从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的方法。将干燥的聚硒植物碎米荠原料粉碎后，通过加入盐酸提取硒代胱氨酸，加入氢氧化钠提取硒代蛋氨酸，滤液调节pH值到近中性后，采用高压制备柱进行分离，含硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的洗脱液分别用纤维素脂透析袋透去无机盐离子，再通过冷冻干燥得到硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸精品。该技术工艺简单，产品提取率高，生产的产品可作原料药生产注射液或食品添加剂，用途广泛，同时可以带动碎米荠种植产业的发展，使产业链得以延伸。
【专利说明】从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 硒是人体必需的微量元素之一，硒代胱氨酸是人体必需的第二i^一种氨基酸，硒 代蛋氨酸取代蛋氨酸在人体中合成蛋白质，人类40多种疾病与缺硒有关，然而由于硒属于 稀散元素，在地球上得含量很少，致使全球约有72%的地区缺硒，在中国也有9亿多人需要 补硒，每年硒的需求量约为1000吨，其中80 %依赖进口，以前人和动物补硒最主要的方法 是在食品中和饲料中添加亚硒酸钠，或给病人吃富硒酵母片，但亚硒酸钠对人体的危害也 已为人们公认，发达国家早已不允许在饲料中添加亚硒酸钠，我国也规定了从2013年1月 开始不允许再在食盐中添加亚硒酸钠，对硒的需求量又增加了 200吨硒的缺口。
[0003] 碎米荠是十字花科碎米荠属植物，因聚硒能力超强而引起科研工作者和企业的广 泛关注，据报道，该植物含硒量最高可达8000mg/kg，且90 %以上以硒代半胱氨酸形态存 在。经恩施州硒研究院研究发现，碎米荠中不仅含有较高的硒代胱氨酸，也有一定量的硒代 蛋氨酸，是一种利用价值很高的生物硒资源，虽然能够直接食用，但由于还没有通过食品认 证，不能添加到食品中，造成资源巨大的浪费。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒 代蛋氨酸的方法。
[0005] 本发明采用如下技术方案，一种从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨 酸的方法，其特征在于具体步骤如下：
[0006] a.碎米荠原料预处理：将聚硒碎米荠植株晒干、粉碎，过40目筛；
[0007] b.硒代胱氨酸的提取和分离：粉碎的碎米荠用水或0. l_6mol/L的盐酸或 0. l-6mol/L的NaOH溶液，在60°C _120°C下超声提取或震荡60min-180min提取，过滤，将残 渣重复提取2次，合并滤液，将溶液pH值调节到6-8 ;
[0008] c.硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸分离条件的确定：以DL-硒代胱氨酸和DL-硒代蛋 氨酸为对照品，用高效液相色谱-原子荧光联用法HPLC-HG-AFS确定分离条件为阴离子交 换柱或C 18制备色谱柱，流动相为30mM-100mM的磷酸二氢氨水溶液pH值4-10,采用梯度洗 脱，流速0. 1-l.OmL/min，硒代胱氨酸保留时间为2.42±0.25min，硒代蛋氨酸保留时间为 3. 40±0. 34min ;
[0009] d.分离：水解液进样到25_45μπι阴离子交换柱或C18制备色谱柱分离，用 30mM-100mM的磷酸二氢氨水溶液pH值4-10为洗脱液，采用中试高压制备系统，按峰收集硒 代胱氨酸和硒代蛋氨酸对应洗脱液，合并洗脱液；
[0010] e.透析：将洗脱液装入截留分子量100-500的纤维素酯透析袋，放入超纯水中，透 去无机盐离子，透析袋内为硒代胱氨酸或硒代蛋氨酸溶液； toon] f.冷冻干燥：将上步骤所得冷冻干燥，得硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸精品；
[0012] e.产品纯度检测：以DL-硒代胱氨酸和DL-硒代蛋氨酸为对照品，用高效液相色 谱-原子荧光联用法或高效液相-电感耦合等离子质谱法测定。
[0013] 本发明一种从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的方法，其特征在 于步骤a中所述的原料聚硒碎米荠植株为其根、茎、叶。
[0014] 本发明一种从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的方法，其特征在 于步骤f中所述的冷冻干燥为：先将透析得到的硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸溶液在冰箱冷冻 室或冷冻干燥机的冷冻室内-20°c下冷冻成冰状，取出，放在真空干燥箱的干燥架的物料盘 中，盖好有机玻璃罩，打开冷冻干燥箱的真空泵和冷阱，在_56°C、10Pa以下干燥24h以上， 再将透析袋内粉末刮下，得硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸精品。
[0015] 本发明采用化学方法，将天然碎米荠中硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸分离提取出来， 作为生物硒添加到药品、注射液和食品、保健品中，可实现人类科学补硒；通过培植聚硒碎 米荠原料一生产硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸原料药一生产硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸注 射液、食品及保健品添加剂产业链，解决缺硒地区补硒的问题，为人类健康作贡献。
[0016] 本发明的技术方案是：从碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，包括以下步 骤：
[0017] a碎米荠原料预处理：将聚硒碎米荠植株（包括根、茎、叶）晒干、粉碎；
[0018] b硒代胱氨酸的提取和分离：粉碎的碎米荠用水或0. l_6mol/L的盐酸或 0. l-6mol/L的NaOH溶液，60°C _120°C超声提取或震荡60min-240min提取，过滤，将残渣反 复提取2次，合并滤液，将溶液pH值调节到5-9 ;
[0019] c硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸分离条件的确定：以DL-硒代胱氨酸和DL-硒代蛋氨 酸为对照品，用高效液相色谱-原子荧光联用法（HPLC-HG-AFS)确定分离条件为阴离子交 换柱或C 18制备色谱柱，流动相为30mM-100mM的磷酸二氢氨水溶液（pH值4-10)，采用梯度 洗脱，流速0. l_2.0mL/min，硒代胱氨酸保留时间为2.42±0.25min，硒代蛋氨酸保留时间 为 3. 40±0· 34min ;
[0020] d分离：水解液进样到25-45 μ m阴离子交换柱或C18制备色谱柱分离，用 30mM-100mM的磷酸二氢氨水溶液（pH值4-10)为洗脱液，采用中试高压制备系统，按峰收集 硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸对应洗脱液，合并洗脱液；
[0021] e透析：将洗脱液装入截留分子量100-500的纤维素酯透析袋，放入超纯水中，透 去无机盐离子，透析袋内为硒代胱氨酸或硒代蛋氨酸溶液。
[0022] f冷冻干燥，得硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸精品。
[0023] e产品纯度检测：以DL-硒代胱氨酸和DL-硒代蛋氨酸为对照品，用高效液相色 谱-原子荧光联用法或高效液相-电感耦合等离子质谱法测定。
[0024] 本发明的有益效果是：将干燥的聚硒植物碎米荠原料粉碎后，通过加入盐酸提取 硒代胱氨酸，加入氢氧化钠提取硒代蛋氨酸，滤液调节pH值到近中性后，采用高压制备柱 进行分离，含硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的洗脱液分别用纤维素脂透析袋透去无机盐离子， 再通过冷冻干燥得到硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸精品。该技术工艺简单，产品提取率高，生产 的产品可作原料药生产注射液或食品添加剂，用途广泛，同时可以带动碎米荠种植产业的 发展，使产业链得以延伸。
[0025] 本发明的从碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，其技术工艺简单，产品提取 率高。
[0026] 以NaOH为水解液提取碎米荠中硒代氨基酸的效果：分别用浓度为0、0. 1、0. 5mol/ L的NaOH溶液，在常温、60°C、90°C下，进行超声、振荡和微波加热处理，处理时间为60min、 90min，样品处理后用盐酸调节pH值到8?9,用高效液相色谱一原子荧光形态分析联用法 对水解产物中的成分进行测定，以硒代胱氨酸（SeCys2)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亚硒酸跟离 子（Se(IV))、硒甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)和硒酸根离子（Se(VI))5种标准溶液作为对 照，以外标法定量，确定采用NaOH溶液提取碎米荠中硒代氨基酸的效果，结果见表1，其中 t2. 99min为尚未定性的未知成分。
[0027] 表1 NaOH提取碎米荠中硒形态效果（t2. 99min为未知峰面积）
[0028] 单位：mg/kg
[0029]
【权利要求】
1. 一种从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的方法，其特征在于具体步 骤如下： a. 碎米荠原料预处理：将聚硒碎米荠植株晒干、粉碎，过40目筛； b. 硒代胱氨酸的提取和分离：粉碎的碎米荠用水或0. l_6mol/L的盐酸或0. l-6mol/L 的NaOH溶液，在60°C _120°C下超声提取或震荡60min-180min提取，过滤，将残渣重复提取 2次，合并滤液，将溶液pH值调节到6-8 ; c. 硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸分离条件的确定：以DL-硒代胱氨酸和DL-硒代蛋氨酸 为对照品，用高效液相色谱-原子荧光联用法HPLC-HG-AFS确定分离条件为阴离子交换 柱或C 18制备色谱柱，流动相为30mM-100mM的磷酸二氢氨水溶液pH值4-10,采用梯度洗 脱，流速0. 1-l.OmL/min，硒代胱氨酸保留时间为2.42±0.25min，硒代蛋氨酸保留时间为 3. 40±0. 34min ; d. 分离：水解液进样到25-45 μ m阴离子交换柱或C18制备色谱柱分离，用30mM-100mM 的磷酸二氢氨水溶液pH值4-10为洗脱液，采用中试高压制备系统，按峰收集硒代胱氨酸和 硒代蛋氨酸对应洗脱液，合并洗脱液； e. 透析：将洗脱液装入截留分子量100-500的纤维素酯透析袋，放入超纯水中，透去无 机盐离子，透析袋内为硒代胱氨酸或硒代蛋氨酸溶液； f. 冷冻干燥：将上步骤所得冷冻干燥，得硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸精品； e.产品纯度检测：以DL-硒代胱氨酸和DL-硒代蛋氨酸为对照品，用高效液相色谱-原 子荧光联用法或高效液相-电感耦合等离子质谱法测定。
2. 按照权利要求1所述的一种从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的 方法，其特征在于步骤a中所述的原料聚硒碎米荠植株为其根、茎、叶。
3. 按照权利要求1所述的一种从聚硒植物碎米荠中提取硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的 方法，其特征在于步骤f中所述的冷冻干燥为：先将透析得到的硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸 溶液在冰箱冷冻室或冷冻干燥机的冷冻室内-20°C下冷冻成冰状，取出，放在真空干燥箱的 干燥架的物料盘中，盖好有机玻璃罩，打开冷冻干燥箱的真空泵和冷阱，在-56°C、10Pa以 下干燥24h以上，再将透析袋内粉末刮下，得硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸精品。
【文档编号】C07C391/00GK104086471SQ201410361185
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】陈永波, 胡百顺, 李红英, 黄光昱, 石月明 申请人:恩施土家族苗族自治州农业科学院