从脱盐乳清粉中分离β-乳球蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从脱盐乳清粉中分离β-乳球蛋白的方法，以脱盐乳清粉为处理对象，依次经硫酸铵盐析、首次超滤脱盐、第一次离子交换层析、二次超滤脱盐、第二次离子交换层析、凝胶层析最后分离得纯度较高的β-乳球蛋白，该方法与现有技术相比，存在以下优点：1.操作方便，过程简化，对所涉及仪器要求不高，可在中小型实验室内操作；2.对操作人员要求不高，便于推广使用；3.β-乳球蛋白分离纯度较高，条带清晰，分离彻底；4.适用范围广，可分离不同的蛋白质。
【专利说明】从脱盐乳清粉中分离β-乳球蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离纯化β-乳球蛋白的方法，具体地说是从脱盐乳清粉中分离β-乳球蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]牛乳乳清曾经一度被认为是牛乳加工过程中产生的废弃物，由于处理乳清的工艺成本昂贵，一般只将其进行简单的喷雾干燥加工成乳清粉或浓缩乳清蛋白(whey proteinisolate, WPI)等低价的商品。但是，随着新的工艺和加工方法的诞生，使得人们对乳清蛋白的生物学活性有了新的认识，研究发现乳清含有多种有营养、生物学活性和食品功能性的蛋白质。其中，乳清蛋白的主要成分β -乳球蛋白(β-1actoglobulin, β-LG)及其肽段在乳品、肉制品和面包生产的食品加工方面以及功能性食品的开发方面具有广泛的应用前景。主要表现在β-LG在食品加工中的一些功能特性。
[0003]凝胶性:β -LG的一级结构包含有5个半胱氨酸(Cys)残基，其中的4个Cys残基组成了两个二硫键，剩余的I个Cys游离的巯基可以在通过分子间或分子内二硫键的交替作用形成凝胶。根据凝胶条件的不同，可以分为热凝胶和冷凝胶；根据凝胶显微结构的不同，又可分为透明凝胶 和不透明凝胶。在凝胶化过程中，通过控制温度、PH和离子强度等简单化学条件可以对β-LG的凝胶性质进行调控。这种凝胶形成的“灵活性”扩大了 β_ LG的实际应用领域。β-LG可以应用于改良的鱼肉制品、肉制品加工以及对持水性和质地有要求的许多配方食品中。现今，一些生产产商已经通过改变加热条件形成β- LG凝胶的方法来模仿和替代脱脂食品中的动物脂肪。此外，在盐的条件下，β_ LG能够形成一个细丝网状的冷凝胶结构，研究人员将该结构用来捕获铁离子，作为对铁的保护和运输。
[0004]起泡性:对于很多食品来说，蛋白质的起泡性对其特性的影响是至关重要的，例如砂糖和蛋白掺制的糕饼、冰激凌、松软的白雪蛋糕和奶油杏仁糖等。其中，鸡蛋清在食品加工中的一个最重要的特性是能够形成具有一定体积并且高度稳定的泡沫。但是鸡蛋清的成本相对昂贵，所以寻找一种低成本、高质量的鸡蛋清代替物就显得尤为重要。相比之下，β-LG具有较好的发泡性质和热稳定性；并且在糖存在的条件下，仍然具有和鸡蛋清相同的发泡性和热稳定性。因此，在砂糖和蛋白掺制的糕饼中，添加β-LG的组分可以作为节省成本的鸡蛋清代替物。
[0005]乳化性:β -LG在水溶液中的乳化性和溶解性高，具有很广泛的pH稳定性，特别是低pH、高温条件下稳定。此外，β-LG由于含有许多必需氨基酸，相对于其他的乳清蛋白来说还具有很高的营养价值。β -LG的这些特性使得其运用于多种富含蛋白质的饮料中，例如果汁和运动饮品和许多具有长货架期的饮料。在冰激凌生产中，良好的乳化性能提高冰激凌混合料体系的粘度和凝冻性；特别是将β_ LG作为脂肪替代品加入到低脂产品中，能大幅度改良口感、质地，并在高级冰激凌中替代蛋白粉。
[0006]在食品加工中的其它应用:除此之外β-LG由于其特殊的功能特性在食品工业中的应用十分广泛。例如，视黄醇、维生素E这一类的疏水性营养素必须使用溶剂或载体才能添加到食品中，而β-LG具有结合这类疏水性小分子的能力，将β-LG作为载体与视黄醇和维生素E结合，可以应用于强化低脂食品中；此外，瞬时超高温灭菌乳(ultrahightemperature, UHT)在贮藏过程中出现的凝集现象会影响产品品质，而受到加热变性的β-LG可以减缓凝集作用；因此，在生乳中添加β- LG不但能增加乳清蛋白的浓度，还能解决UHT乳在贮藏中的凝集问题来延长货架期。
[0007]β -LG具有特殊的分子结构和理化特性，使得其在食品加工产业中成为不可或缺的一种乳清蛋白或低成本的蛋白替代物。虽然，β-LG是婴儿牛乳过敏症的主要致敏原，消除乳清中的β_乳球蛋白也是国内外研究的热点，但随着β-LG应用研究的不断深入，其不利的一面最终会得到解决，其开发价值将逐步显现。食品加工业需要简单、低成本的物料，β -LG特殊的理化特性更有利于纯化分离从而应用到生产加工中。
[0008]乳清蛋白是一种混合蛋白质，约占牛奶中蛋白质成分的20%。乳清蛋白中的主要成分分别为:β -乳球蛋白约48%(含有游离一SH基、是牛奶加热风味来源之一)、α -乳白蛋白(a -Lactalbumin, α -La)约19%、蛋白酶约20%、免疫球蛋白约8%、牛血清蛋白5%以及少量的其他组分(如乳铁蛋白和乳过氧化物酶等)。β_乳球蛋白是牛奶当中蛋白质的一种，约占牛乳乳清蛋白总量的48%，是牛乳乳清蛋白中最主要的成分。β_乳球蛋白的分子量约为18.4KDa，PI为5.13。α -乳白蛋白也是一种主要的乳清蛋白，约占牛乳乳清蛋白总量的19%，α -乳白蛋白的分子量为14.2KDa, pi为4.20-4.50。
【发明内容】
[0009]针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种从脱盐乳清粉中分离β_乳球蛋白的方法。
[0010]所述从脱盐乳清粉中分离β-乳球蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成:
1)硫酸铵盐析:将脱盐乳清粉溶于蒸馏水中，然后向水溶液中加入饱和度为75%的硫酸铵，搅拌使其充分溶解后静置3h，离心取沉淀物，得蛋白初提物；该步骤利用中性盐硫酸铵来破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两大因素，故能使蛋白质发生沉淀。不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，故盐析所需要的盐浓度不同，从而将蛋白质分离，如用硫酸铵分离清蛋白和球蛋白，在半饱和的硫酸铵溶液中，球蛋白即可从混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在饱和硫酸铵中才会沉淀。且不会使蛋白质发生变性；
2)首次超滤脱盐:将步骤I)制得的蛋白初提物用PBS溶液溶解后加蒸馏水用超滤脱盐机进行首次超滤脱盐，将硫酸铵完全脱去后，将剩余的100mL蛋白液离心，取上清液得首次滤液，将首次滤液置于4摄氏度冰箱中保存，待用；使用超滤脱盐设备通过渗透膜使得离子等小分子随水分子除去，与透析袋原理相似，但效率远高于透析法。同时还有浓缩的作用；
3)第一次离子交换层析:将步骤2)制得的首次滤液,过DEAE-SepharoseFast Flow阴离子交换柱上样进行分离；收集不同时间段洗脱出的样品跑SDS-PAGE电泳，将分离效果好的样品液收集，得首次蛋白液，将首次蛋白液置于4摄氏度冰箱中保存，待用；该步骤通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。[0011]4) 二次超滤脱盐:将首次蛋白液加水后于超滤脱盐机中进行二次超滤脱盐后离心，取上清液得二次滤液，将二次滤液置于4摄氏度冰箱中保存，待用；
5)第二次离子交换层析:将二次滤液过DEAE-SepharoseFast Flow阴离子交换柱上样进行分离；收集不同时间段洗脱液洗脱出的样品跑SDS-PAGE电泳，将分离效果好的样品液收集，得二次蛋白液，将~二次蛋白液直于4摄氏度冰箱中保存,待用；
6)凝胶层析:将二次蛋白液过SephadexG-100柱进行凝胶过滤，用NaCl水溶液进行洗脱，收集洗脱液进行标号，将不同标号的洗脱液分别跑电泳，收集纯度好的样品进行浓缩得β -乳球蛋白，置于4摄氏度冰箱冷冻保存。该步骤采用葡聚糖凝胶层析，葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2_环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
[0012]所述的从脱盐乳清粉中分离β -乳球蛋白的方法，其特征在于步骤I)中所述的脱盐乳清粉以料液的重量体积比为0.8-1:10的蒸馏水进行溶解；所述脱盐乳清粉与硫酸铵的重量比为1:1.7-2。
[0013]所述的从脱盐乳清粉中分离β -乳球蛋白的方法，其特征在于步骤I)中所述的离心转速为8000r/min,离心时间为15min。
[0014]所述的从脱盐乳清粉中分离β -乳球蛋白的方法，其特征在于步骤3)所述的第一次离子交换层析的具体步骤为:
a.装柱:装柱时避免气泡进入柱子内，保证柱面的平整；
b.上样:上样前离心首次滤液中的不溶物，上样量为40-50ml，上样后300ml的
0.1molPBS 缓冲液；
c.洗脱:先用IL浓度为3%的NaCl洗脱液洗脱，再用IL浓度为5%的NaCl洗脱液洗脱，所述NaCl洗脱液用0.1mol的PBS配制；
d.洗柱:收集完后用洗柱液洗柱，洗柱液用ImolNaCl和ImolNaOH溶于IL纯水中。
[0015]所述的从脱盐乳清粉中分离β -乳球蛋白的方法，其特征在于步骤5)第二次离子交换层析中洗脱液的浓度为3%NaCl洗脱液，所述NaCl洗脱液用0.1mol的PBS配制，洗脱液洗脱体积为2L。
[0016]所述的从脱盐乳清粉中分离β -乳球蛋白的方法，其特征在于步骤6)中凝胶层析中NaCl水溶液的浓度为0.5%。
[0017]所述的从脱盐乳清粉中分离β -乳球蛋白的方法，其特征在于步骤3)和步骤5)中的洗脱液在进行洗脱前均要过膜处理。
[0018]本发明与现有技术相比，存在以下有益效果:1.操作方便，过程简化，对所涉及仪器要求不高，可在中小型实验室内操作；
2.对操作人员要求不高，便于推广使用；
3.β -乳球蛋白分离纯度较高，条带清晰，分离彻底；
4.适用范围广，可分离不同的蛋白质。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为硫酸铵分级盐析获得的分级蛋白电泳图；
图2为第一次离子交换层析不同段洗脱液电泳图；
图3为第一次离子交换层析不同段洗脱液电泳图；
图4为第二次离子交换层析不同段洗脱液电泳图；
图5为第二次离子交换层析不同段洗脱液电泳图；
图6为凝胶层析后分离出的β-乳球蛋白与标准品的电泳图。
【具体实施方式】
[0020]本发明下面结合具体实施例予以进一步详述。
实施例
[0021]1.硫酸铵分级盐析
实验步骤:可大致将分级盐析分为4级，硫酸铵饱和度25%、50%、75%、90%。取140g脱盐乳清粉溶于1500ml蒸馏水中，先向溶液中加入饱和度为25%的硫酸铵，搅拌使其充分溶解，静置3h后离心15min，离心速度为8000r/min。取上清液再加入饱和度为50%的硫酸铵，重复以上步骤，所加硫酸铵的量分别为171g、237g、264g、167g。将获得的分级蛋白跑电泳，通过比较样品的电泳图来判断在哪个饱和度下分级盐析效果较好，由图1可知:75%主要蛋白含量高、且蛋白种类少，故选用75%浓度梯度盐析所得的蛋白初提物。其中，图1中:1代表饱和度为25%的硫酸铵，2代表饱和度为50%的硫酸铵，3代表饱和度为75%的硫酸铵，4代表饱和度为90%的硫酸铵。
[0022]2.首次超滤脱盐
上述步骤所获得的蛋白初提物含有大量的硫酸铵，会影响下一步阴离子交换层析，故将上述的产物经超滤除盐，具体为将蛋白初提物20ml溶于60-80ml PBS溶液中，溶解后用超滤脱盐机进行首次超滤脱盐，在脱盐过程中不断加水直至将硫酸铵完全脱去后将剩余的蛋白液离心取上清液，置于4摄氏度冰箱中保存，待用。
[0023]3.第一次离子交换层析
取分级盐析效果最好的一组用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱进行进一步分离，步骤如下:
(1)离子交换剂的选择:根据待分离样品β_乳球蛋白以及乳清中其它蛋白的等电点本实验选择的离子交换DEAE-Sepharose ；
(2)装柱:装柱时注意不要让气泡进入柱子内，并且要保证柱面的平整；
(3)上样:上样前离心样品中的不溶物，避免柱子中的填料被堵住影响实验，上样量在45ml，上样后过300ml的0.1mol的PBS缓冲液；(4)洗脱:先用3%的NaCl洗脱，洗脱体积为1L，再用5%的NaCl洗脱，洗脱体积为1L，实验所用的洗脱液均用0.1mol的PBS配制，洗脱体积为2L ；
(5)洗柱:收集完后用洗柱液洗柱，洗柱液用ImolNaCl和ImolNaOH溶于IL的纯水中；
(6)收集不同时间段洗脱出的样品，并将收集的样品跑SDS-PAGE电泳，见图2-3，看收集到的样品中哪一段中β乳球蛋白的纯度较好，其中，1-13为取样，收集分离效果较好的这一段。将每一次上样后所收集到的分离效果较好的蛋白液放在4摄氏度冰箱中保存，以待下一次分离。
[0024]4.二次超滤脱盐
因为第一次阴离子交换层析后所获得的样品中还含有较多的非目标蛋白，所以将第一次阴离子交换后所收集到的蛋白液再进行超滤脱盐，进行第二次的阴离子交换层析，以获得更高纯度的β_乳球蛋白。
[0025]5.第二次阴离子交换
将二次超滤脱盐后的蛋白样品进行下一步的阴离子交换层析，步骤与第一次阴离子交换层析基本相同，但第二次阴离子交换层析的洗脱液的浓度均在3%，收集不同时间段洗脱液洗脱出的样品跑电泳，见图3-4，图中1-14为取样样本，将分离效果好的样品液收集，得二次蛋白液，将二次蛋白液置于4摄氏度冰箱中保存，待用。注意两次阴离子交换所用的溶液均要过膜处理，以免杂质将柱子的填料堵住影响实验。
[0026]第二次阴离子交换完成后要对树脂进行再生，一般可用0.5-lmol的酸、碱反复处理，本实验的树脂处理顺序为碱、酸、碱。
[0027]6.凝胶层析
将经过离子交换层析的样品进一步进行凝胶过滤，本次试验依据待分离蛋白质的分子量(β-乳球蛋白:18.3KDa, α-乳白蛋白 14.3KDa)选用 Sephadex G-100 (4_150KDa)。
[0028]凝胶的预处理:采用“热法”溶胀，即在沸水浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温至沸腾。在凝胶溶胀和处理过程中，不能进行剧烈的搅拌，严禁使用电磁搅拌器，因为这样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片，以致影响层析的流速。
[0029]装柱:向柱中加入约1/3高度的洗脱液，在搅拌下，将烧杯中的凝胶悬浮液均匀、连续地倾入柱中，待底面上沉积起l_2cm的凝胶柱床后，打开柱的出口，随着下面水的流出，上面不断加凝胶悬浮液，这样凝胶颗粒便连续缓慢沉降，待沉积到离柱的顶端约3-5cm处停止装柱。
[0030]平衡:新柱装成后先用0.5%的NaCl平衡，大致过1000ml的0.5%的NaCl。
[0031]样品上柱及洗脱上样量在5ml左右，上样后用0.5%的氯化钠溶液洗脱，分布收集洗脱下来的样品并标号。选取适合的管号进行电泳测所获得的β_乳球蛋白的纯度，将纯度较好的样品再和标准品一起电泳比较，见图6，图中1，3-9为取样样本，2为标准品，收集纯度较好的样品并进行浓缩冷冻保存。
[0032]上述各视图中，由图1-5可知:经过两次阴离子交换层析以及一次凝胶层析，样品中的杂质蛋白逐渐减少，纯度进一步提高。由图6可知:样品中已无其他杂质蛋白存在，且与95%β -乳球蛋白标准品纯度对比较为相近。
[0033]上述实验中几个蛋白质分离步骤均要用不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质纯度，具体步骤如下:(1)灌制=15%的分离胶和5%的堆积胶:
①15% 分离胶(IOml):A 液(5ml)，B 液(2.5ml)，蒸馏水(2.5ml)，10% 过硫酸铵(80 μ I)，四甲基乙二胺(15μ1);
②5%的堆积胶(8ml):A液(1.34ml)，C液(2.0ml)，蒸馏水(4.6ml)，10%过硫酸铵(100μ 1)，四甲基乙二胺(20μ I)；
⑵选管:取各盐析段分离得蛋白溶液进行电泳，注意取管时要有代表性，一头一尾一定要取；
(3)跑电泳:样品在堆积胶中时，恒定电流15毫安，进入分离胶后，恒定电流在25毫
安;
(4)染色:用考马斯亮蓝G-250染色，在摇床上37°C，90r/min摇2.5h ；
(5)脱色:染色后回收染色液并将分离胶用水冲洗后加入脱色液，加入脱色液后在摇床上以37°C，90r/min的条件摇4h ；
(6)拍照:将脱色后的分离胶拍照观察，看收集到的样品中β_乳球蛋白的纯度如何。
[0034]其中，A液:丙烯酰胺储液1000ml (存于棕色瓶中4摄氏度存放)一配方:29.2g丙烯酰胺(Acr)+0.8gN-N’ -亚甲基双丙烯酰胺(Bis),加蒸懼水至1000ml。
[0035]B 液:4X (4 摄氏度存放)一75ml 2mol/L Tris-HCl (PH8.8)+4mllO%SDS+46ml 蒸馏水。
[0036]C 液:4X (4 摄氏度存放)-50ml lmol/L Tris-HCl (PH6.8)+4ml 4%SDS+ 46ml 蒸馏水。
【权利要求】
1.从脱盐乳清粉中分离β-乳球蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成: I)硫酸铵盐析:将脱盐乳清粉溶于蒸馏水中，然后向水溶液中加入饱和度为75%的硫酸铵，搅拌使其充分溶解后静置3h，离心取沉淀物，得蛋白初提物； 2)首次超滤脱盐:将步骤I)制得的蛋白初提物用PBS溶液溶解后加蒸馏水用超滤脱盐机进行首次超滤脱盐，将硫酸铵完全脱去后，将剩余的100mL蛋白液离心，取上清液得首次滤液，将首次滤液置于4摄氏度冰箱中保存,待用； 3)第一次离子交换层析:将步骤2)制得的首次滤液,过DEAE-SepharoseFast Flow阴离子交换柱上样进行分离；收集不同时间段洗脱出的样品跑SDS-PAGE电泳，将分离效果好的样品液收集，得首次蛋白液，将首次蛋白液置于4摄氏度冰箱中保存，待用； 4)二次超滤脱盐:将首次蛋白液加水后于超滤脱盐机中进行二次超滤脱盐后离心，取上清液得二次滤液，将二次滤液置于4摄氏度冰箱中保存，待用； 5)第二次离子交换层析:将二次滤液过DEAE-SepharoseFast Flow阴离子交换柱上样进行分离；收集不同时间段洗脱液洗脱出的样品跑SDS-PAGE电泳，将分离效果好的样品液收集，得二次蛋白液，将二次蛋白液直于4摄氏度冰箱中保存,待用； 6)凝胶层析:将二次蛋白液过SephadexG-100柱进行凝胶过滤，用NaCl水溶液进行洗脱，收集洗脱液进行标号，将不同标号的洗脱液分别跑电泳，收集纯度好的样品进行浓缩得乳球蛋白，置于4摄氏度冰箱冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的从脱盐乳清粉中分离β_乳球蛋白的方法，其特征在于步骤O中所述的脱盐乳清粉以料液的重量体积比为0.8-1:10的蒸馏水进行溶解；所述脱盐乳清粉与硫酸铵的重量比为1:1.7-2。
3.根据权利要求1所述的从脱盐乳清粉中分离β_乳球蛋白的方法，其特征在于步骤I)中所述的离心转速为8000r/min,离心时间为15min。
4.根据权利要求1所述的从脱盐乳清粉中分离β_乳球蛋白的方法，其特征在于步骤3)所述的第一次离子交换层析的具体步骤为: a.装柱:装柱时避免气泡进入柱子内，保证柱面的平整； b.上样:上样前离心首次滤液中的不溶物，上样量为40-50ml，上样后300ml的0.1molPBS 缓冲液； c.洗脱:先用IL浓度为3%的NaCl洗脱液洗脱，再用IL浓度为5%的NaCl洗脱液洗脱，所述NaCl洗脱液用0.1mol的PBS配制； d.洗柱:收集完后用洗柱液洗柱，洗柱液用ImolNaCl和ImolNaOH溶于IL纯水中。
5.根据权利要求1所述的从脱盐乳清粉中分离β_乳球蛋白的方法，其特征在于步骤5)第二次离子交换层析中洗脱液的浓度为3%NaCl洗脱液，所述NaCl洗脱液用0.1mol的PBS配制，洗脱液洗脱体积为2L。
6.根据权利要求1所述的从脱盐乳清粉中分离β_乳球蛋白的方法，其特征在于步骤6)中凝胶层析中NaCl水溶液的浓度为0.5%。
7.根据权利要求1所述的从脱盐乳清粉中分离β_乳球蛋白的方法，其特征在于步骤3)和步骤5)中的洗脱液在进行洗脱前均要过膜处理。
【文档编号】C07K1/16GK103923202SQ201410154517
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月17日 优先权日:2014年4月17日
【发明者】冯郑珂, 杨章昀, 潘家荣, 张永勇 申请人:中国计量学院