方面的一个实施方案中，该复合物特征在于它包含
[0131]-—条融合多肽，其以N至C端方向包含
[0132]⑴具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:09的氨基酸序列的病毒衍生肽，
[0133](ii)具有选自SEQ ID NO:16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第一接头肽，
[0134](iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列或是其包含I至10处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体的β 2-微球蛋白，
[0135](iv)具有选自SEQ ID NO: 16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第二接头肽，
[0136](V)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列或是其包含I至10处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3，和
[0137](vi)具有选自SEQ ID NO:12，16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第三接头肽，
[0138]和
[0139]-通过一个或多个二硫键连接的两条多肽链，
[0140]其中第一二硫化物连接的多肽链以N至C端方向包含
[0141](i)免疫球蛋白轻或重链可变域，
[0142](ii)免疫球蛋白轻或重链恒定域，
[0143](iii)包含选自 SEQ ID NO:24 至 SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO:47-51 的氨基酸序列的抗体重链铰链区多肽，
[0144](iv)包含选自SEQ ID NO:31，32和33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和
[0145](V)包含选自SEQ ID NO:34，35和36的氨基酸序列的人IgGlCH3域，
[0146]且第二二硫化物连接的多肽链包含包含选自SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:47-51的氨基酸序列的抗体重链铰链区多肽，
[0147]其中该融合多肽
[0148]-共价结合至第一二硫化物连接的多肽链的C端或N端，或
[0149]-共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链可变域互补的抗体可变域的N端，或
[0150]-共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链恒定域互补的抗体恒定域的C端。
[0151]在所有方面的一个实施方案中，病毒衍生多肽包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列，第一接头肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，第二接头肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，第三接头肽包含SEQ ID N0:12的氨基酸序列，人IgGlCH2域包含SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列，且一条二硫化物连接的多肽的人IgGlCH3域包含SEQ ID N0:35的氨基酸序列且另一条二硫化物连接的多肽的人IgGlCH3域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
[0152]在所有方面的一个实施方案中，该复合物特征在于它包含
[0153]-—条融合多肽，其以N至C端方向包含
[0154]⑴具有选自SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:09的氨基酸序列的病毒衍生肽，
[0155](ii)具有选自SEQ ID NO:16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第一接头肽，
[0156](iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列或是其包含I至10处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体的β 2-微球蛋白，
[0157](iv)具有选自SEQ ID NO: 16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第二接头肽，
[0158](V)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列或是其包含I至10处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3，和
[0159](vi)具有选自SEQ ID NO:12，16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第三接头肽，
[0160]和
[0161]-通过一个或多个二硫键连接的两条多肽链，
[0162]其中第一和第二二硫化物连接的多肽链各自以N至C端方向包含
[0163](i)免疫球蛋白轻或重链可变域，
[0164](ii)免疫球蛋白轻或重链恒定域，
[0165](iii)包含选自 SEQ ID NO:24 至 SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO:47-51 的氨基酸序列的抗体重链铰链区多肽，
[0166](iv)包含选自SEQ ID NO:31，32和33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和
[0167](V)包含选自SEQ ID NO:34，35和36的氨基酸序列的人IgGlCH3域
[0168]其中该融合多肽
[0169]-共价结合至第二二硫化物连接的多肽链的C端或N端，或
[0170]-共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链可变域互补的抗体可变域的N端，或[0171]-共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链恒定域互补的抗体恒定域的C端，
[0172]前提是该复合物包含正好一条融合多肽。
[0173]在所有方面的一个实施方案中，病毒衍生多肽包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列，第一接头肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，第二接头肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，第三接头肽包含SEQ ID N0:12的氨基酸序列，人IgGlCH2域包含SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列，且一条二硫化物连接的多肽的人IgGlCH3域包含SEQ ID N0:35的氨基酸序列且另一条二硫化物连接的多肽的人IgGlCH3域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
[0174]在所有方面的一个实施方案中，
[0175]-第一接头肽包含SEQID NO:21的氨基酸序列，和/或
[0176]-第二接头肽包含SEQID NO:22的氨基酸序列，和/或
[0177]-第三接头肽包含SEQID NO: 12的氨基酸序列，和/或
[0178]-人IgGlCH2域包含SEQID NO:32或33的氨基酸序列，和/或
[0179]-一条二硫化物连接的多肽的人IgGlCH3域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列且`另一条二硫化物连接的多肽的人IgGlCH3域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
[0180]在所有方面的一个实施方案中，该病毒衍生肽选自下组:SEQ ID NO:01至SEQ IDNO:09, SEQ ID NO:52至包含I至3处氨基酸交换、添加、和/或删除的变体。
[0181]本文中报告的一个方面是一种核酸，其编码本文中报告的复合物。
[0182]在一个实施方案中，该核酸包含两个至四个表达盒，该表达盒包含编码氨基酸序列不同的多肽的结构基因。
[0183]本文中报告的一个方面是一种宿主细胞，其包含本文中报告的核酸。
[0184]本文中报告的一个方面是一种生成本文中报告的复合物的方法，包括培养本文中报告的宿主细胞，使得该复合物生成。
[0185]在一个实施方案中，自该细胞或培养基回收该复合物并由此生成该复合物。
[0186]本文中报告的一个方面是一种免疫缀合物，其包含本文中报告的复合物和细胞毒剂。
[0187]本文中报告的一个方面是一种药物配制剂，其包含本文中报告的复合物和任选的药学可接受载体。
[0188]在一个实施方案中，该药物配制剂进一步包含额外的治疗剂。
[0189]本文中报告的一个方面是本文中报告的复合物，用作药物。
[0190]本文中报告的一个方面是本文中报告的复合物，用于治疗癌症或慢性病毒感染。
[0191]本文中报告的一个方面是本文中报告的复合物，用于将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶物。
[0192]本文中报告的一个方面是本文中报告的复合物，用于清除癌细胞或病毒感染细胞。
[0193]本文中报告的一个方面是本文中报告的复合物在制备药物中的用途。
[0194]在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症或慢性病毒感染。
[0195]在一个实施方案中，该药物用于将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶物。[0196]在一个实施方案中，该药物用于清除癌细胞或病毒感染细胞。
[0197]本文中报告的一个方面是一种治疗具有癌症或慢性病毒感染的个体的方法，包括对该个体施用有效量的本文中报告的复合物。
[0198]在一个实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用额外的治疗剂。
[0199]本文中报告的一个方面是一种将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至个体中的靶物的方法，包括对该个体施用有效量的本文中报告的复合物以将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶物。
[0200]本文中报告的一个方面是一种清除个体中的癌细胞或病毒感染细胞的方法，包括对该个体施用有效量的本文中报告的复合物以清除/瓦解癌细胞或病毒感染细胞。
[0201]附图简述
[0202]图1本文中报告的复合物的注解图。
[0203]图2本文中报告的复合物中包含的例示性多肽:将融合多肽融合至抗体轻链或包含抗体重链铰链区的多肽的N端。
[0204]图3经相应表达质粒转染的HEK293细胞的细胞培养物上清液的SDS聚丙烯酰胺凝胶的Western印迹。用缀合有过氧化物酶的多克隆家兔抗人κ轻链抗体和缀合有辣根过氧化物酶的多克隆家兔抗人IgG抗体实施染色。
[0205]道:1:双臂肽-β 2-微球蛋白-HLA-A0201-1gG_Fc ;2:单臂肽-β 2_微球蛋白-HLA-A0201-1gG-Fc+IgG-Fc ；3:单臂肽-β 2-微球蛋白-HLA-A0201_IgG-重链+IgG-轻链+IgG-Fc ;4:单臂肽-β 2-微球蛋白-HLA-A0201-1gG-重链+IgG-重链+IgG-轻链；5:双臂β 2-微球蛋白-HLA-A0201-1gG-轻链+IgG-重链；6:双臂肽-β 2-微球蛋白-HLA-A0201-1gG-轻链+IgG-重链；7:双臂肽-β 2-微球蛋白-HLA-A0201_IgG-重链+IgG-轻链；8:双臂肽-β 2-微球蛋白-HLA-A0201-1gG-Fc-scFv ；9:单臂肽-β 2-微球蛋白-HLA-A0201-1gG-Fc+单臂IgG(重和轻链);10:分子量标志物；11:参照标准IgGl抗体。
[0206]图4流式细胞术分析，用于测定用特定肽体外刺激之前和之后来自不同供体的CMV特异性细胞裂解性T细胞的数目:4名人供体衍生外周血淋巴细胞(PBL)的分析；缀合有FITC标记物的抗CD8抗体染色(BD，产品目录号345772)与Pro5五聚体APC(ProImmune，产品目录号H)08-4A-E)组合来对识别加载有CMV衍生肽(NLVPMVATV，SEQ ID NO:01)的MHC-1类(HLA-A*0201)的TCR染色；圆圈:CMV特异性CD8+-T细胞。
[0207]图5流式细胞术分析，用于经由加载了 CMV肽的MN60肿瘤细胞的裂解，分析经刺激的CTL的细胞裂解能力。
[0208]图6经CMV脉冲的T细胞的T细胞特异性清除:流式细胞术分析，用于经由加载有CMV肽的MN60肿瘤细胞的裂解，分析经刺激的CTL的细胞裂解能力，根据效应对靶细胞比；黑色:加载有CMV肽的MN60细胞，白色:未加载CMV肽的MN60细胞。
[0209]图7A:考马斯染色的SDS-PAGE凝胶:I道:分子量标准，2道:单臂肽-β 2_微球蛋白-HLA-A0201-1gG-Fc+单臂IgG复合物(重和轻链)，非还原性条件；3道:单臂肽-β 2-微球蛋白-HLA-A0201-1gG-Fc+单臂IgG复合物(重和轻链)，还原性条件。
[0210]B:大小排阻层析层析图；1:高分子量形式(0.7面积％) ；2:单体复合物(99.3面积％)。
[0211]图8A:考马斯染色的SDS-PAGE凝胶:I道:分子量标准，2道:单臂肽-β 2_微球蛋白-HLA-A0201-1gG-重链+IgG-轻链+IgG-Fc复合物，非还原性条件；3道:单臂肽-β 2-微球蛋白-HLA-A0201-1gG-重链+IgG-轻链+IgG-Fc复合物，还原性条件。
[0212]B:大小排阻层析层析图；1:高分子量形式(1.8面积％) ；2:单体复合物(98.2面积％)。
[0213]图9本文中报告的复合物对人IGF-1R阳性细胞系的结合的分析，使用FACS ；
[0214]1:H460M2细胞，与单臂肽-β 2_微球蛋白-HLA-A0201_IgG-重链+IgG-轻链+IgG-Fc复合物一起温育，不染色；
[0215]2:H460M2细胞，与单臂肽-β 2_微球蛋白-HLA-A0201_IgG-重链+IgG-轻链+IgG-Fc复合物一起于4°C温育，用荧光标记的抗〈人IgG>抗体染色；
[0216]3:H460M2细胞，与单臂肽-β 2_微球蛋白-HLA-A0201_IgG-重链+IgG-轻链+IgG-Fc复合物一起于37°C温育，用荧光标记的抗〈人IgG>抗体染色；
[0217]4:H460M2细胞，与单臂肽-β 2_微球蛋白-HLA-A0201_IgG-重链+IgG-轻链+IgG-Fc复合物一起温育，用荧光标记的对照抗体(抗DIG抗体)染色；
[0218]5:H460M2细胞，用荧光标记的抗人IgG抗体染色；
[0219]6:H460M2细胞， 用荧光标记的抗人IGF-1R抗体染色。
[0220]图10本文中报告的抗原结合复合物介导的表达人IGF-1R的I243T3细胞(大贴壁生长细胞，白色箭头)的裂解的显微镜成像。裂解由人CMV特异性T细胞(小细胞，或是圆形，白色箭头，或是变形虫样迁移细胞，黑色箭头)介导。
[0221]图11在本文中报告的复合物缺失下，与人CMV特异性T细胞(小细胞，或是圆形，白色箭头，或是变形虫样迁移细胞，黑色箭头)一起温育的I243T3细胞(大贴壁生长细胞，白色箭头)的显微镜成像。
[0222]图12细胞毒性测定法:本文中报告的抗原结合复合物触发H460M2肿瘤细胞经由人CMV特异性T细胞的裂解。a) (6h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1: 1.5 ；b) (6h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1:0.75 ；c) (6h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1: 0.5 ;左柱:本文中报告的复合物；右柱:MAB IGF-1R-无岩藻糖基化。
[0223]图13细胞毒性测定法:本文中报告的抗原结合复合物触发I243T3肿瘤细胞经由人CMV特异性T细胞的裂解；a) (9h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1:1.5 ;b) (9h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1:0.75 ; c) (9h)靶细胞:CMV特异性效应T细胞1:0.5 ;左柱:本文中报告的复合物；中柱:MAB IGF-lR-afu ;右柱:MAB ed ;右柱:抗洋地黄毒苷抗体。
[0224]图14抗IGF-1R抗体和本文中报告的复合物对肺腺癌细胞系H460M2的结合的FACS分析；a)仅二抗(山羊抗人IgG(H+L) (Jackson Laboratories,产品目录号109-116-088)) ；b)本文中报告的复合物，其中融合多肽融合至只包含一对可变域的抗IGF-1R抗体的重链的N端；c)抗IGF-1R抗体。
[0225]图15本文中报告的不同复合物的体外功效和特异性(细胞毒性测定法)；a)包含单价抗IGFlR抗体和CMV衍生肽的复合物；b)包含单价抗IGFlR抗体和EBV衍生肽的复合物(对照)；c)包含二价抗IGFlR抗体和CMV衍生肽的复合物；d)抗IGF-1R抗体(对照)；e)抗洋地黄毒苷抗体(对照)。
[0226]图16本文中报告的复合物的体外功效和特异性(EC50值)，其中融合多肽融合至完整抗IGF-1R抗体的重链的N端，在不同靶(T)对效应(E)细胞比测定。[0227]图17靶细胞与a)复合物(其包含单价抗IGFlR抗体和包含CMV衍生肽的融合多肽)和b)抗IGF-1R抗体一起温育6小时后的裂解，靶对效应细胞比为1:1.5。
[0228]序列简述
[0229]SEQID NO:01人巨细胞病毒衍生肽。
[0230]SEQID NO:02人免疫缺陷病毒衍生肽。
[0231]SEQID NO:03人疱疹病毒4衍生肽。
[0232]SEQID NO:04甲型流感病毒衍生肽。
[0233]SEQID NO:05乙肝病毒衍生肽。
[0234]SEQID NO:06I型人T细胞亲淋巴病毒衍生肽。
[0235]SEQID NO:07V-jun肉瘤病毒17癌基因同系物(JUN)衍生肽。
[0236]SEQID NO:083型人腺病毒衍生肽。
[0237]SEQID NO:09丙肝病毒衍生肽。
[0238]SEQID NO:10人β 2_微球蛋白氨基酸序列。
[0239]SEQID NO:11人 HLA_A*0201 a 1-α 3 链氨基酸序列。
[0240]SEQID NO:12-23接头肽氨基酸序列。
[0241]SEQID NO:24人IgGl重链铰链多肽氨基酸序列。
[0242]SEQID NO:25人IgGl重链铰链变体多肽氨基酸序列。
[0243]SEQID NO:26人IgG2重链铰链多肽氨基酸序列。
[0244]SEQID NO:27人IgG2重链铰链变体多肽氨基酸序列。
[0245]SEQID NO:28人IgG2重链铰链变体多肽氨基酸序列。
[0246]SEQID NO:29人IgG3重链铰链多肽氨基酸序列。
[0247]SEQID NO:30人IgG4重链铰链多肽氨基酸序列。
[0248]SEQID NO:31人 IgGlCH2 域氨基酸序列。
[0249]SEQID NO:32人 IgGlCH2 域 L234A，L235A 突变体氨基酸序列。
[0250]SEQID NO:33人 IgGlCH2 域 L234A，L235A，P329G 氨基酸序列。
[0251]SEQID NO:34人 IgGlCH3 域氨基酸序列。
[0252]SEQID NO:35人IgGlCH3域结变体氨基酸序列。
[0253]SEQID NO:36人IgGlCH3域穴变体氨基酸序列。
[0254]SEQID NO:37人 IgGlFc 区氨基酸序列。
[0255]SEQID NO:38人 IgGlFc 区 L234A，L235A 突变体氨基酸序列。
[0256]SEQID NO:39人IgGlFc区L234A，L235A突变体和穴变体氨基酸序列。
[0257]SEQID NO:40人IgGlFc区L234A，L235A突变体和结变体氨基酸序列。
[0258]SEQID NO:41人源化抗IGF-1R单克隆轻链抗体氨基酸序列(κ )。
[0259]SEQ ID NO:42人源化抗IGF-1R单克隆重链抗体氨基酸序列(IgGlL234A, L235A 突变体)。
[0260]SEQID NO:43人源化抗IGF-1R单克隆重链抗体氨基酸序列(IgGlL234A, L235A突变体和结变体)。[0261]SEQ ID NO:44人源化抗IGF-1R单克隆重链抗体氨基酸序列(IgGlL234A, L235A突变体和穴变体)。
[0262]SEQ ID NO:45人IgGlFc区突变体铰链区和L234A，L235A突变体和结变体。
[0263]SEQ ID NO:46人源化抗IGF-1R单克隆抗体的二硫化物稳定的单链
Fv0
[0264]SEQ ID NO:47-51 缩短的人抗体重链铰链多肽氨基酸序列。
[0265]SEQ ID NO: 52-66 登革热病毒衍生肽。
[0266]SEQ ID NO:67-112人巨细胞病毒衍生肽。
[0267]发明详述
[0268]1.定义
[0269]“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
[0270]如本申请中使用的，术语“氨基酸”指羧基α-氨基酸组，其直接或以前体的形式可以由核酸编码。各种氨基酸通过由三个核苷酸组成的核酸(所谓的密码子或碱基三联体)编码。每一种氨基酸由至少一种密码子编码。这称作“遗传密码的简并性”。如本申请中使用的，术语“氨基酸”指天然称作的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母代码:ala，单字母代码:A)、精氨酸(arg, R)、天冬酰胺(asn, N)、天冬氨酸(asp, D)、半胱氨酸(cys, C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu, L)、赖氨酸(Iys,K)、甲硫氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe,F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser, S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp, W)、酪氨酸(tyr, Y)、和纟颜氨酸(val, V).
[0271]术语“抗靶抗体”和“结合靶的抗体”指能够以足够亲和力结合靶，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向靶的抗体。在某些实施方案中，结合靶的抗体具有< ΙΟηΜ、(InM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.0OlnM(例如 10_8M或更少，例如 I(T8M 至Ij 10_13M，例如 KT9M到I(T13M)的解离常数(Kd)。
[0272]本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
[0273]“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’ )2 ;双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv);单域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0274]抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类:IgA、IgD、IgE、IgGjP IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4UgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Y、和μ。
[0275]术语“相对频率为……的I类MHC分子”指在特定人群或所有人中具有给定相对频率的发生频率的各自I类MHC分子。就是说，可以在特定群体的所有人中的10%或更多中找到相对频率为10%或更多的I类MHC分子，诸如例如在欧洲裔的所有人中的27.2%中。
[0276]将复合物“缀合”至它的缀合配偶可以通过不同方法来实施，诸如化学结合或，或经由特异性结合对的结合。术语“缀合配偶”指例如多肽、可检测标记物、特异性结合对的成员。在一个实施方案中，将复合物缀合至它的缀合配偶通过化学结合来实施，该化学结合经由复合物的各部分的氨基酸序列的N端和/或ε -氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、羧基、巯基、羟基、和/或酚官能团，和/或碳水化合物结构的糖醇基团。在一个实施方案中，经由特异性结合对将复合物缀合至它的缀合配偶体。
[0277]在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于:放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素);化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法`仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体 '及各种抗肿瘤或抗癌剂。
[0278]色原(荧光或发光基团和染料)、酶、匪R活性基团或金属颗粒、半抗原(例如洋地黄毒苷)是“可操作标记物”的例子。可检测标记物还可以是光敏化交联基团，例如叠氮或吖丙啶(azirine)基团。可以通过电化学发光检测的金属螯合物也是合适的信号发射基团，特别感兴趣的是钌螯合物，例如钌(二吡啶基)32+螯合物。合适的钌标记基团记载于例如EP0580979、W090/05301、W090/11511和W092/14138中。关于直接检测，标记基团可选自任何已知可检测标记物基团，诸如染料、发光标记基团诸如化学发光基团，例如吖啶酯或二氧杂环丁烷(dioxetane))、或荧光染料例如荧光素、香豆素、若丹明、Pt|嗪、试卤灵、花青及其衍生物。标记基团的其它例子有发光金属复合物诸如钌或铕复合物、酶例如用于ELISA或CEDIA (克隆酶供体免疫测定法，例如EP-A-0061888)、和放射性同位素。
[0279]“效应器功能”指那些可归于抗体Fe区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
[0280]药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
[0281]如本文中使用的，术语“表达”指细胞内发生的转录和/或翻译和分泌过程。细胞中感兴趣核酸序列的转录水平可基于细胞中存在的相应mRNA的量来测定。例如，可以通过RT-PCR 或通过 Northern 印迹(参见 Sambrook, et al., Molecular Cloning:A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))对自感兴趣序列转录的mRNA量化。由核酸编码的多肽可通过多种方法来量化，例如通过ELISA、通过测定多肽的生物学活性、或通过采用不依赖此类活性的测定法诸如Western印迹或放射免疫测定法，使用识别并结合多肽的免疫球蛋白进行(参见Sambrook, et al.，(1989),见上文)。
[0282]“表达盒”指包含用于在细胞在至少表达所包含的核酸的必要调节元件(诸如启动子和聚腺苷酸化位点)的构建物。
[0283]术语“表达机制”指细胞中涉及始于核酸或基因的转录步骤(即也称作“基因表达机制”)，至由核酸编码的多肽的翻译后修饰的步骤的酶、辅因子、等的总和。表达机制例如包括DNA转录成pre-mRNA、pre-mRNA剪接成成熟mRNA、mRNA翻译成多肽、和多肽的翻译后修饰的步骤。
[0284]“表达质粒”指提供在宿主细胞中表达包含的结构基因的所有所需元件的核酸。通常,表达质粒包含原核质粒扩增单元，例如对于大肠杆菌，包含复制起点，以及选择标志、真核选择标志、和一种或多种用于表达感兴趣结构基因的表达盒(各自包含启动子、结构基因、和转录终止子，包括聚腺苷酸化信号)。基因表达通常置于启动子的控制下，而且此类结构基因称作“可操作连接至”启动子。类似地，如果调节元件调控核心启动子的活性，那么调节元件和核心启动子是可操作连接的。
[0285]本文中的术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fe区和变体Fe区。在一个实施方案中，人IgG重链Fe区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fe区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fe区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作 EU 索弓丨，如记载于 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991),NIH Publication91-3242。
[0286]“Fe区”是公知且基于抗体重链的木瓜蛋白酶切割定义的术语。在一个实施方案中，本文中报告的复合物可包含(以抗体重链铰链区多肽的形式)人Fe区或自人起源衍生的Fe区。在又一个实施方案中，Fe区是IgG4亚类的人抗体的Fe区或IgGl、IgG2、或IgG3亚类的人抗体的Fe区，它经过修饰，使得检测不到Fe Y受体(例如Fe y RIIIa)结合和/或Clq结合。在一个实施方案中，Fe区是人Fe区且尤其来自人IgG4亚类或来自人IgGl亚类的突变型Fe区。在一个实施方案中，Fe区来自人IgGl亚类，具有突变L234A和L235A。虽然IgG4显示降低的Fe Y受体(Fe YRIIIa)结合，但是针对其它IgG亚类的抗体显示强结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297 (丧失Fe碳水化合物)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、*/^PHis435是在改变后也提供降低的Fe Y受体结合的残基(Shields，R.L.，et al.，J.Biol.Chem.27 6(2001)6591-6604;Lund, J.，et al.，FASEB J.9(1995) 115-119;Morgan, A.，etal.，Immunology86 (1995) 319-324 ;EP0307434)。在一个实施方案中，本文中报告的复合物是关于IgG4亚类或者IgGl或IgG2亚类的Fe Y受体结合的，具有L234、L235、和/或D265中的突变，和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，突变为S228P、L234A、L235A、L235E、和/或PVA236 (PVA236表示来自IgGl氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG (以单字母氨基酸代码给出)或IgG4的EFLG用PVA替换)。在一个实施方案中，突变为IgG4的S228P，以及IgGl的L234A和L235A。抗体的Fe区直接涉及ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC (补体依赖性细胞毒性)。不结合Fe Y受体和/或补体因子Clq的复合物不引发抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。[0287]术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
[0288]术语“细胞”包括原核细胞(其用于质粒的繁殖)和真核细胞(其用于核酸表达)二者。在一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物选自下组:包含CHO细胞(例如CHO KUCHO DG44)、BHK细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、HEK293细胞、HEK293EBNA细胞、PER.C6?细胞、和COS细胞的哺乳动物细胞。
[0289]“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0290]“免疫缀合物”指缀合至一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)的本文中报告的复合物。 [0291]“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)、家兔、和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
[0292]“分离的”复合物指已经与其天然环境的组分分开的复合物。在一些实施方案中，复合物纯化至大于95%或99%的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。
[0293]“分离的”的核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
[0294]术语“一条融合多肽”指正好一条定义的融合多肽，排除别的定义的融合多肽的存在。术语“一条”指“正好一条”或“单条”。
[0295]“可操作连接”指两个或更多个部件的并置，其中所描述的部件处于允许它们以它们预定方式发挥功能的关系。例如，如果启动子和/或增强子顺式作用而控制或调控所连接的序列的转录，那么它与编码序列可操作连接。一般但非必要，“可操作连接的”DNA序列是邻接的，而且在必须连接两个蛋白质编码区诸如分泌前导和多肽的情况中，是邻接且符合读码框的。然而，虽然可操作连接的启动子一般位于编码序列的上游，但是它不必与编码序列邻接。增强子不必是邻接的。如果增强子提高编码序列的转录，那么增强子与编码序列是可操作连接的。可操作连接的增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游，而且距启动子可观的距离。如果聚腺苷酸化位点位于编码序列的下游末端，使得转录经由编码序列前行入聚腺苷酸化信号，那么它与编码序列是可操作连接的。如果翻译终止密码子位于编码序列的下游末端(3’端)，使得翻译经由编码序列前行至终止密码子且在那里终止，那么它与外显子核酸序列是可操作连接的。通过本领域已知的重组方法来实现连接，例如使用PCR方法和/或通过方便的限制性位点处的连接。如果不存在方便的限制性位点，那么依照常规实践使用合成寡核苷酸衔接头或接头。
[0296]术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信肩、O
[0297]术语“肽接头”指天然和/或合成起源的氨基酸序列。它们由线性氨基酸链组成，其中20种天然存在氨基酸是单体构件。肽接头具有I至50个氨基酸、(在一个实施方案中)1-28个氨基酸、(在又一个实施方案中)2-25个氨基酸的长度。肽接头可包含重复的氨基酸序列或天然存在多肽的序列。通过容许多肽正确折叠及正常呈现，接头具有确保彼此缀合的多肽能发挥它们的生物学活性的功能。在一个实施方案中，肽接头富含甘氨酸、谷氨酰胺、和/或丝氨酸残基。这些残基排列成例如多至五个氨基酸的小重复单元，诸如GS (SEQID NO: 12)、GGS (SEQ ID NO: 13)、GGGS (SEQ ID NO: 14)、和 GGGGS (SEQ ID NO:19) ? 这种小重复单元可重复一至五次。可以在多聚体单元的氨基和/或羧基末端添加多至六个额外的任意的、天然存在的氨基酸。其它合成肽接头由一种氨基酸构成，其重复10至20次且可在氨基和/或羧基末端包含多至六个额外的任意的、天然存在的氨基酸。所有肽接头可以由核酸分子编码且因此可以重组表达。因为接头自身是肽，所以由接头连接的多肽经由两个氨基酸之间形成的肽键连接至接头。
[0298]术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。
[0299]“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
[0300]“多肽”指由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论天然或合成生成的。少于约25个氨基酸残基的多肽可称作 “肽”，而由两条或更多条多肽或者包含超过100个氨基酸残基的一条多肽的分子可称作“蛋白质”。多肽还可包含非氨基酸成分，诸如碳水化合物基团、金属离子、羧酸酯。非氨基酸成分可以是由多肽在其中表达的细胞添加的，而且可以随细胞的类型而变化。多肽在本文中在它们的氨基酸主链结构或编码它的核酸方面定义。一般不规定添加诸如碳水化合物基团，但是仍然可以存在。
[0301]“结构基因”指基因中没有信号序列的区域，即编码区。
[0302]术语“T细胞应答引发肽”指I类MHC复合物的肽结合沟中呈现的且受到循环中的记忆或效应T细胞识别的肽。对该肽的识别导致招致呈现此类肽-1类MHC复合物的细胞清除的免疫应答。
[0303]在用于本文时，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
[0304]术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL) —般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR) ο (见例如Kindt, T.J.等Kuby Immunology,第6版，W.H.Freeman and C0.，N.Y.(2007)第91页)。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano, S.等，J.1mmunol.150 (1993) 880-887; Clarkson, T.等，Nature352 (1991) 624-628。
[0305]在用于本文时，术语“载体”指能够扩增与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体” 。
[0306]I1.组合物和方法
[0307]A.例示性复合物
[0308]本文中报告一种抗原结合复合物，其包含特异性结合靶抗原的抗体衍生部分(作为第一部分)和连接至MHC I类蛋白质复合物的病毒衍生肽(作为第二部分)。
[0309]凭借本文中报告的复合物，通过给个体现有的、循环中的病毒特异性细胞毒性T细胞(T记忆细胞和/或T效应细胞)装饰(模拟急性病毒感染的)MHC I类复合物，能将这些细胞引导至表达(复合物的抗体衍生部分特异性结合的)靶抗原的细胞。
[0310]一方面，本发明部分基于下述发现，即本文中报告的复合物可用于将个体现有的病毒特异性细胞毒性T细胞引导至模拟急性病毒感染的表达靶抗原的细胞，并由此可启动清除表达靶抗原的细胞，该复合物包含连接至MHC I类蛋白质的病毒衍生肽(作为第一部分)和抗体衍生的二硫化物连接的分子(作为第二部分)。
[0311]在某些实施方案中，提供一种复合物，其包含一条融合多肽，该融合多肽包含(i)病毒衍生肽，(ii)可溶性HLA-A等位基因A*0201，和(iii) β 2-微球蛋白。
[0312]本发明的复合物可用于例如各种疾病的诊断或治疗，像癌症或病毒感染。
[0313]一方面，本发明提供结合⑴细胞表面抗原和(ii)细胞毒性T细胞的融合多肽。在某些实施方案中，该融合多肽以≤IOnM的亲和力结合细胞表面抗原。
[0314]本文中报告的复合物利用天然存在的、高度有效的抗病毒免疫应答来清除/瓦解靶细胞，例如肿瘤细胞或病毒感染细胞。通过使用个体自己的非常有力的循环中的T细胞实现细胞清除，它们的激活不需要任何共刺激。另外，作用机制需要细胞表面上有少数治疗性分子(Mottez et al.,1995)。
[0315]在治疗期间，融合多肽能与免疫接种类似地触发个体的抗病毒免疫应答，并由此增强多重治疗/应用的功效。
[0316]虽然只有有限的患者群体属于特定同种异型(HLA-A同种异型:群体中30%至50%具有等位基因A*0201 )，而且特定病毒感染的流行也有限(CMV感染60%至90%，主要取决于年龄)，但是免疫接种作为预治疗可用于增强功效。
[0317]或者，可使用在群体内的频率非常低(在一个实施方案中，在1%以下)的同种异型。此类同种异型的使用可使得免疫接种步骤的使用废弃，因为个体的免疫系统会将该同种异型识别为外来的且会启动免疫应答。
[0318]靶向抗体需要是高度细胞或抗原特异性的以限制毒性和副作用。
[0319]如此，通过使用本文中报告的复合物，
[0320](i)只激活高度特异性的T细胞群体(对单一 MHC-肽复合物特异性的CD8阳性效应/记忆细胞)，不影响所有其它⑶3+细胞(⑶4+-T细胞:TH1，TH2, TH17，调节T细胞)；
[0321](ii)模拟个体免疫系统的天然应答(病毒感染细胞的天然清除)；和[0322](iii)对应用的响应在开始时会是较低的，但是在治疗期间能强化(特定T细胞会被激活并在数目上扩增)，由此可降低初始输注反应和初始细胞因子释放。
[0323]在一个实施方案中，该方法包括通过应用选定病毒衍生肽(例如人巨细胞病毒(HCMV)衍生肽)刺激⑶8阳性细胞毒性T细胞的步骤。
[0324]已经显示了激活的CMV肽特异性T细胞能在体外介导有效肿瘤细胞清除(在体外加载了 CMV衍生肽的肿瘤细胞)。
[0325]病毒感染细胞在它们的细胞表面上呈现病毒衍生肽及MHC I类蛋白质。这些受到清除/消减呈递细胞的特定CD8+T细胞识别。细胞裂解性(细胞毒性)CD8+-T细胞(CTL)通过它们的特定T细胞受体识别MHC I类蛋白质中的肽。CTL触发病毒感染细胞清除，不需要共刺激信号。
[0326]可使用可以用本文中报告的融合多肽中包含的CMV衍生肽预刺激的效应细胞，例如外周血单个核细胞(PBMC)或FACS分选的⑶8+-T细胞。
[0327]不得不识别要治疗的个体的HLA-同种异型。
[0328]根据NCBI，频率为10%或更多的HLA-同种异型的分布如下表所示。
[0329]表
[0330]
【权利要求】
1.一种用于在真核细胞中重组生产复合物的方法，该复合物包含:i) β 2-微球蛋白和I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3的融合多肽，ii) 一对自抗体铰链区衍生的二硫化物连接的多肽链，和iii)至少一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，该方法包括下述步骤: -培养包含一种或多种编码该复合物的核酸的真核细胞，并 -自该细胞或培养基回收该复合物， 其中该复合物包含β 2-微球蛋白和I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3的正好一条融合多肽。
2.依照权利要求1的方法，特征在于在培养基中以lmg/ml或更多的浓度获得该复合物。
3.依照前述权利要求任一项的方法，特征在于该真核细胞为哺乳动物细胞。
4.依照权利要求3的方法，特征在于该哺乳动物细胞为人胚肾细胞或中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞或小鼠骨髓瘤细胞。
5.依照前述权利要求任一项的方法，特征在于该融合多肽以N至C端方向包含β2-微球蛋白和相对频率小于1%的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3。
6.依照权利要求1至4任一项的方法，特征在于该融合多肽包含T细胞应答引发肽、β 2-微球蛋白和相对频率为1%或更多的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3。
7.依照前述权利要求任一项的方法，特征在于该自抗体铰链区衍生的二硫化物连接的多肽链i)通过一个或多个二硫键连接，?)第一二硫化物连接的多肽链以N至C端方向包含免疫球蛋白轻或重链可变域、免疫球蛋白轻或重链恒定域、和抗体重链铰链区多肽，且第二二硫化物连接的多肽链包含抗体重链铰链区多肽。
8.依照前述权利要求任一项的方法，特征在于该融合多肽i)共价结合至该二硫化物连接的多肽链之一的C端或N端，或ii)共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的关联重或轻链可变域互补的抗体可变域的N端,或iii)共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链恒定域互补的抗体恒定域的C端。
9.依照权利要求6至8任一项的方法，特征在于该T细胞应答引发肽为病毒衍生肽。
10.依照权利要求6至9任一项的方法，特征在于该融合多肽以N至C端方向包含 (i)具有选自SEQID NO:01至SEQ ID NO:09的氨基酸序列的病毒衍生肽， (ii)具有选自SEQID NO:16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第一接头肽， (iii)具有SEQID NO:10的氨基酸序列的β 2-微球蛋白， (iv)具有选自SEQID NO: 16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第二接头肽， (V)具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3，和 (vi)具有选自SEQ ID NO: 12，16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第三接头肽。
11.依照前述权利要求任一项的方法，特征在于第一二硫化物连接的多肽链和第二二硫化物连接的多肽链包含i)包含选自SEQ ID NO:31,32和33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和包含选自SEQ ID NO:34,35和36的氨基酸序列的人IgGlCH3域。
12.依照权利要求10至11任一项的方法，特征在于该复合物包含i)具有SEQID NO:21的氨基酸序列的第一接头肽，和/或ii)有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二接头肽，和/或iii)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的第三接头肽，和/或iv)具有SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和/或V)第一二硫化物连接的多肽中具有SEQ IDNO:35的氨基酸序列的人IgGlCH3域和第二二硫化物连接的多肽中具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的人IgGlCH3域。
13.一种复合物，特征在于它包含 -一条融合多肽，其以N至C端方向包含 (i)β 2-微球蛋白，和 (ii)相对频率小于1%的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3， 或 (i)T细胞应答引发肽， (ii)β2-微球蛋白，和 (iii)相对频率为1%或更多的I类MHC分子胞外域α1、α 2和α 3， 和 -通过一个或多个二硫键连接的两条多肽链， 其中第一二硫化物连接的多肽链以N至C端方向包含 (i)免疫球蛋白轻或重链可变域， (ii)免疫球蛋白轻或重链恒定域，和 (iii)抗体重链铰链区多肽， 且 其中第二二硫化物连接的多肽链包含抗体重链铰链区多肽，其中该融合多肽-共价结合至该二硫化物连接的多肽链之一的C端或N端，或-共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链可变域互补的抗体可变域的N端，或 -共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链恒定域互补的抗体恒定域的C端 前提是该复合物包含正好一条融合多肽。
14.权利要求13的复合物，特征在于该T细胞应答引发肽为病毒衍生肽。
15.权利要求13或14任一项的复合物，特征在于该融合多肽以N至C端方向包含 (i)具有选自SEQID NO:01至SEQ ID NO:09的氨基酸序列的病毒衍生肽， (ii)具有选自SEQID NO:16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第一接头肽。 (iii)具有SEQID NO:10的氨基酸序列的β 2-微球蛋白， (iv)具有选自SEQID NO: 16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第二接头肽。 (V)具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3，和 (vi)具有选自SEQ ID NO: 12，16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第三接头肽。
16.依照权利要求13至15任一项的复合物，特征在于第一二硫化物连接的多肽和第二二硫化物连接的多肽进一步包含 -包含选自SEQ ID NO:31，32和33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和 -包含选自SEQ ID NO:34，35和36的氨基酸序列的人IgGlCH3域。
17.依照权利要求15至16任一项的复合物，特征在于 -具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一接头肽，和/或 -具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二接头肽，和/或-具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的第三接头肽，和/或 -具有SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和/或 -一条二硫化物连接的多肽的人IgGlCH3域具有SEQ ID NO:35的氨 基酸序列且另一条二硫化物连接的多肽的人IgGlCH3域具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
18.一种核酸，其编码权利要求13至17任一项的复合物。
19.一种宿主细胞,其包含权利要求18的核酸。
20.一种药物配制剂，其包含依照权利要求13至17任一项的复合物和任选的药学可接受载体。
21.依照权利要求13至17任一项的复合物，用作药物。
22.依照权利要求13至17任一项的复合物，用于治疗癌症或慢性病毒感染。
23.依照权利要求13至17任一项的复合物，用于将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶物。
24.依照权利要求13至17任一项的复合物，用于清除癌细胞或病毒感染细胞。
25.依照权利要求13至17任一项的复合物在制备药物中的用途。
26.权利要求25的用途，其中该药物用于治疗癌症或慢性病毒感染。
27.权利要求25的用途，其中该药物用于将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶物。
28.权利要求25的用途，其中该药物用于清除癌细胞或病毒感染细胞。
29.—种将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至个体中的靶物的方法，包括对该个体施用有效量的依照权利要求13至17任一项的复合物以将个体的病毒特异性细胞毒性T细胞吸引至靶物。
30.一种清除个体中的癌细胞或病毒感染细胞的方法，包括对该个体施用有效量的依照权利要求13至17任一项的复合物以清除癌细胞或病毒感染细胞。
【文档编号】C07K14/705GK103649125SQ201280033335
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年6月19日 优先权日:2011年6月22日
【发明者】H.诺特根 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司