Wdr13作为用于治疗糖尿病和癌症的新的生物标志物的制作方法
【专利摘要】WD-重复蛋白种类繁多，但它们都是参与广泛的细胞功能的结构上关联的蛋白。该家族中的一个成员WDR13从鱼类到人类中都是保守的并定位在细胞核中。为了理解Wdr13基因的体内功能，我们创建并表征了缺乏该基因的突变小鼠品系。该突变小鼠由于β细胞增殖增强而具有较高的血清胰岛素水平和较高的胰岛质量。然而，一个已知的细胞周期抑制物p21在突变胰岛中被下调。在胰脏MIN6细胞系中过量表达WDR13导致p21的上调并伴随着细胞生长延迟。我们表明WDR13是胰脏β细胞增殖的新的负向调控者。免疫共沉淀实验显示该蛋白与雌激素受体和多种HDACs具有相互作用。我们提供了证据显示WDR13以HDAC依赖性和HDAC非依赖性两种方式来调控雌激素受体所介导的转录。鉴于Wdr13敲除小鼠中胰岛素水平较高，葡萄糖清除较好以及缺少胰岛素抵抗，我们提出该蛋白可能作为用于减轻糖尿病中受损的葡萄糖代谢的潜在候选药物靶标。
【专利说明】WDR13作为用于治疗糖尿病和癌症的新的生物标志物
发明领域
[0001]本发明涉及用作治疗糖尿病和癌症的药物靶标的生物标志物。进一步地，抑制Wdr13能够治疗精子减少症和精子缺乏症。本发明涉及缺失Wdrl3基因的小鼠突变株的产生和表征，由于β细胞增殖增强，使得胰岛素水平较高和胰岛质量增加，这导致年龄依赖性轻度肥胖表型。进一步地，该蛋白的过量表达引起Ρ21蛋白水平上调并且导致细胞生长延迟。
[0002]发明背景
[0003]WD重复蛋白属于结构上关联的蛋白的大家族，其成员具有多种多样的功能，例如细胞周期调控、转录、染色体组构和蛋白运输[1，2]。这些蛋白为蛋白-蛋白相互作用提供了平台。WDR13蛋白是该家族成员之一并且定位于细胞核[3]。Wdrl3基因在脊椎动物中高度保守并且表达于大多数组织中[4]，在胰脏、脑、睾丸和卵巢中表达水平最高。该基因在人和小鼠中分别定位于X染色体的Xpll.23和XAl.1位点处。在人中，包含该基因的X染色体缺失已经与精神发育迟缓、肥胖和干皮症相关[5，6，7，8]。已经鉴定出几种WD重复蛋白，其表达于胰脏β细胞中并且在β细胞的增殖中发挥作用[9，10]。
[0004]β细胞质量由新生/增殖和凋亡/坏死之间的平衡调控。在小鼠中，胰岛前体的分化和扩增是生命第一周前的细胞新生的原因[11，12]。其后，所存在的β细胞的扩增是新形成的β细胞的主要来源[13，14]。在病理情况下，可以存在α至β细胞的转分化
[15]。已经鉴定出多种在胰脏β细胞增殖中发挥作用的细胞周期调控物[16]。胰岛中的细胞周期进程受到细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物以及激素即雄激 素和雌激素的控制[16，17]。雌激素通过防止胰脏β细胞凋亡而提高胰脏β细胞的质量[17，18，19，20]。
[0005]胰岛质量、胰岛素的产生和体重是相互关联的[12，21]。在人[22]和啮齿目动物
[23]中胰岛素水平与肥胖正相关。一般来讲，肥胖使得对胰岛素产生的需求较高，通过β细胞质量增加能够达到相同效果。肥胖还是发生外周胰岛素抗性的主要风险因素[24]。胰岛素抗性使得对来自β细胞的胰岛素的需求进一步提高，引发β细胞衰竭。这导致β细胞存活缺陷、β细胞质量不足、β细胞的关键功能(例如葡萄糖刺激下分泌胰岛素)退化以及最终导致2型糖尿病。因此，产生胰岛素的β细胞的质量根据代谢情况动态变化[25，26]。或者，肥胖可能是胰岛素水平较高的结果[27，28，29]，因为胰岛素通过增加脂肪细胞中的脂质积累而对脂肪生成具有刺激作用[30，31，32]。胰岛素还参与脂肪细胞的存活
[33]。敲除脂肪组织特异性胰岛素受体防止肥胖发生，这强调了胰岛素至脂肪细胞的信号对于肥胖的发生十分重要[31]。M0R-1阿片样受体敲除的小鼠中胰岛素超分泌导致随年龄体重增加较多[29]，而CHOP敲除的小鼠通过增加胰岛素分泌而变得肥胖，尽管葡萄糖耐受未受影响[34]。
[0006]为了理解Wdrl3基因的体内作用，我们已经制备了缺少该基因的小鼠株，并且显示这些小鼠由于β细胞增殖较多而具有较高的胰岛质量，发展为胰岛素高血症和轻度肥胖。我们还鉴定出WDR13蛋白的几种相互作用的伴侣，并且提供了该蛋白可能用作转录阻遏物的证据。
[0007]定义:
[0008]WD-重复蛋白-该蛋白含有结构上保守的基序，一般以C末端处的二肽色氨酸-天门冬氨酸结束。然而，给定的WD-重复蛋白中重复的数量可以从4-16变化。
[0009]嵌合体(Chimaeras)-嵌合体(chimera)是在多种组织中具有基因上两种不同的细胞类型的单个有机体。
[0010]敲除小鼠-经基因改造的小鼠，其中通过利用人为干预而引入的一段DNA将染色体上的内源基因替代或破坏而使其失活。 [0011]肥胖-肥胖是一种身体状况，其中身体积累过多脂肪，所述过多脂肪可能具有负面的健康结果。
[0012]胰脏β细胞-胰岛中产生胰岛素的细胞被称为胰脏β细胞。
[0013]发明目的
[0014]本发明的主要目的是提供一种生物标志物WDR13蛋白，其具有Seq Id n0.1，能够用于治疗糖尿病和癌症。
[0015]本发明的另一个目的是提供一种WDR13基因靶向载体(Seq Id n0.2)。
[0016]本发明的另一个目的是提供一种通过增强β细胞增殖从而治疗糖尿病的方法。
[0017]本发明的另一个目的是提供一种治疗癌症的方法。
[0018]本发明的另一个目的是提供WDR13作为β细胞增殖的新的负向调控物的用途及
其应用。
[0019]本发明的另一个目的是提供WDR13作为雌激素受体所介导的转录阻遏物的用途。
[0020]本发明的另一个目的是提供WDR13蛋白及其下游靶标用于调节胰脏β细胞和睾丸精原细胞的用途。
[0021]本发明的另一个目的是提供TOR13敲除小鼠模型系统在癌症的多个时期研究癌症的演进的用途。
[0022]本发明的另一个目的是提供TOR13敲除小鼠模型系统在研究药物效果中的用途，所述药物选自包含具有抗增殖活性的组。
[0023]本发明的另一个目的是产生小鼠肿瘤模型系统，包括:
[0024]a.提供具有Seq Id no I的WDRl3基因
[0025]b.用步骤a.中获得的基因靶向ES。
[0026]c.由被靶向的ES细胞产生敲除小鼠
[0027]d.育种敲除小鼠
[0028]e.获得小鼠肿瘤模型
[0029]本发明的另一个目的是利用该方法制备小鼠肿瘤模型系统。
[0030]本发明的另一个目的是产生小鼠肿瘤模型系统。
[0031]总结
[0032]因此，本发明涉及WDR13蛋白用作治愈糖尿病和癌症的药物靶标的用途。为了阐述WD重复基因家族成员之一的Wdr 13基因的体内功能，我们制备了缺失该基因的小鼠株。在本研究中，我们显示WDR13是β细胞增殖的新的负向调控物。突变小鼠显示胰岛质量显著增高、血液胰岛素水平升高、年龄依赖性轻度肥胖和较好的葡萄糖清除，而没有任何胰岛素抗性的迹象。突变小鼠中β细胞增殖增强可能是由于已知的细胞周期抑制物p21的下调。与这些发现一致，MIN6细胞中WDR13的过量表达使得p21上调和细胞增殖延迟。最后，我们显示WDR13是β细胞增殖的新的负向调控物。WDRl3以HDAC依赖性和HDAC非依赖性两种方式充当雌激素受体所介导的转录阻遏物。[0033]在本发明的一个实施方案中，具有Seq Id n0.1的生物标志物用于治疗糖尿病和癌症。
[0034]在本发明的另一个实施方案中，具有Seq Id n0.2的表达构建体用于靶向WDR13基因，其由以下组成:
[0035]a.具有polyA的新霉素作为阳性选择标志物。
[0036]b.HSV-tk作为阴性选择标志物。
[0037]c.用于5’重组的1.6kb5’同源区。
[0038]d.用于3’重组的4.1kb3’同源区。
[0039]在本发明的另一个实施方案中，一种制备小鼠肿瘤模型系统的方法，包括:
[0040]a.提供如权利要求1中所述的Seq Id no I
[0041]b.制备WDR13靶向构建体
[0042]c.将如步骤b中所述的WDR13靶向构建体电穿孔入ES细胞中，
[0043]d.通过southern印迹对步骤c中获得的被革巴向的ES细胞克隆进行选择，
[0044]e.通过已知方法由步骤d中获得的被靶向ES细胞克隆产生敲除小鼠，
[0045]f.通过已知方法育种步骤e中获得的敲除小鼠，以达到种系传递，
[0046]g.获得小鼠肿瘤模型
[0047]在本发明的另一个实施方案中，用于在癌症的多个时期研究癌症的演进的肿瘤模型系统。
[0048]在本发明的另一个实施方案中，一种治疗癌症的方法，包括在MIN6细胞中利用腺病毒系统(100M0I)过量表达如权利要求1中所述的基因序列。
[0049]在本发明的另一个实施方案中，一种通过破坏β细胞中的生物标志物治疗糖尿病和增强β细胞增殖的方法。
[0050]在本发明的另一个实施方案中，WDR13作为β细胞增殖的负向调控物的用途。
[0051]在本发明的另一个实施方案中，WDR13作为以HDAC依赖性(ERa )和HDAC非依赖性(ERP)方式的雌激素受体阻遏物的用途。
[0052]在本发明的另一个实施方案中，WDR13蛋白及其下游靶标用于体内调节β细胞和睾丸精原细胞增殖的用途。
[0053]在本发明的另一个实施方案中，WDR13蛋白及其下游靶标在发现用于调节如权利要求9所述细胞增殖的药物中的用途。
[0054]在本发明的另一个实施方案中，TOR13敲除小鼠模型系统在研究药物效果中的用途，所述药物选自包含具有抗增殖活性的药物的组。
[0055]附图和表格简述:
[0056]图1.Wdrl3敲除小鼠的产生。A)靶向方案:用新霉素抗性标志物基因替代Wdrl3基因的内含子1(部分)、外显子2、内含子2和外显子3(部分)。B)利用来自5’末端的座位的700bp探针进行Southern印迹分析,其显示了来自野生型等位基因的9.3kb EcoRI片段和来自突变等位基因的3.8kb片段。C)利用Wdr13cDNA探针进行Northern印迹分析，其显示了 Wdrl3-/0小鼠中Wdrl3转录子的缺失(上图)和溴化乙锭染色作为上样对照(下图)。D)利用抗WDR13兔多克隆抗体(上图)对来自睾丸、胰脏和经纯化胰岛进行Western印迹分析，其显示了 Wdrl3-/0小鼠中WDR13蛋白的缺失和抗肌动蛋白作为上样对照(下图)。
[0057]图2.以正常食物饲养的Wdrl3敲除小鼠的体重、身体组成以及葡萄糖和胰岛素水平。A)正常食物下Wdrl3+/0雄性、Wdr13-/0雄性、Wdr13+/+雌性、Wdr13+/-雌性和Wdr13-/-雌性的生长曲线(η = 12)。B)Wdrl3_/0小鼠中增加的脂肪组织质量。C)ffdr13-/0小鼠附睾脂肪垫切片的H&E染色，其显示脂肪组织肥大。D) 12个月时雄性中附睾脂肪垫和雌性中卵巢脂肪垫的重量(η = 6)。Ε) 2个月和12个月时Wdrl3敲除小鼠中的16小时空腹葡萄糖水平。F)2个月和12个月时Wdrl3敲除小鼠中的随机餐后葡萄糖水平。G) 2个月和12个月时Wdr 13敲除小鼠中的空腹胰岛素水平。H) 2个月和12个月时Wdr 13敲除小鼠中的随机餐后胰岛素水平。
[0058]图3.以高脂饮食饲养的Wdrl3敲除小鼠的体重以及葡萄糖和胰岛素水平。A)高脂饮食下Wdrl3+/0雄性和Wdr13-/0雄性的生长曲线(n = 10至12)。B) 6个月时Wdr13-/0小鼠和其野生型同窝出生仔畜中的空腹和餐后胰岛素水平。C) 6个月时的胰岛素耐受测试(n = 8)。D) 6个月时的葡萄糖耐受测试(η = 8)。Ε) 6个月时应答于葡萄糖的体内胰岛素分泌(η = 4至6)。
[0059]图4.野生型和Wdrl3敲除小鼠的GTT和ITT。A)正常食物下2月龄时的GTT。B)正常食物下12月龄时的GTT。C)正常食物下2月龄时的ITT。D)高脂饮食下9月龄时的ITT。
[0060]图5.Wdrl3敲除小鼠的胰岛组织学和体外胰岛素分泌。A)利用H&E染色的胰岛形态学，其显示胰岛质量增加。B)高脂饮食下6个月时胰岛的质量(mg),其显示Wdrl3敲除小鼠中胰岛质量增加(η = 4)。C)2.8mM和16mM葡萄糖浓度下野生型和Wdr 13敲除小鼠由分离的胰岛的体外胰岛素分泌。
[0061]图6.Wdrl3敲除小鼠中胰脏β细胞的增殖和细胞周期调控物p21的相对表达。A)利用BrdU标记的胰脏β细胞增殖分析。B)利用BrdU标记的胰岛中正在分裂的细胞百分t匕。C)通过western印迹的、高脂饮食下6个月时Wdrl3敲除小鼠和其野生型同窝出生仔畜的胰岛中细胞周期抑制物P21的表达。在敲除小鼠的胰岛中p21的表达较少。
[0062]图7.Wdr13-/0小鼠中精原细胞的增殖和调亡。A)利用H&E染色的细精管形态。B)利用BrdU标记的细精管中精原细胞的增殖。C)细精管中BrdU标记指数。D)利用TUNEL染色的细精管中的凋亡细胞。E)细精管中的凋亡指数。
[0063]图8.MIN6和MCF7细胞系中WDR13蛋白的过量表达及其对细胞增殖速率的作用。A)用AdWdrl3和AdGFP病毒的转染显示WDR13蛋白在MIN6细胞中过量表达，如利用抗WDR13抗体通过免疫印迹所见。下图显示肌动蛋白作为上样对照。100M0I下72h后，WDR13蛋白的过量表达导致细胞增殖速率延迟(通过MTT测定和细胞计数二者)。B)在不依赖于雌二醇的MCF7细胞中用100M0I转染72h后，WDRl3蛋白的过量表达导致细胞增殖速率延迟(MTT测定)。C)WDR13蛋白的过量表达导致p21积累，而细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白El和p27的水平保持未受影响。D)利用p21特异性引物和对照通过染色质免疫沉淀揭示WDR13占据p21的启动子处。
[0064]图9.WDR13蛋白中LxxLL基序的存在。经过球形结构域过滤、结构过滤和上下文过滤后的ELM基序检索结果显示WDR13蛋白中存在NRBOX [377-383] CLNKLLL。
[0065]图10.与WDR13相互作用的蛋白的鉴定。A)利用抗FLAG抗体进行的Western印迹显示经pCMV-FLAG对照载体和具有Seq.1D N0.3A的pCMV-FLAG_Wdrl3载体转染后，HELA细胞中WDR13蛋白过量表达。下图显示β肌动蛋白作为上样对照。B)利用抗FLAG抗体对经pCMV-FLAG-Wdrl3(Seq.1D N0.3A)转染的HELA细胞中的WDR13蛋白进行的免疫定位。C)利用抗FLAG抗体来自用pCMV-FLAG对照和具有Seq.1D N0.3A的pCMV-FLAG_Wdrl3载体转染的HELA细胞中免疫沉淀的蛋白的银染凝胶。D)FLAG-NR2El(Seq.1D N0.6中的第922-2196位)/Myc-Wdr13共转染细胞的HEK293细胞裂解物与抗FLAG抗体免疫沉淀，随后用抗Myc抗体进行免疫印迹，其未显示NR2E1与WDR13蛋白之间的相互作用。通过FLAG或Myc特异性抗体，5%的上样量显示细胞裂解物中的蛋白表达。
[0066]图11.WDR13 与 ERs、HDACs 和 PHIPl 的相互作用。A)HEK293 细胞被用FLAG-Wdr 13 (Seq.1D N0.3A中的第922至2443位)和GFP-ER α共转染，在存在或不存在雌二醇下生长。细胞裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，并用抗GFP抗体进行免疫印迹。5%的上样量显示用FLAG或GFP特异性抗体的蛋白表达。B)HEK293细胞被用FLAG-Wdr13 (Seq.1D N0.3A 中的第 922 至 2443 位)和 Myc-Er β I (Seq.1D N0.5 中的第 900-2673 位)共转染，在存在或不存在雌二醇下生长。细胞裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，并用抗Myc抗体进行免疫印迹。5%的上样量显示用FLAG或Myc特异性抗体的蛋白表达。C)HEK293细胞被用Myc-Wdr13 (Seq.1D N0.3B中的第900至2448位)/多种FLAG-HDACs共转染，细胞裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，并用抗Myc抗体进行免疫印迹。使用FLAG或Myc特异性抗体，5%的上样量显示蛋白表达。D)HEK293细胞被用FLAG-Wdr 13/My c-PHI PI共转染，细胞裂解物用抗FLAG抗 体进行免疫沉淀，并用抗Myc抗体进行免疫印迹。使用FLAG或Myc特异性抗体，5%的上样量显示蛋白表达。E)在ERa或ERP存在下HEK293细胞中WDRl3对ERE-TATA-LUC报告基因的阻遏。TSA，一种HADCs抑制物，在ER a的情况下缓解这种阻遏。细胞在24孔板中用ERE-TATA-LUC(250ng)、βgal(50ng)、ERa 或 ERP (50ng)、Wdr13 (250ng)转染，一式3份，并在转染后30h测定荧光素酶和β gal的活性。用β gal的数值标准化荧光素酶数值。
[0067]发明详述
实施例
[0068]以下实施例以阐述本发明的方式给出，因此其不应当被视为限制本发明的范围。
[0069]实施例1:
[0070]Wdrl3敲除小鼠的产生
[0071]Wdrl3是位于X染色体上的单拷贝基因[4]。靶向策略设计为用含有polyA的新霉素基因盒取代内源性基因的内含子I (部分)、外显子2、内含子2和外显子3 (部分)(图1A)。为了构建Wdrl3基因靶向载体(Seq ID n0.1)，将来自该基因的包含外显子I至外显子 7 的 7.1kb HindIII 片段亚克隆入 pBluescrip IIKS 载体(Stratagene)中。用 pMClneoPoly A(Stratagene)的Xho1-SalI片段替代来自该片段的跨越外显子2和外显子3 (部分)的1.35kb区域。为了进一步富集靶向事件，在Wdrl3基因同源序列的5，末端前置入负向选择性HSV-tk基因。所得载体在5’和3’末端分别具有1.6kb和4.1kb的同源序列。将40微克线性化靶向载体DNA电穿孔入RlES细胞中。用G418(0.25mg/ml)和更昔洛韦(2 μ M)对ES细胞进行选择。为了鉴定被靶向的克隆，从ES细胞中分离出基因组DNA，并利用来自该5’末端的座位的700bp EcoRV-BamHI片段作为探针进行southern杂交(图1B)。将被靶向的克隆之一注射入3.5-dpc C57BL/6的胚泡中，并将后者转移入⑶I假妊娠雌性的子宫中。为了获得突变等位基因的种系传递，使嵌合雄性小鼠与CDl雌性配对。通过southern分析证实种系传递。使用PCR利用来自Wdrl3座位的引物对(表1)和来自新霉素的另一个引物对对突变小鼠进行常规筛选。
[0072]表1-引物列表
[0073]
【权利要求】
1.一种表达构建体，其具有用于靶向Seq Id N0.1所示的WDR13基因的Seq Id N0.2，包括: a.作为阳性选择标志物的具有polyA的新霉素。 b.作为阴性选择标志物的HSV-tk。 c.用于5’重组的1.6kb5’同源区。 d.用于3’重组的4.1kb3’同源区。
2.一种制备小鼠肿瘤模型系统的方法，其包括:
a.提供Seq Id no I, b.制备如权利要求1中所述的TOR13靶向构建体 c.将如步骤b中所述的WDR13靶向构建体电穿孔入ES细胞中， d.通过southern印迹对步骤c中获得的祀向的ES细胞克隆进行选择， e.通过已知方法由步骤d中获得的靶向的ES细胞克隆产生敲除小鼠， f.通过已知方法育种步骤e中获得的敲除小鼠，以达到种系传递， g.获得小鼠肿瘤模型。
3.如权利要求2中所述的肿瘤模型系统，其用于在小鼠的多个时期研究癌症的演进。
4.一种治疗癌症的方法，其包括在MIN6细胞中利用腺病毒系统(100M0I)过量表达具有Seq Id.n0.1的基因。
5.一种治疗糖尿病和增强β细胞增殖的方法，其通过破坏β细胞中具有Seq Id n0.1的基因治疗糖尿病和增强β细胞增殖。
6.具有SeqId n0.1的WDR13基因作为生物标志物用于治疗糖尿病和癌症的用途。
7.WDR13作为β细胞增殖的负向调控物的用途。
8.WDRl3作为以HDAC依赖性(ERa )和HDAC非依赖性(ERi3)方式的雌激素受体阻遏物的用途。
9.WDR13蛋白及其下游靶标用于体内调节β细胞和睾丸精原细胞增殖的用途。
10.WDR13蛋白及其下游靶标在发现用于调节如权利要求9所述细胞增殖的药物中的用途。
11.WDR13敲除小鼠模型系统在研究药物效果中的用途，所述药物选自包含具有抗增殖活性的药物的组。
【文档编号】C07K14/47GK103702555SQ201280034542
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年4月27日 优先权日:2011年5月11日
【发明者】萨蒂什·库马, 维贾伊·普拉塔普·辛格 申请人:印度科学工业研究所