平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法，将单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质单独使用或者与单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质组合使用，作为填料进行层析。本发明克服了原工艺周期长效率低、产品纯度低的不足，得到高纯度的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物，纯度用HPLC方法测定，按面积百分比计，达到97%以上。将所述铜螯合物进一步经脱铜后，即得到高纯度的平阳霉素及其同族化合物，提高了临床用药的安全性。
【专利说明】平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属药物化学及分离纯化【技术领域】，具体涉及一种平阳霉素及其同族化合物 的铜螯合物的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 平阳霉素（Pingyangmycin)及其同族化合物博安霉素（Boanmycin)、博宁霉素 (Boningmycin)是由我国学者自主研制开发的抗肿瘤抗生素，其中平阳霉素和博安霉素已 投入临床应用，它们都属博来霉素家族。进口的博来霉素（bleomycin)主要成分为博莱霉 素 A2和B2,平阳霉素与博来霉素 A5的结构相同，博安霉素与博来霉素 A6的结构相同，博宁 霉素是博安霉素末端氨体游离氨基的乙酰化物。平阳霉素现被收载于中华人民共和国药典 二部（2010版)，是我国临床较常用的抗癌药物。
[0003] 临床前研究表明，平阳霉素及其同族化合物博安霉素、博宁霉素对一系列的移植 性肿瘤以及裸鼠移植的人体癌瘤均有显著疗效，同时对小鼠的急性毒性和肺毒性明显低于 博莱霉素。
[0004] 临床研究表明，平阳霉素对头颈部癌瘤、淋巴瘤等有较好的疗效，尤其对于口腔科 癌瘤有显著疗效。平阳霉素很少抑制脊髓造血系统及免疫功能，可与其他化疗药物联合， 可用于因前期治疗造血功能已经受损的患者。目前平阳霉素临床应用已得到进一步扩展， 尤其在用于治疗血管瘤、淋巴管瘤以及尖锐湿疣及眼科的翼状胬肉效果显著。近年来单克 隆抗体与平阳霉素的偶联物在动物实验显示具有高度疗效作用，提示其在研制抗体靶向药 物中的潜在价值【甄永苏等，抗肿瘤抗生素平阳霉素研究与临床应用40年，抗生素杂质， 2009, vol34 (10)，577?580】。博安霉素对头颈部肿瘤有显著的疗效，对脊髓造血系统及免 疫功能影响小，且肺毒性低，并且对肝癌细胞也有较强的抑制作用。博宁霉素除抗肿瘤作用 夕卜，对银屑病、溢脂性皮炎和乳头瘤病毒引起的尖锐湿疣、扁平疣等有良好的作用。
[0005] 平阳霉素目前的生产工艺是先经微生物发酵产生平阳霉素等十余种组分组成的 复合物，然后加入铜盐形成平阳霉素铜螯合物，再经反复离子交换柱层析分离纯化得到较 高纯度的平阳霉素铜螯合物，再经脱铜处理，得到平阳霉素【许鸿章等，平阳霉素的分离和 鉴别，药学学报，1980, voll5(10)，609?614】。博安霉素和博宁霉素的生产工艺与平阳 霉素类似，都是由微生物发酵，然后形成铜螯合物，经过纯化后再脱铜得到博安霉素和博宁 霉素【许鸿章等，争光霉素 A6和它在争光霉素复合物的地位，药学学报，1988, V〇123 (9)， 667?671】。博宁霉素也可以由博安霉素含铜品通过化学合成的方法乙酰化而得到博宁霉 素含铜品，再脱铜得到博宁霉素。
[0006] 平阳霉素铜螯合物具有鲜艳的蓝色，较原化合物稳定，是平阳霉素及其同族化合 物生产工艺中的重要中间体。由于平阳霉素及其同族化合物和铜螯合物为极性很大的水溶 性成分，分离纯化有相当的难度，因此铜螯合物的纯度成为制约平阳霉素及其同族化合物 最终产品质量的瓶颈。目前它们铜螯合物的分离纯化一直使用离子交换凝胶填料，主要为 葡聚糖骨架的CM-sephadex-C-25填料。该填料溶胀率高，在不同的盐溶液中体积变化很 大，为非刚性填料，不能加压，为达到较高的分离度，柱径比一般在30以上，使得每个循环 的周期很长，无法实现快速分离，整体效率低下。同时由于CM-sephadex-C-25本身的分离 度不是很高，造成有些杂质无法去除，使得最终产品的纯度不高，质量较低。中华人民共和 国药典二部（2010版）盐酸平阳霉素项下规定本品按干燥品计，含盐酸平阳霉素不得少于 85. 0%，明显低于一般化药的要求。目前在市场流通的盐酸平阳霉素冻干粉针剂，用药典的 液相条件检测，按照面积百分比计，纯度在92%左右(如下表1及图1)。博安霉素情况相似， 这和当前的平阳霉素及其同族化合物和铜螯合物分离纯化的工艺水平密切相关。
[0007] 表 1
[0008] PDA Chi 254nm 4nm
[0009]
【权利要求】
1. 一种平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法，其特征在于， 选用单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质作为填料进行层析，粒径20?60 μ m，粒径 波动范围〈5 μ m，孔径100'、-4000A； 取平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物粗品用超纯水溶解加到用超纯水或流动相平 衡的层析柱上，柱高与柱径比15?40 :1，层析柱载量5?50mg/ml，用0?20%的甲醇、乙 醇、丙酮水溶液等度洗脱或梯度洗脱，洗脱流速〇. 5?2mV (min · cm2);单次层析后，回收， 同上法再经2?3次层析，即得高纯度的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介 质优选苏州纳微生物科技有限公司的UniPS?-20、UniPS?-30、UniPS?-40或UniPS?-50系 列填料产品。
3. 根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，孔径优选为100A、300A、500A、 80〇Α、ΙΟΟΟΑ，或 4000A。
4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，优选用10%的甲醇等度洗脱。
5. -种平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法，其特征在于， 将单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质与单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交 换层析介质组合，作为填料进行层析； 所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质，粒径20?60 μ m，粒径波动范围 〈5 μ m，孔径】00?4000A;所述的单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质，粒径 30?70 μ m，粒径波动范围〈5 μ m，孔径丨00?1200A
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析 介质优选苏州纳微生物科技有限公司的UniPS?-20、UniPS?-30、UniPS?-40或UniPS?-50 系列填料产品；所述的单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质优选苏州纳微生 物科技有限公司的UniMSP-30或UniMSP-50系列填料产品。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯 层析介质的孔径优选为100A、300A、500A、800A、1000A，或4000A,所述的单分散聚 甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质的孔径优选为500A、750A或IOOOA
8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，取平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物 粗品或用单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质初步纯化后的样品，用超纯水溶解加到用 超纯水平衡的层析柱上，柱高与柱径比15?40 :1，以单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子 交换层析介质为填料进行层析，层析柱载量5?50mg/ml，用不同浓度的氯化铵或甲酸铵的 水溶液梯度洗脱，洗脱流速〇. 5?2mV (min ^m2)，单次层析、脱盐后，再用单分散聚苯乙烯 /二乙烯基苯层析介质再次层析；回收含铜螯合物粗品，经以上组合同法再循环层析1?3 次，即得高纯度的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物。
9. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物 粗品先用单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质纯化1?3次后，再用分散聚 苯乙烯/二乙烯基苯层析介质纯化，直至纯度达到97%以上。
10. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物 粗品先用单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质纯化1?3次，再用单分散聚甲基丙烯酸 酯混合型阳离子交换层析介质纯化，直至纯度达到97%以上。
【文档编号】C07K1/18GK104231057SQ201310251987
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月21日 优先权日:2013年6月21日
【发明者】曾佳烽, 潘俊芳, 王启运, 吴光明, 于国庆, 冯子群, 张士花, 黄靖安 申请人:上海和臣医药工程有限公司