多步骤的最终过滤的制作方法
【专利摘要】本文报道了包括两个直接相连的过滤步骤的组合的用于浓缩的多肽溶液的最终过滤的方法，所述方法使用孔径为3.0μm和0.8μm的第一个过滤器和孔径为0.45μm和0.22的第二个过滤器。
【专利说明】多步骤的最终过滤
[0001]本申请为分案申请，原申请的申请号为201080044481.6，申请日为2010年9月29日， 优先权日:为2009年10月I日，发明名称为“多步骤的最终过滤”。
[0002]本文报道了包括两个直接相连的过滤步骤的组合的用于浓缩的多肽溶液的最终过滤的方法，其中第一个过滤步骤包括使用孔径为3.0 μ m的过滤器的预过滤和使用孔径为0.8 μ m过滤器的主过滤，且第二个过滤步骤包括使用孔径为0.45 μ m的过滤器的预过滤和使用孔径为0.22 μ m的过滤器的主过滤。
[0003]发明背景
[0004]浓度超过100g/l的蛋白质溶液在最终过滤步骤期间容易有困难，例如只具有低跨膜通量或所使用的过滤器被在配制或浓缩过程期间形成的聚集物或颗粒聚集阻塞或由于加入的赋形剂导致浓缩的溶液粘度增加。
[0005]粘度高和颗粒或聚集物含量增加结合在一起经常导致所使用的0.22 μ m最终过滤的过滤器的孔被阻塞。因此，或者在过滤步骤期间(即在一批被完全处理之前)必须替换过滤器，或者必须增加过滤器面积。
[0006]还已经观察到孔径为0.45 μ m的过滤器和孔径为0.22 μ m的过滤器的组合没有优势，例如作为Sartobran P0.45/0.22 μ m过滤器提供时如此。可能避开上述问题的增加孔径的过滤器被用作深度过滤器或预-过滤器，但不被用作最终过滤器。
[0007]在DE420444 4中报道了从气流除去水滴的1.2 μ m预过滤器和之后的0.2 μ m无菌过滤的组合。在US4，488，961中报道了包含两个不同孔径的过滤器过滤器单元，其中孔径较小的过滤器是可弯曲的，通过使过滤器的流向变弯曲以降低过滤器单元的阻力。在US5, 643, 566中使用孔径为0.45 μ m的过滤器的预过滤和孔径为0.22 μ m的过滤器的无菌过滤的组合。在EP0204836中报道了两阶段过滤器，该过滤器使用内壁光滑的膜与在其下面的由带有隆起的胀管器的硬质的过滤支撑物支撑的薄的、能弯曲的多孔膜构建而成。在DE3818860中报道了至少两个具有不同的膜材料和不同的过滤器孔径和过滤器孔几何形状的膜滤器单元的组合。
[0008]Aldington等人(J.Chrom.B848 (2007) 64-78)报道了按比例放大的单克隆抗体纯化方法。在CS247484报道了制备针对人淋巴细胞的免疫球蛋白的方法。
[0009]发明概沭
[0010]已经发现两个各自包含预过滤器和主过滤器且各自具有特别选择的孔径的过滤器的组合能用于在最后的封装步骤期间过滤高度浓缩的免疫球蛋白溶液，而在过滤过程期间没有孔阻塞的风险和替换过滤器的需求。
[0011]本文的一个方面报道了制备免疫球蛋白溶液的方法，所述方法包括以下步骤:
[0012]a)提供蛋白质的浓度至少为100g/l的免疫球蛋白溶液，
[0013]b)经第一个和第二个过滤器的组合过滤所述免疫球蛋白溶液，其中第一个过滤器包含孔径为3.0 μ m的预过滤器和孔径为0.8 μ m的主过滤器，且第二个过滤器包含孔径为0.45 μ m的预过滤器和孔径为0.22 μ m的主过滤器，并由此制备免疫球蛋白溶液。
[0014]本文的另一个方面报道了第一个和第二个过滤器的组合的如本文报道的过滤器组合在活性药物成分制备之前进行的免疫球蛋白溶液的最终过滤中的应用，其中第一个过滤器包含孔径为3.0 μ m的预过滤器和孔径为0.8 μ m的主过滤器，且第二个过滤器包含孔径为0.45 μ m的预过滤器和孔径为0.22 μ m的主过滤器。
[0015]本文的另一个方面报道了制备免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:
[0016]a)提供包含编码免疫球蛋白的核酸的细胞，
[0017]b)培养所述细胞，
[0018]c)从细胞或培养基中回收免疫球蛋白，
[0019]d)使用一个或多个色谱法步骤纯化所述免疫球蛋白并提供免疫球蛋白溶液，和
[0020]e)经第一个和第二个过滤器的组合过滤步骤d)的免疫球蛋白溶液，其中第一个过滤器包含孔径为3.0 μ m的预过滤器和孔径为0.8 μ m的主过滤器，且第二个过滤器包含孔径为0.45 μ m的预过滤器和孔径为0.22 μ m的主过滤器，并由此制备免疫球蛋白。
[0021]本文的另一个方面报道了试剂盒，其包含第一个过滤器(包含孔径为3.0 μ m的预过滤器和孔径为0.8 μ m的主过滤器)和第二个过滤器(包含孔径为0.45 μ m的预过滤器和孔径为0.22 μ m的主过滤器)。
[0022]在一个实施方案中，第一个过滤器面积最多是第二个过滤器面积的两倍。在另一个实施方案中，第一个和第二个过滤器具有大致相同的总过滤器面积。在一个实施方案中，免疫球蛋白溶液包含糖和/或氨基酸和/或表面活性剂和/或盐。在另一个实施方案中，免疫球蛋白溶液的浓度为100g/l至300g/l。在又一个实施方案中，免疫球蛋白溶液的体积为3升至100升。在另一个实施方案中，过滤施加的压力是0.1巴至4.0巴。在一个实施方案中，免疫球蛋白溶液的浓度为160g/l或更高，且过滤施加的压力为1.45巴或更高。在另一个实施方案中压力为1.50巴或更高。在另一个实施方案中，免疫球蛋白溶液包含糖和表面活性剂，且免疫球蛋白溶液浓度为125mg/ml或更高，且过滤施加的压力为0.75巴或更低。在另一个实施方案中压力为0.7巴或更低。
[0023]在一个实施方案中，免疫球蛋白是抗-1L13受体α抗体或抗-HER2抗体。在另一个实施方案中，纯化过程使用蛋白A亲合色谱步骤和至少一个选自以下的步骤:阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和疏水作用色谱。
[0024]发明详沭[0025]已经发现两个各自包含预过滤器和主过滤器和各自具有特别选择的孔径的过滤器或过滤器单元的组合可以用于在最后封装步骤期间过滤高度浓缩的和粘稠的以及配制的免疫球蛋白溶液(即包含糖和表面活性剂)。尤其是包含孔径分别为3.0 μ m和0.8 μ m的预过滤器和主过滤器的第一个过滤器和包含孔径分别为0.45 μ m和0.22 μ m的预过滤器和主过滤器的第二个过滤器的组合是非常有利的。就该组合中的单个过滤器单元而言，过滤包含总计例如Ikg的抗-1L-13Ral抗体或6kg的抗-HER2抗体的高度浓缩的溶液已是可能的，而且封装所述的量而仅有较少的材料损失已是可能的。在一个实施方案中过滤器表面积与溶液体积的比率已被确定。
[0026]在一个实施方案中，免疫球蛋白溶液包括免疫球蛋白和赋形剂。在另一个实施方案中，赋形剂包含一种或更多种物质，其选自糖诸如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖，氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸，盐诸如氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾、磷酸钠、磷酸钾和表面活性剂诸如聚山梨醇酯类和聚(氧乙烯-聚氧丙烯)聚合物。
[0027]本文所述的过滤在治疗性抗体的制备中用作最终过滤步骤。该步骤可以在将所需的赋形剂、稳定剂和/或抗-氧化剂加入高度浓缩的抗体溶液之后进行。在一个实施方案中，以kg计的抗体的量与过滤器的总面积的比率为1000g/m2至10，000g/m2。在另一个实施方案中，所述比率为1000g/m2至6000g/m2。在又一个实施方案中，所述比率为4000g/m2至6000g/m2。
[0028]“多肽”由通过肽键连接氨基酸(天然的或合成的)组成。具有少于约20个氨基酸残基的多肽可被称为“肽”，而由两个或更多个多肽组成的分子或包含一个超过100个氨基酸残基的多肽的分子可被称为“蛋白质”。多肽还可以包含非-氨基酸成分，诸如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非-氨基酸成分可通过表达多肽的细胞添加，且可根据细胞类型而不同。在本文中根据其氨基酸骨架结构或编码其的核酸来定义多肽。一般不对添加物例如糖基进行特别说明，但是其可以存在。
[0029]术语“免疫球蛋白”是指由一种或多种基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。已鉴定的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及极多的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以多种形式存在，包括例如，Fv, Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双抗体。
[0030]术语“完整免疫球蛋白”是指包含两条被称为免疫球蛋白轻链多肽(轻链)和两条被称为免疫球蛋白重链多肽(重链)的免疫球蛋白。完整免疫球蛋白的各个免疫球蛋白重链和轻链多肽包含可变域(可变区)(一般为多肽链的氨基末端部分)，其包含能够与抗原相互作用的结合区。完整的免疫球蛋白的各个免疫球蛋白重链和轻链还包含恒定区(通常为羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体结合至i)具有Fe Y受体(FcyR)的细胞，诸如吞噬细胞，或ii)具有新生Fe受体(FcRn)(又称为Brambell受体)的细胞。其还介导抗体与一些因子(包括经典补体系统的因子诸如成分(Clq))结合。免疫球蛋白轻链和重链的可变域包含不同的片段，即4个框架区(FR)和3个高变区(CDR)。
[0031]术语“免疫球蛋白碎片”是指包含至少一个以下结构域的多肽:重链的可变域、重链的C0I域、铰链区、Ch2域、Ch3域、Ch4域、轻链的可变域和/或轻链的Q域。还包含其衍生物和变体。例如，可存在其中一个或多个氨基酸或氨基酸区域缺失的可变域。
[0032]术语“免疫球蛋白缀合物”指包含经肽键与其他多肽缀合的免疫球蛋白重链或轻链的至少一个结构域的多肽。所述其他多肽为非免疫球蛋白肽，例如激素、或生长受体、或抗融合肽、或补体因子等。
[0033]术语“过滤器”是指微孔过滤器或或大孔过滤器。过滤器包括滤过膜，滤过膜自身由聚合材料构成，所述聚合材料例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺类(尼龙，例如Zetapore?、N66Po si dyne?)、聚酯类、醋酸纤维素、再生纤维素、纤维素复合材料、聚砜类、聚醚砜类、聚芳砜类、聚苯砜类(polyphenylsulphones)、聚丙烯腈、聚偏二氟乙烯、非织造的和织造的织物(例如
Tyvek.)、纤维材料，或者由无机材料组成，诸如zeolithe、Si02、A1203、TiO2或羟基磷灰
石。在一个实施方案中，第一个和第二个过滤器的过滤膜由醋酸纤维素制成。
[0034] 对于重组产生的免疫球蛋白的纯化，通常采用不同的柱色谱步骤的组合。一般，通常在蛋白A亲和色谱之后再进行一个或两个分离步骤。该最后的纯化步骤称为“最终精制(polishing step)”，用于去除痕量杂质和污染物如聚集的免疫球蛋白、残留HCP(宿主细胞蛋白质)、DNA(宿主细胞核酸)、病毒或内毒素。对于该最终精制，通常使用流通模式(flow-through mode)下的阴离子交换材料。
[0035]己经充分确立了不同的方法并广泛地用于蛋白质回收和纯化，例如用微生物蛋白质的亲和色谱(例如，蛋白A或蛋白G亲和色谱)、离子交换色谱(例如，阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)、亲硫吸附(例如，用β巯基基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附色谱(aromatic adsorptionchromatography)(例如，用苯基琼脂糖凝胶、亲氮杂芳基树脂(aza-arenophilic resin)或间氨基苯硼酸)、金属螯合亲和色谱(例如，用Ni (II)-和Cu(II)-亲和材料)、尺寸排阻色谱和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vi jayalakshmi, Μ.A., App1.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
[0036]本文所述的第一个方面是制备免疫球蛋白溶液的方法，所述方法包括:
[0037]-提供蛋白质的浓度至少为100g/l的免疫球蛋白溶液，
[0038]-经第一个和第二个过滤器单元的组合过滤所述免疫球蛋白溶液，其中第一个过滤器单元包含孔径分别为3.0 μ m和0.8 μ m的预过滤器和主过滤器，且第二个过滤器单元包含孔径分别为0.45 μ m和0 .22 μ m的预过滤器和主过滤器，其是通过将所述溶液施加至所述过滤器组合并施加压力而进行的，由此制备免疫球蛋白溶液。
[0039]在一个实施方案中，蛋白质浓度为100g/l至300g/l。在另一个实施方案中，蛋白质浓度为100g/l至200g/l。在另一个实施方案中，蛋白质浓度为120g/l至165g/l。在另一个实施方案中，免疫球蛋白溶液的体积为3升至100升。该溶液体积相当于总质量300g至50，OOOg的免疫球蛋白。在一个实施方案中，所述体积为3.1升至80升。蛋白质的浓度为120g/l至165g/l时，该溶液体积相当于总质量370g至13，200g的免疫球蛋白。在一个实施方案中，免疫球蛋白是抗-1L13受体α抗体。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是抗-HER2抗体。
[0040]本文的另一个方面报道了制备免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:
[0041]-培养包含编码免疫球蛋白的核酸的细胞，
[0042]-从细胞或培养基中回收免疫球蛋白，
[0043]-使用一个或多个色谱法步骤纯化所述免疫球蛋白，并提供纯化的免疫球蛋白溶液，和
[0044]-经如本文报道的过滤器的组合(即第一个和第二个过滤器单元的组合)过滤纯化的免疫球蛋白溶液，其中第一个过滤器单元包含孔径为3.Ομπι的预过滤器和孔径为0.8 μ m的主过滤器，且第二个过滤器单元包含孔径为0.45 μ m的预过滤器和孔径为0.22 μ m的主过滤器，其是通过将所述溶液施加至所述过滤器组合并施加压力而进行的。
[0045]在一个实施方案中，所述细胞是原核细胞或真核细胞。在细胞是原核细胞的一个实施方案中，所述细胞选自大肠杆菌(E.coli)细胞或芽孢杆菌属(bacillus)细胞。在细胞是真核细胞的一个实施方案中，所述细胞选自哺乳动物的细胞，在一个特定的实施方案
中所述细胞选自CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、细胞和杂交瘤细胞。在一个实施
方案中，所述细胞是选自CH0-K1和CHO DG44的哺乳动物的细胞。在一个实施方案中，培养是在20°C至40°C的温度进行，且持续时间为4至28天。在一个实施方案中，纯化过程使用蛋白A亲合色谱步骤和至少一个选自以下的步骤:阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和疏水作用色谱。
[0046]已经发现包含孔径分别为3.0 μ m和0.8 μ m的预过滤器和主过滤器的第一个过滤器单元和包含孔径分别为0.45 μ m和0.22 μ m的预过滤器和主过滤器的第二个过滤器单元的组合对处理(过滤)高度浓缩的免疫球蛋白溶液有利，其使得可以过滤完整批次的浓缩的免疫球蛋白溶液而不需要替换过滤器。
[0047]还已经发现在过滤器组合中，有利于的是各过滤器单元以及过滤器组合中所使用的两个过滤器中的每一个具有大致相等的过滤器面积，即在最小过滤器面积的两倍之内。
[0048]还已经发现，视溶液中包括免疫球蛋白在内的各组分而不同的压力和浓度范围有助于有利的方法。
[0049]如果所述溶液是浓度为160g/l或更高浓度(即165g/l或170g/l)的浓缩的免疫球蛋白溶液，没有向其中加入过糖或表面活性剂，则在一个实施方案中在1.45巴或更高的施加的压力下进行该方法的操作，在另一个实施方案中在1.5巴或更高的施加的压力下进行该方法的操作。如果溶液是浓度为125g/l或更高浓度(即130g/l或135g/l)的浓缩的免疫球蛋白溶液，向其中已至少加入了糖和表面活性剂，则在一个实施方案中在0.75巴或更低的施加的压力下进行该方法的操作，在另一个实施方案中在0.7巴或更低的施加的压力下进行该方法的操作。
[0050]本文的另一个方面报道了试剂盒，其包含第一个过滤器单元(包含孔径分别为
3.0 μ m和0.8 μ m的预过滤器和主过滤器)和第二个过滤器单元(包含孔径分别为0.45 μ m和0.22 μ m的预过滤器和主过滤器)。本文的另一个方面报道了包含第一个过滤器单元(包含孔径分别为3.0 μ m和0.8 μ m的预过滤器和主过滤器)和第二个过滤器单元(包含孔径分别为0.45 μ m和0.22 μ m的预过滤器和主过滤器)的过滤器在过滤蛋白质的浓度至少为100g/l的浓缩的免疫球蛋白溶液中的应用。
[0051]提供了以下实施例和附图以助于理解本发明，本发明的真正范围如所附权利要求所述。应理解能够对所述方法进行修改而不脱离本发明的主旨。
[0052]附图
[0053]图1:使用抗体浓度为222mg/ml的抗-HER2抗体溶液和2.0巴的施加的压力获得的渗透流的时程(菱形=包含孔径1.2 μ m的过滤器的组合；正方形=包含孔径3.0 μ m的过滤器的组合)。
[0054]图2:使用补充有约200mM海藻糖和约0.05% (w/v)吐温20的抗体浓度为125mg/ml的抗-HER2抗体溶液和2.0巴的施加的压力获得的渗透流的时程(菱形=包含孔径
1.2 μ m的过滤器的组合；正方形=包含孔径3.0 μ m的过滤器的组合)。
[0055]图3:使用抗体浓度为162mg/ml的抗-HER2抗体溶液和1.8巴的施加的压力获得的渗透流的时程(菱形=包含孔径1.2 μ m的过滤器的组合；正方形=包含孔径3.0 μ m的过滤器的组合)。
[0056]图4:使用补充有约200mM海藻糖和约0.2% (w/v)泊洛沙姆的抗体浓度为141mg/ml的抗-1L13Ra抗体溶液和1.6巴的施加的压力获得的渗透流的时程(菱形=包含孔径
1.2 μ m的过滤器的组合；正方形=包含孔径3.0 μ m的过滤器的组合)。[0057]图5:使用抗体浓度为162mg/ml的抗-HER2抗体溶液和1.1巴的施加的压力获得的渗透流的时程(菱形=包含孔径1.2 μ m的过滤器的组合；正方形=包含孔径3.0 μ m的过滤器的组合)。
[0058]图6:使用补充有海藻糖和泊洛沙姆的抗体浓度为141mg/ml的抗_IL13Ra抗体溶液和0.8巴的施加的压力获得的渗透流的时程(菱形=包含孔径1.2μπι的过滤器的组合；正方形=包含孔径3.0 μ m的过滤器的组合)。
[0059]图7:使用补充有海藻糖和吐温20的抗体浓度为125mg/ml的抗-HER2抗体溶液和0.8巴的施加的压力获得的渗透流的时程(菱形=包含孔径1.2 μ m的过滤器的组合；正方形=包含孔径3.0 μ m的过滤器的组合)。
[0060]图8:使用补充有海藻糖和吐温20的抗体浓度为125mg/ml的抗-HER2抗体溶液和0.3巴的施加的压力获得的渗透流的时程(菱形=包含孔径1.2 μ m的过滤器的组合；正方形=包含孔径3.0 μ m的过滤器的组合)。
[0061]实施例1
[0062]材料和方法
[0063]杭体
[0064]示例性的抗体是针对IL13受体蛋白质的免疫球蛋白(抗_IL13Ra I抗体)，例
如在W02006/072564的SEQ ID N0:01至12中所报道(引入本文作为参考)。
[0065]另一个示例性的免疫球蛋白是在W092/022653、W099/057134、W097/04801、US5, 677，171和US5, 821，337 (引入本文作为参考)中所报道的抗-HER2抗体。
[0066]过滤器
[0067]本文尤其使用了 Sartobran P0.45 μ m+0.2 μ m 滤筒和 SartocleanCA3.0 μ m+0.8 μ m滤筒作为示范。这两种滤筒可得自Sartorius AG, ( Gttitingen,德国)。
[0068]分析方法
[0069]尺寸排阻色谱:
[0070]树脂:TSK3000 (Tosohaas)
[0071]柱:300x7.8mm
[0072]流速:0.5ml/ 分钟
[0073]缓冲液:包含250mM氯化钾的200mM磷酸钾，
[0074]调节至ρΗ7.0
[0075]波长:280nm
[0076]DNA-阈值-系统:参见例如 Merrick, H.,和 Hawlitschek, G., Biotech ForumEurope9(1992)398-403
[0077]蛋白A ELISA:将微量滴定板的孔涂覆源自雏鸡的多克隆抗-蛋白A-1gG。结合后，通过使用样品缓冲液洗涤将没有反应的抗体除去。为结合蛋白A，将确定体积的样品加入所述孔中。样品中存在的蛋白A经雏鸡抗体被结合并留在板的孔中。孵育后除去样品溶液，并将孔洗涤。然后 为检测，加入雏鸡来源的多克隆抗-蛋白A-1gG-生物素缀合物和链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物。经过另一个洗涤步骤后，加入底物溶液加入，形成有色的反应产物。颜色的强度与样品的蛋白A含量成比例。一段确定的时间后停止反应，并测定吸光度。
[0078]宿主细胞蛋白质(HCP)ELISA:将微量滴定板的孔壁涂覆血清白蛋白和链霉抗生物素的混合物。将源自山羊的针对HCP的多克隆抗体结合于微量滴定板的孔壁。经过洗涤步骤后，使用不同浓度的HCP校准系列和样品溶液对微量滴定板的不同的孔进行孵育。孵育后通过使用缓冲溶液洗涤除去未结合样品物质。为进行检测，使用抗体过氧化物酶缀合物对各孔进行孵育，以测定结合的宿主细胞蛋白质。使用ABTS孵育并在405nm检测来检测所固定的过氧化物酶活性。
[0079]实施例2
[0080]使用0.45 μ m和0.22 μ m孔径的单个过滤器来过滤抗-HER2抗体
[0081]在该实施例中显示高度浓缩的免疫球蛋白溶液不能在不阻塞过滤器的孔的情况下使用孔径0.45 μ m(预过滤器)和0.22μπι(主过滤器)的单个无菌过滤器进行过滤，其中负载为每平方米过滤器面积超过2，460g蛋白质。
[0082]在该实施例中使用了孔径为0.45 μ m和0.22 μ m和总过滤器面积为0.2平方米的单个过滤器。
[0083]表1:在单个过滤器过滤中使用的溶液。
[0084]
【权利要求】
1.制备免疫球蛋白溶液的方法，所述方法包括: a)提供浓度至少为100g/l的免疫球蛋白溶液， b)将所述免疫球蛋白溶液施加至第一个和第二个过滤器单元的组合，其中第一个过滤器单元包含孔径为3.0 μ m的预过滤器和孔径为0.8 μ m的主过滤器，且第二个过滤器单元包含孔径为0.45 μ m的预过滤器和孔径为0.22 μ m的主过滤器，压力为0.1至4.0巴，并由此制备免疫球蛋白溶液。
2.制备免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步骤: a)培养包含编码免疫球蛋白的核酸的细胞， b)从细胞或培养基中回收免疫球蛋白， c)使用一个或多个色谱法步骤纯化所述免疫球蛋白，并提供免疫球蛋白溶液， d)向该溶液中任选地加入糖、氨基酸和/或洗涤剂， e)使用选自渗滤或切向流过滤的方法任选地将所述免疫球蛋白溶液浓缩至100g/l或更高的浓度，和 f)将之前步骤的免疫球蛋白溶液施加至第一个和第二个过滤器单元的组合，其中第一个过滤器单元包含孔径为3.0 μ m的预过滤器和孔径为0.8 μ m的主过滤器且第二个过滤器单元包含孔径为0.45 μ m的预过滤器和孔径为0.22 μ m的主过滤器，压力为0.1至4.0巴，并由此制备免疫球蛋白。
3.依据前述权利要求中任意一项的方法，其特征为第一个和第二个过滤器单元中的过滤器具有大致相等的过滤器面积。
4.依据权利要求1或2的方法，其特征为所述免疫球蛋白溶液的浓度为100g/l至300g/l。
5.依据权利要求4的方法，其特征为所述免疫球蛋白溶液的浓度为100g/l至200g/l。
6.依据权利要求4的方法，其特征为所述免疫球蛋白溶液的浓度为120g/l至165g/l。
7.依据权利要求1或2的方法，其特征为所述免疫球蛋白溶液的体积为3升至100升。
8.依据权利要求1或2的方法，其特征为所述免疫球蛋白溶液的体积为3.1升至80升。
9.依据权利要求1或2的方法，其特征为所述免疫球蛋白是抗-1L13受体α抗体或抗-HER2抗体。
10.依据权利要求2的方法，其特征为所述纯化过程使用蛋白A亲合色谱步骤和至少一个选自以下的步骤:阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和疏水作用色谱。
11.依据权利要求1或2的方法，其特征为所述免疫球蛋白溶液的浓度为160g/l或更高，且所述施加至过滤器的组合是通过施加1.45巴或更高的压力进行的。
12.依据权利要求11的方法，其特征为所述压力为1.50巴或更高。
13.依据权利要求1或2的方法，其特征为所述溶液是浓度为160g/l或更高浓度的浓缩的免疫球蛋白溶液，没有向其中加入过糖或表面活性剂，且在1.45巴或更高的施加的压力下进行该方法的操作。
14.依据权利要求1或2的方法，其特征为所述溶液是浓度为125g/l或更高浓度的浓缩的免疫球蛋白溶液，向其中已至少加入了糖和表面活性剂，且在0.75巴或更低的施加的压力下进行该方法的操作。
15.依据权利要求1或2的方法，其特征为所述免疫球蛋白溶液包含糖和表面活性剂，且所述免疫球蛋白溶液的浓度为125mg/ml或更高，且所述施加至过滤器的组合是通过施加0.75巴或更低的压力进行的。
16.依据权利要求15的方法，其特征为所述压力为0.7巴或更低。
17.依据权利要求1或2的方法，其特征为第一个过滤器面积最多是第二个过滤器面积的两倍。
18.依据权利要求1或2的方法，其特征为第一个和第二个过滤器单元具有相同的总过滤器面积。
19.依据权利要求1或2的方法，其特征为免疫球蛋白溶液包括免疫球蛋白和赋形剂。
20.依据权利要求19的方法，其特征为所述赋形剂包含一种或更多种物质，其选自糖诸如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖，氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸，盐诸如氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾、磷酸钠、磷酸钾和表面活性剂诸如聚山梨醇酯类和聚(氧乙烯-聚氧丙烯)聚合物。
21.依据权利要求1或2的方法，其特征为所述免疫球蛋白溶液包含糖和/或氨基酸和/或表面活性剂和/或盐。
22.依据权利要求1或2的方法，其特征为以kg计的抗体的量与过滤器的总面积的比率为 1000g/m2 至 10，000g/m2。
23.依据权利要求22的方法，其特征为所述比率为1000g/m2至6000g/m2。
24.依据权利要求22的方法，其特征为所述比率为4000g/m2至6000g/m2。
25.依据权利要求1或2的方法，其特征为第一个和第二个过滤器的过滤膜由醋酸纤维素制成。
26.依据权利要求2的方法，其特征为所述细胞是原核细胞或真核细胞。
27.依据权利要求26的方法，其特征为所述细胞是原核细胞，所述细胞选自大肠杆菌(E.coli)细胞或芽孢杆菌(bacillus)属细胞。
28.依据权利要求26的方法，其特征为在细胞是真核细胞，所述细胞选自哺乳动物的细胞，在一个特定的实施方案中所述细胞选自CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、PctX:#细胞和杂交瘤细胞。
29.依据权利要求28的方法，其特征为所述细胞是选自CHO-Kl和CHODG44的哺乳动物的细胞。
30.依据权利要求2的方法，其特征为培养是在20°C至40°C的温度进行，且持续时间为.4至28天。
31.试剂盒，其包含孔径为3.Ομπι至0.8μπι的第一个过滤器和孔径为0.45μπι至.0.22 μ m的第二个过滤器。
32.第一个和第二个过滤器的过滤器组合在活性药物成分制备之前进行的免疫球蛋白溶液的最终过滤中的应用，其中第一个过滤器包含孔径为3.0ym的预过滤器和孔径为.0.8 μ m的主过滤器，且第二个过滤器包含孔径为0.45 μ m的预过滤器和孔径为0.22 μ m的主过滤器。
【文档编号】C07K1/34GK103980346SQ201410246761
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2010年9月29日 优先权日:2009年10月1日
【发明者】R·法尔肯施泰因, K·施万德纳 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司