一种小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法，利用超声波破碎法对小球藻进行破壁处理；采用表面活性剂对类囊体膜上的色素蛋白进行增溶；采用硫酸铵分级沉降、离子交换层析及凝胶过滤层析纯化叶黄素蛋白复合体；利用全波长扫描及高效液相色谱对复合体的色素组成进行分析；得到的叶黄素蛋白复合体具有显著的ABTS自由基清除活性。本发明利用表面活性剂增溶色素蛋白可保证复合体结构与功能的稳定；通过柱层析法得到纯化的叶黄素蛋白复合体，纯化工艺简单，便于生产放大，以复合体形式存在的叶黄素既提高了稳定性又保有其抗氧化活性。
【专利说明】一种小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]叶黄素(Lutein)，又名“植物黄体素”，是一类天然存在的含氧类胡萝卜素，广泛存在于高等植物和藻类中，具有抗氧化、保护视力、抗肿瘤以及防止动脉粥样硬化等一系列显著的生理活性。但叶黄素单体由于水溶性差、对光和氧气均不稳定,在应用上存在一定的局限性。天然存在的叶黄素由于本身的疏水性，可通过与脂蛋白的疏水域相互作用形成叶黄素蛋白复合体，以此维持自身稳定并发挥生理活性。在高等植物和藻类中，叶黄素与叶绿素等捕光色素与膜蛋白结合在一起，形成捕光色素蛋白复合体，定位于叶绿体类囊体膜上，在光合作用过程中发挥光能传递作用。
[0003]小球藻是一类单细胞绿藻，其细胞中含有丰富的类胡萝卜素，主要为叶黄素，含量可达0.2-0.8%(干重)。目前，对小球藻中叶黄素的研究主要集中在小球藻异样培养提取叶黄素及对其生理功效的研究，而鲜少涉及叶黄素蛋白复合体的相关研究。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对上述领域研究的不足，提供一种从小球藻中提取叶黄素蛋白复合体的方法，利用表面活性剂增溶色素蛋白可保证复合体结构与功能的稳定；通过柱层析法得到纯化的叶黄素蛋白复合体，纯化工艺简单，便于生产放大，以复合体形式存在的叶黄素既提高了稳定性又保有其显著抗氧化活性。
[0005]本发明中小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法，包括如下步骤:
(1)、小球藻破碎:利用超声波破碎法破碎小球藻细胞，收集类囊体膜沉淀；
(2)、色素蛋白粗提:利用表面活性剂对色素蛋白进行增溶提取；
(3)、硫酸铵分级沉降:通过质量分数为20%-80%硫酸铵分级沉降初步纯化色素蛋白；
(4)、柱层析:利用DEAE阴离子交换层析及SephadexG-50凝胶过滤层析对色素蛋白进一步分离纯化，得到叶黄素蛋白复合体。
[0006]步骤(1)中小球藻破碎操作如下:首先在小球藻藻泥中以w/v 1:1-3加入蒸馏水，在4-10°C、5000-6000r/min下离心10-30分钟,进行清洗,收集沉淀；清洗后的藻泥以w/v1:1-4加入10-50mM、pH6.0-7.5的缓冲液，混匀后在冰水浴中进行超声波破碎，超声条件为功率600W，超声时间30-40分钟，运行2s，间歇3s，破碎后在4_10°C、5000_6000r/min下离心10-20分钟，去除未破碎细胞，上清液在4-10°C、13000-15000r/min下离心30-40分钟，收集沉淀，即为类囊体膜沉淀。
[0007]步骤(2)中，所述色素蛋白粗提具体操作如下:用10_50mM、pH6.0-7.5的缓冲液悬浮类囊体膜沉淀，调节膜组分叶绿素a含量为0.1-1.5mg/mL，加入表面活性剂使终浓度质量分数达到0.5%-1.5%，4-10°C下缓慢搅拌避光增溶12-18h后，11000-13000r/min离心30-40min，取上清液，即为色素蛋白粗提液。
[0008]硫酸铵分级沉降后，以w/v 1:5-10加入10-50mM、pH6.0-7.5的缓冲液溶解沉淀，用相同的缓冲液在4-10°C下透析24-36h，期间更换3-4次缓冲液，透析结束后4_10°C、11000-13000r/min离心15-20分钟，收集上清液。
[0009]步骤(4)中，所述柱层析具体操作如下:透析后的色素蛋白溶液上样到预先用10-50mM、pH6.0-7.5，含0.0 lwt.%表面活性剂的缓冲液平衡好的DEAE阴离子交换色谱柱上，洗去未吸附的蛋白后，用含(TlM NaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱，流速为5-6mL/10min,在280nm和443nm波长下分别测定样品吸光值，收集A443/A280比值较大的组分，经过超滤浓缩后，上样到预先用10-50mM、pH6.0-7.5，含20mM NaCl及0.01wt.%表面活性剂的缓冲液平衡好的Sephadex G_50凝胶过滤色谱，相同缓冲液进行洗脱，流速为
3.0-5.0mL/10min，在280nm和443nm波长下测定样品吸光值，收集相应色素蛋白组分，即为所述叶黄素蛋白复合体。
[0010]提取到的叶黄素蛋白复合体具有抗氧化活性。
[0011]DEAE阴离子交换层析柱为Toyopearl DEAE-650M ;其中表面活性剂为Tween-20、Chaps ;缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris —盐酸缓冲液。
[0012]本发明优点在于:立足于天然存在的叶黄素蛋白复合体稳定性强及小球藻中叶黄素含量高的优点，以小球藻为原材料，利用非离子型表面活性剂从类囊体膜上增溶出结构与功能完整的叶黄素蛋白 复合体，并利用柱层析等方法对其进行分离纯化。本发明利用常规分离纯化方法、便于生产放大，得到的叶黄素蛋白复合体既提高了叶黄素的稳定性又具有显著的抗氧化活性，为叶黄素等其他色素蛋白复合体的分离纯化及其在食品、药品、饲料等中的开发利用提供理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1 A为DEAE阴离子交换层析洗脱曲线，B为P4的SDS-PAGE图，C为S印hadexG-50凝胶过滤层析洗脱曲线。
[0014]图2为色素蛋白粗提液及纯化后的叶黄素蛋白复合体全波长扫描图谱。
[0015]图3 A为叶黄素蛋白复合体的HPLC分析，B为HPLC分析得叶黄素标样含量(y)与峰面积(X)的线性关系。
[0016]图4为叶黄素蛋白复合体的ABTS自由基清除活性。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
第一步:称取50g冻存于-20°C的小球藻藻泥，4°C下融化后加入少量蒸馏水，4°C、5000r/min离心IOmin,收集沉淀。沉淀在相同条件下离心清洗3次。清洗后的藻泥加入50mL磷酸盐缓冲液(20mM、pH7.0)，混匀后在冰水浴中进行超声破碎(超声条件:功率600W，超声时间:30min,运行2s,间歇3s)。破碎后于4°C、5000r/min条件下离心IOmin去除未破碎细胞，再用14000r/min离心30min，收集沉淀，即为类囊体膜。
[0018]第二步:用20mM、pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮类囊体膜沉淀，调节叶绿素a含量为
1.5mg/mL，加入Tween-20使其终浓度质量分数达到1%，4°C下缓慢搅拌避光增溶12h后，12000r/min离心30min,取上清液，即为色素蛋白粗提液。
[0019]第三步:在粗提液中加入固体硫酸铵使其饱和度达到20%，完全溶解后4°C下静置4h，12000r/min离心20min，收集上清液，加入固体硫酸铵使其饱和度达到80%，完全溶解后4°C下静置12h，12000r/min离心20min，收集沉淀，以少量磷酸盐缓冲液溶解后，用相同的缓冲液在4°C下透析24h,期间更换3次缓冲液,透析结束后4°C、12000rpm离心15min,收
集上清液。
[0020]第四步:透析后的上清液上样到预先用20mM、pH7.0,含0.01wt.% Tween-20磷酸盐缓冲液平衡好的Toyopearl DEAE-650M阴离子交换层析柱上，洗去未吸附的蛋白后，用含(TlM NaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱。流速为5mL/10min，280nm和443nm波长下分别测定样品吸光值。该复合物经过DEAE阴离子交换色谱后，得到5个峰，如图1-A所示。其中，P4峰在443nm处叶黄素组分的吸光值与280nm处蛋白组分吸光值之比A443/A280最大值约为1.67。通过SDS-PAGE对P4峰纯度进行鉴定发现已达到电泳纯，分子量约为29.0kDa(图 1-B)。
[0021]第五步:经阴离子交换层析得到的P4峰超滤浓缩后，上样到预先用20mM、pH7.0，含2OmM NaCl及0.01wt.% Tween-20磷酸盐缓冲液平衡好的Sephadex G-50凝胶过滤层析柱上，相同缓冲液进行洗脱，流速为3mL/10min。从洗脱曲线(图1_C)可看出，P4峰经凝胶过滤层析后在280nm及443nm波长下均只出现单一吸收峰，且出峰位置完全重合，由此证实P4峰为叶黄素结合蛋白，命名为LPC。
[0022]LPC全波长扫描图谱如图2所示，481nm处的吸收峰证明样品中有叶黄素存在，而425nm和670nm处的吸收峰则由叶绿素引起。
[0023]分光光度法测定样品叶绿素含量。样品加入4倍体积丙酮，充分混匀后暗处浸提20min, 12000r/min离心5min取上清液，分别测定645nm及663nm处吸光值，叶绿素含量按下式计算:
【权利要求】
1.一种小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)小球藻破碎:利用超声波破碎法破碎小球藻细胞，收集类囊体膜沉淀； (2)色素蛋白粗提:利用表面活性剂对色素蛋白进行增溶提取； (3)硫酸铵分级沉降:通过质量分数为20%-80%硫酸铵分级沉降初步纯化色素蛋白； (4)柱层析:利用DEAE阴离子交换层析及SephadexG-50凝胶过滤层析对色素蛋白进一步分离纯化，得到叶黄素蛋白复合体。
2.根据权利要求1所述小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法，其特征在于:步骤(I)中小球藻破碎操作如下:首先在小球藻藻泥中以w/v 1:1-3加入蒸馏水，在4-10°C、5000-6000r/min下离心10-30分钟,进行清洗,收集沉淀；清洗后的藻泥以w/v 1:1-4加入10-50mM、pH6.0-7.5的缓冲液，混匀后在冰水浴中进行超声波破碎，超声条件为功率600W，超声时间30-40分钟，运行2s，间歇3s，破碎后在4-10°C、5000-6000r/min下离心10-20分钟，去除未破碎细胞，上清液在4-10°C、13000-15000r/min下离心30-40分钟，收集沉淀，即为类囊体膜沉淀。
3.根据权利要求1所述小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法，其特征在于:步骤(2)中，所述色素蛋白粗提具体操作如下:用10-50mM、pH6.0-7.5的缓冲液悬浮类囊体膜沉淀，调节膜组分叶绿素a含量为0.1-1.5mg/mL，加入表面活性剂使终浓度质量分数达到0.5%-1.5%，4-10°C下缓慢搅拌避光增溶 12-18h 后，11000_13000r/min 离心 30_40min，取上清液，即为色素蛋白粗提液。
4.根据权利要求1所述小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法，其特征在于:硫酸铵分级沉降后， 以w/v 1:5-10加入10-50mM、pH6.0-7.5的缓冲液溶解沉淀，用相同的缓冲液在4-10°C下透析24-36h，期间更换3-4次缓冲液，透析结束后4_10°C、11000-13000r/min离心15-20分钟，收集上清液。
5.根据权利要求1所述小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法，其特征在于:步骤(4)中，所述柱层析具体操作如下:透析后的色素蛋白溶液上样到预先用10-50mM、pH6.0-7.5，含0.01wt.%表面活性剂的缓冲液平衡好的DEAE阴离子交换色谱柱上，洗去未吸附的蛋白后，用含(TlM NaCl的上述缓冲液进行梯度洗脱，流速为5-6mL/10min，在280nm和443nm波长下分别测定样品吸光值，收集A443/A280比值较大的组分，经过超滤浓缩后，上样到预先用10-50mM、pH6.0-7.5，含20mM NaCl及0.01wt.%表面活性剂缓冲液平衡好的Sephadex G-50凝胶过滤色谱,相同缓冲液进行洗脱,流速为3-5mL/10min,在280nm和443nm波长下测定样品吸光值，收集相应色素蛋白组分，即为所述叶黄素蛋白复合体。
6.根据权利要求1所述方法所制得的小球藻叶黄素蛋白复合体，其特征在于:提取到的叶黄素蛋白复合体具有抗氧化活性。
7.根据权利要求1所述小球藻叶黄素蛋白复合体的提取与纯化方法，其特征在于:DEAE阴离子交换层析柱为Toyopearl DEAE-650M。
8.根据权利要求1或3或5所述的方法，其特征在于:表面活性剂为Tween-20、Chaps。
9.根据权利要求2或3或4或5所述的方法，其特征在于:缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris 一盐酸缓冲液。
【文档编号】C07K1/30GK103613648SQ201310568462
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】汪少芸, 林祥志, 蔡茜茜, 杨倩, 赵立娜, 张 林, 杨善军, 荣辉, 王昭凯 申请人:福州大学