经修饰fgf-21多肽和其用途
【专利摘要】本发明提供经修饰FGF-21多肽和其用途以及产生方法，所述经修饰人类FGF-21多肽包含SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6或SEQ?ID?NO：7的多肽序列，且在SEQ?ID?NO：1的108位置处或SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6或SEQ?ID?NO：7的相应位置处以一个非天然编码氨基酸进行取代。
【专利说明】经修饰FGF-21多肽和其用途
[0001]分案说明
[0002]本申请案是申请日为2008年3月19日，申请号为200880009653.9 (国际申请号为PCT/US2008/057563)，发明名称为经修饰FGF-21多肽和其用途的专利申请的分案申请。
[0003]相关申请案的交叉参考
[0004]本申请案主张2007年3月30日申请的美国临时专利申请案第60/921，297号和2007年11月14日申请的美国临时专利申请案第60/988，060号的优先权和权利，所述申请案的说明书和揭示内容以全文并入本文中。
【技术领域】
[0005]本发明涉及视情况经至少一个非天然编码氨基酸修饰的FGF-21多肽。
【背景技术】
[0006]成纤维细胞生长因子是广泛表达于发育和成熟组织中的大的多肽(Baird等人，Cancer Cells, 3:239-243, 1991)，并且在包括血管生成、有丝分裂发生、模式形成、细胞分化、代谢调节和组织损伤修复的多种生理学功能中起关键作用(McKeehan等人,Prog.Nucleic Acid Res.Mol.B1l.59:135-176, 1998 ；Burgess, ff.H.等人,Annu.Rev.B1chem.58:575-606 (1989))。原型成纤维细胞生长因子(FGF) FGF-1 和 FGF-2 最初是从作为成纤维细胞有丝分裂原的大脑和垂体中分离。FGF-3经鉴别为由小鼠乳腺肿瘤病毒活化的常用标靶(Dickson 等人，Ann.N.Y.Acad.Sc1.638:18-26 (1991)) ;FGF_4到 FGF-6 经鉴别为致癌基因产物(Yoshida 等人，Ann.NY Acad.Sc1.638:27—37 (1991)；Goldfarb 等人，Ann.NY Acad.Sci 638:38-52(1991) ；Coulier 等人，Ann.NY Acad.Sc1.638:53-61 (1991))。FGF-10是通过基于同源性的聚合酶链反应(PCR)从大鼠肺中鉴别(Yamasaki 等人，J.B1l.Chem.271:15918-15921 (1996))。FGF-1l 到 FGF-14(FGF 同源因子(FHF)I到4)是通过随机cDNA测序、数据库搜索和基于同源性的PCR的组合从人类视网膜中鉴别(Smallwood 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 93:9850-9857 (1996))。FGF-15经鉴别为嵌合体同源结构域癌蛋白的下游标祀(Mcffhirter等人，Developmentl24:3221-3232(1997)) ο FGF-16、FGF-17和FGF-18分别是通过基于同源性的PCR从大鼠心脏和胚胎中鉴别(Miyake 等人,B1chem.B1phys.Res.Commun.243:148-152 (1998)；Hoshikawa 等人,B1chem.B1phys.Res.Commun.244:187-191 (1998) ；0hbayashi 等人,J.B1l.Chem.273:18161-18164(1998))。FGF-19是通过数据库搜索从人类胎儿大脑中鉴别(Nishimura 等人,B1chim.B1phys.Actal444:148-151 (1999))。其具有氨基酸一致性为约30%到60%的约120个保守氨基酸残基的核。
[0007]天然存在突变的动物模型、过度表达和分析使成纤维细胞生长因子和其受体牵涉于多种疾病中(例如 Wilkie 等人，Current B1logy, (1995) 5:500-507 ；Pugh-Humphreys等人,The Cytokine Handbook, A.Thomson 编，第 2 版,Academic Press, HarcourtBrace&c0.出版社，London,第525-566页)，表明活性调节可用于治疗。举例来说，化合物苏拉明(Suramin)对成纤维细胞生长因子_2的抑制作用会预防小鼠的新血管形成和肿瘤生长(Pesenti 等人，British Journal of Cancer, 66:367-372)。成纤维细胞生长因子在血管生成(Lyons, Μ.K.,等人，Brain Res.(1991) 558:315-320)、伤口愈合(Uhl, E.,等人，Br.J.Surg.(1993)80:977-980, 1993)、星形胶质细胞增生(astrogl1sis)、胶质细胞增生和分化(Biagini, G.等人，Neurochem.1nt.(1994) 25:17-24)、脑血管舒张(Tanaka, R.等人，Stroke (1995) 26:2154-2159)和神经营养/神经调节过程中也起作用。
[0008]成纤维细胞生长因子也具有多种积极作用，包括改善血流和防止钙毒性以改善脑缺血的后果(Mattson, Μ.P.等人，Semin.Neurosc1.(1993) 5:295-307 ；Doetroc j.ff.D.等人，J.Neurotrauma(1996) 13:309-316)。基础FGF治疗促进缺血心肌中的新血管生成(Schumacher 等人,Circulat1n (1998) 97:645-650)。基础 FGF 增强功能恢复，并促进局灶性脑梗塞后的神经元萌生(Kawamata等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.(1997) 94 (15):8179-84)。根据公开文献，FGF家族由至少22个成员组成(Reuss等人，CellTissue Res.313:139-157(2003))。
[0009]已报导成纤维细胞生长因子21(FGF_21)优先表达于肝脏中(Nishimura等人，B1chimica et B1physica Acta, 1492:203-206 (2000) ；W0 01/36640 ；和 WO01/18172，其以引用的方式并入本文中)，并且将其描述为缺血性血管疾病、伤口愈合和与肺、支气管或肺泡细胞或功能损失相关的疾病以及众多其它病症的治疗方法。FGF-21主要表达于肝脏、肾脏和肌肉组织中(参看美国专利公开案第20040259780号的实例2，所述专利以全文引用的方式并入本文中)。FGF-21基因由3个外显子构成并且位于染色体19上。与其它FGF不同，FGF-21不具有增殖和致瘤作用(Genome B1l.2001 ;2 (3):REVIEWS3005)。
[0010]美国专利公开案第20010012628号(其以全文引用的方式并入本文中)描述人类FGF-21的核苷酸和蛋白质序列(分别参看美国专利公开案第20010012628号的SEQ IDNO:1和SEQ ID NO: 2)。上述公开案中的SEQ ID NO: 2 (称作sbgFGF_19)为209个氨基酸长，并且在N末端含有28个氨基酸的前导序列。本文中呈现为SEQ ID NO: 3的人类FGF-21序列是与美国专利公开案第20010012628号的SEQ ID N0:2相同的序列。这个序列具有关于位置174的脯氨酸(P)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),下文中称作“FGF-21的209个氨基酸P形式”。
[0011]美国专利第6，716，626号(其以全文引用的方式并入本文中)论述人类FGF-21和其它哺乳动物(尤其小鼠和大鼠)中的同源蛋白。以美国专利第6，716，626号的SEQ IDNO:1表示的小鼠FGF高度表达于肝脏中并且表达于睾丸和胸腺中，并且表明人类FGF-21可能在肝病和/或睾丸功能或源自胸腺的细胞的功能的病症发展和恢复中起作用。美国专利第6，716，626号的SEQ ID NO: 4为209个氨基酸长，并且在N末端含有28个氨基酸的前导序列。本文中呈现为SEQ ID NO: 6的人类FGF-21序列是与美国专利第6，716，626号的SEQID N0:4相同的序列。这个序列具有关于位置174的亮氨酸(L)的单核苷酸多态性(SNP)，下文中称作“FGF-21的209个氨基酸L形式”。
[0012]美国专利公开案第20040259780号(其以全文引用的方式并入本文中)论述人类FGF-21，并且呈现208个氨基酸长(美国专利公开案第20040259780号的SEQ ID NO: 2)并且在N末端含有27个氨基酸的前导序列的序列。本文中呈现为SEQ ID NO: 7的人类FGF-21序列是与美国专利公开案第20040259780号的SEQ ID N0:2相同的序列。这个序列具有关于位置173的亮氨酸(L)的单核苷酸多态性(SNP)，下文中称作“FGF-21的208个氨基酸L形式”。
[0013]已显示FGF-21在胰岛素存在和不存在下刺激小鼠3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取，并且以剂量依赖性方式降低ob/ob和db/db小鼠以及8周龄ZDF大鼠的餐后和空腹血糖、甘油三酯和胰高血糖素水平，因此，为使用FGF-21作为治疗糖尿病和肥胖症的疗法提供了基础(以引用的方式并入本文中的WO 03/011213，和Kharitonenkov等人，J ClinInvest.2005 年 6 月；115 (6): 1627-35)。Kharitonenkov 等人，T Clin Invest.2005 年 6月；115(6):1627-35也显示表达人类FGF-21的转基因小鼠血糖过低，对胰岛素敏感并抵抗饮食诱发的肥胖症。Kharitonenkov等人，Endocrinology (待出版)也显示FGF-21降低糖尿病称猴(Rhesus monkey)的葡萄糖、甘油三酯、胰岛素和胰高血糖素。
[0014]另外，已显示FGF-21可有效降低危重患者的死亡率和发病率(W0 03/059270，其以引用的方式并入本文中)。美国专利申请案20050176631(其以引用的方式并入本文中)中已描述FGF-21，其影响总体代谢状况，并且可对抗在身体对败血症以及由非感染性病理原因引起的全身炎症反应综合症(SIRS)的应激反应期间可能出现的消极副作用。因此，可使用FGF-21来降低危重患者中出现的死亡率和发病率。危重患者包括需要连续、协同的医师、看护和呼吸护理的生理不稳定患者。这类护理尤其需要详加注意以提供持续监控和疗法滴定。危重患者包括处于生理代偿失调风险中的患者，并因此需要持续监控以使得加强护理团队可提供立即干预以防止不利情况发生。危重患者特别需要须由可提供连续滴定护理的团队提供的监控和生命支持。
[0015]聚乙二醇化FGF-21多肽描述于以引用的方式并入本文中的WO 2005/091944中。WO 2005/091944中描述的 FGF-21多肽是181个氨基酸的多肽。以WO 2005/091944的SEQID NO:1表示的成熟、野生型或天然人类FGF-21序列缺乏前导序列。这个人类FGF-21与小鼠FGF-21 (约79%氨基酸一致性)和大鼠FGF-21 (约80%氨基酸一致性)高度一致。本文中呈现为SEQ ID N0:5的人类FGF-21序列是与WO 05/091944的SEQ ID N0:1相同的序列。这个序列具有关于位置146的亮氨酸(L)的单核苷酸多态性(SNP)。所属领域的技术人员可容易地使用替代性哺乳动物FGF-21多肽序列或类似物、突变蛋白或与人类FGF-21序列具有足够同源性的衍生物来达成本文所述的用途。
[0016]本文中呈现为SEQ ID NO:1的人类FGF-21序列具有关于位置146的脯氨酸⑵的单核苷酸多态性(SNP)。SEQ ID NO:1的N末端His标签型式在本文中展示为SEQ ID N0:2。
[0017]WO 2005/091944描述一个或一个以上PEG分子与FGF-21化合物的特定残基的共价连接。与天然FGF-21相比，所得化合物是消除半衰期延长并且清除率降低的具有生物活性的聚乙二醇化FGF-21化合物。PEG分子是与半胱氨酸或赖氨酸残基共价连接。在半胱氨酸的多个位置处进行取代以允许连接至少一个PEG分子。描述一个或一个以上赖氨酸残基(56、59、69和122)处的聚乙二醇化。
[0018]聚乙二醇化FGF-21化合物可适用于治疗具有包括(但不限于)以下病症的个体:2型糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症和代谢综合症。服用可通过达成较长循环半衰期而增大功效并且将需要较少剂量的聚乙二醇化FGF-21化合物将为尤其有利的，其增加需要此疗法的个体的方便性与个体顺应给药要求的可能性。代谢综合症可定义为以下征候中至少三种的群集:腹部肥胖，在大多数男性中，腰围为40英寸或更大；高血糖，空腹后为至少110毫克/分升(mg/dL);高甘油三酯，血流中为至少150mg/dL ;低HDL，小于40mg/dL ；以及血压为130/85或更高。
[0019]与亲水性聚合物聚乙二醇(缩写为PEG)共价连接是对许多生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水性分子)增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长循环时间的方法。PEG已广泛用于药物、人工植入物，以及生物相容性、无毒性和无免疫原性具有重要性的其它应用中。为最大化PEG的所需性质，连接到生物活性分子上的一种或一种以上PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(例如增加的水溶性和循环半衰期)，而不会不利地影响母体分子的生物活性。
[0020]PEG衍生物通常通过例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端以及碳水化合物部分等反应性化学官能团与生物活性分子连接。已存在关于形成治疗性FGF-21化合物的研究，但因多种原因而存在问题，其中一个原因是因为蛋白质和其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。通常，最适于通过聚合物连接来修饰的位点在受体结合中起重要作用，并且对于分子的生物活性保持来说是必需的。因此，聚合物链与生物活性分子上的这些反应性位点的杂乱连接通常导致聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.Clark等人，(1996).T.B1l.Chem., 271:21969-21977。为形成具有足够聚合物分子量以赋予标靶分子以所需优点的接合物，先前技术方法通常涉及多个聚合物臂与分子的随机连接，从而增大母体分子的生物活性降低或甚至完全丧失的风险。
[0021]形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应性位点由蛋白质的结构指示。蛋白质(包括酶)由多个α氨基酸序列构成，所述序列具有一般结构H2N-CHR-C00H。一个氨基酸的α氨基部分(H2N-)与相邻氨基酸的羧基部分(-C00H)连接形成酰胺键联，其可表示为-(NH-CHR-CO)n-, 其中下标“η”可等于数百或数千。由R表示的片段可含有关于蛋白质生物活性和用于连接PEG衍生物的反应性位点。
[0022]举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位存在-NH2部分。ε-NH2在碱性pH值条件下不反应。用PEG进行蛋白质衍生领域中的许多技术是针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε-NH2部分的PEG衍生物。"PolyethyleneGlycol and Derivatives for Advanced PEGylat1n^j Nektar Molecular EngineeringCatalog, 2003,第1_17页。然而，这些PEG衍生物都具有常见限制:其不能在蛋白质表面上存在的通常众多赖氨酸残基之间进行选择性安装。在赖氨酸残基对于蛋白质活性较为重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下或在赖氨酸残基在介导蛋白质与其它生物分子的相互作用中起作用(如在受体结合位点的情况下)的情况下，这可能是一个重要限制。
[0023]蛋白质聚乙二醇化的现有方法的又一个同样重要的复杂情况在于PEG衍生物可能经历与除所需残基以外的残基发生的不需要的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分(其结构表示为-N(H)-)，但许多与ε-NH2反应的化学反应性物质也可与-N(H)-反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链带有自由巯基，其结构表示为-SH。在一些情况下，针对赖氨酸的ε_ΝΗ2基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可以产生PEG衍生的生物活性分子的复杂的异质混合物，并且存在破坏所靶向生物活性分子的活性的风险。将需要开发出允许在蛋白质内的单一位点处引入化学官能团的PEG衍生物，其随后将使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质表面上确定以及可预测的特定位点处的生物活性分子选择性偶合。
[0024]除赖氨酸残基之外，所属领域中也已作出相当大的努力来开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活化PEG试剂。例如，参看以引用的方式并入本文中的美国专利第6，610，281 号，以及〃Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylat1n^, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003,第 1-17 页。可使用定点诱变和所属领域中已知的其它技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且所得自由巯基部分可与带有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方法的复杂之处在于引入自由巯基可能使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，将需要获得一种将化学官能团引入FGF-21中的方法，其使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质选择性偶合，同时可与巯基和蛋白质中通常可见的其它化学官能团相容(即，不会发生不需要的副反应)。
[0025]从所属领域中的取样来看，在已开发的用于连接蛋白质侧链(具体来说，赖氨酸氨基酸侧链上的-NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分)的这些衍生物中，已证实许多衍生物的合成和使用存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键联，其经历水解并因此分解、降解或以其它方式在水性环境中(例如在血流中)不稳定。一些衍生物形成较稳定的键联，但在形成所述键联之前经历水解，这表示PEG衍生物上的反应性基团可能在可连接蛋白质之前已失活。一些衍生物稍有毒性并且因此不太适于活体内使用。一些衍生物因反应过慢而不能实际使用。一些衍生物因与负责蛋白质活性的位点连接而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物在其将连接的位点中不具特异性，这也可能导致所需活性丧失并缺乏结果的再现性。为克服与用聚乙二醇部分修饰蛋白质相关的挑战，已开发出更稳定(例如，美国专利6，602，498，其以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6，610，281，其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。所属领域中无疑需要在要求选择性反应形成稳定化学键之前在生理环境中呈化学惰性的PEG衍生物。
[0026]近年来，已报导蛋白质科学中的全新技术，其有希望克服众多与蛋白质的位点特异性修饰相关的限制。具体来说，已将新的组分添加到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli ；E.coli)(例如，L.Wang 等人,(2001), Science292:498-500)以及真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae ；S.cerevisiae)(例如，J.Chin 等A,Science301:964-7 (2003))的蛋白质生物合成机制中，其使得能够在活体内将非遗传编码氨基酸并入蛋白质中。使用此方法，已回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物性质的许多新颖氨基酸(包括光亲和性标记和可光致异构化氨基酸、光交联氨基酸(例如参看 Chin, J.ff.等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.99:11020-11024 ;和 Chin, J.W.等人，(2002) T.Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮某氡某酸、含重原子氡某酸和糖某化氨基酸)有效且高保真地并入大肠杆菌以及酵母中的蛋白质中。例如，参看J.W.Chin等人,(2002), Tournal of the American Chemical Society 124:9026-9027 ；J.ff.Chin和 P.G.Schultz, (2002).ChemB1Chem3(ll):1135-1137: T.ff.Chin 等人，(2002).PNASUnited States of America99:11020-11024 ；以及 L.Wang 和 P.G.Schultz, (2002), Chem.Comm.,1:1-11。所有参考文献都是以全文引用的方式并入本文中。这些研究已证实有可能选择性地并且常规地引入蛋白质中不存在的化学官能团(例如酮基、炔基和叠氮部分)，所述官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的所有官能团都呈化学惰性并且可用于有效并选择性地反应形成稳定共价键联。
[0027]在蛋白质中并入非遗传编码氨基酸的能力允许引入可能提供天然存在的官能团(例如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的官能团呈惰性，但完全并有效地反应形成稳定键联。举例来说，所属领域中已知叠氮基和乙炔基在催化量的铜存在下在水性条件下经历休斯根(Huisgen) [3+2]环加成反应。例如，参看Tornoe等人，(2002) Τ.0rg.Chem.67:3057-3064 ；和 Rostovtsev 等人，(2002) Angew.Chem.1nt.Ed.41:2596-25990举例来说，通过在蛋白质结构中引入叠氮部分，能够并入对蛋白质中存在的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性，但也与乙炔部分平稳并有效地反应形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮化物在其它蛋白质侧链存在下在生理条件下仍保持化学惰性并且不反应。
[0028]本发明尤其涉及与FGF-21多肽的活性和制备相关的问题，并且也涉及具有改良的生物或药理学性质(例如改良的治疗半衰期)的FGF-21多肽的制备。
【发明内容】
[0029]本发明提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的FGF-21多肽。
[0030]在一些实施例中，FGF-21多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，FGF-21多肽是与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，FGF-21多肽是与双官能聚合物、 双官能连接子或至少一个其它FGF-21多肽连接。
[0031]在一些实施例中，非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是利用连接子与水溶性聚合物连接或与水溶性聚合物键结。在一些实施例中，聚乙二醇分子是双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物是与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽是FGF-21多肽。
[0032]在一些实施例中，FGF-21多肽包含至少两个与包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。
[0033]在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中:位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、
111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、
130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 2_7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入SEQ ID N0:34-36中从位置1(8卩，在N末端)之前到C末端的一个或一个以上位置中。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中:10、52、117、126、131、162、87、77、83、72、69、79、91、96、108和110 (SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中:10、52、77、117、126、131、162(SEQ ID NO:1 或在 SEQ ID NO:2-7 中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中:87、77、83、72(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 2_7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中:69、79、91、96、108 和 110(SEQ ID NO:1 或在 SEQ ID NO: 2-7 中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸并入SEQ ID NO:3、4、6、7或其它FGF-21序列的前导序列或信号序列中。在一些实施例中，前导序列可能选自SEQ ID N0:39、40、41、42、43或44。在一些实施例中，将FGF-21分泌构筑体克隆到具有选自SEQ ID NO: 39、40、41、42、43、44的前导序列的pVK7ara (Nde/Eco)中。
[0034]在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置:位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111 、112、113、114、115、116，117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2_7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将SEQ ID N0:34-36中从位置I (B卩，在N末端)之前到C末端的一个或一个以上位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置:10、52、117、126、131、162、87、77、83、72、69、79、91、96、108 和 110(SEQ ID NO:1 或在 SEQ ID N0:2_7 中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置:10、52、77、117、126、131、162(SEQ ID N0:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接:87、77、83、72(SEQ ID N0:1或在SEQ ID N0:2_7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接:69、79、91、96、108和110(SEQ ID N0:1或在SEQ ID N0:2_7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将SEQ ID N0:3、4、6、7、39、40、41、42、43、44的前导序列或信号序列或者其它FGF-21序列中的一个或一个以上非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，将SEQ ID N0:3、4、6、7的前导序列或信号序列或者其它FGF-21序列中的一个或一个以上非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接。
[0035]在一些实施例中，FGF-21多肽包含调节FGF-21多肽对FGF-21多肽受体或结合搭配物(包括(但不限于)蛋白质、多肽、小分子或核酸)的亲和性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的稳定性相比增加FGF-21多肽的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的免疫原性相比调节FGF-21多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的血清半衰期或循环时间相比调节FGF-21多肽的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
[0036]在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的水溶性相比增加FGF-21多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的溶解性相比增加宿主细胞中产生的FGF-21多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的表达或合成相比增加FGF-21多肽在宿主细胞中的表达或增加活体外合成的取代、添加或缺失。包含这种取代的FGF-21多肽保持激动剂活性并且保持或提高在宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的蛋白酶抗性相比增加FGF-21多肽的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。美国专利第6，716，626号指出可经取代以改变蛋白酶裂解的潜在位点包括(但不限于)脯氨酸的2个残基内的单碱位点。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与在与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21多肽相互作用后受体的活性相比调节FGF-21受体的信号转导活性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21多肽的结合相比调节其与另一分子(例如受体)的结合的取代、添加或缺失。
[0037]在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的相容性相比增加FGF-21多肽与医药防腐剂(例如，间甲酚、苯酚、苄醇)的相容性的取代、添加或缺失。这一增加的相容性将使得能够制备在存储期间保持蛋白质的生理化学性质和生物活性的防腐医药调配物。以全文引用的方式并入本文中的WO 2005/091944论述具有增强的医药稳定性的FGF-21突变蛋白的以下实例:用带电和/或极性但不带电的氨基酸取代一个以下氨基酸:WO 05/091944的SEQ ID NO:1的甘氨酸42、谷氨酰胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、赖氨酸122、组氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸
131、亮氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、异亮氨酸152、丙氨酸154、谷氨酰胺156、甘氨酸161、丝氨酸163、甘氨酸170或丝氨酸172。本发明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相应位置处的一个或一个以上所述取代，且/或可包括一个或一个以上其它取代、添加或缺失。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处进行取代:甘氨酸42、谷氨酰胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、赖氨酸122、组氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、亮氨酸139、丙氨酸145、脯氨酸/亮氨酸146、异亮氨酸152、丙氨酸154、谷氨酰胺156、甘氨酸161、丝氨酸163、甘氨酸170、丝氨酸172 (SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 2_7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处进行取代:谷氨酸91、精氨酸131、谷氨酰胺108、精氨酸77、精氨酸72、组氨酸87、亮氨酸86、精氨酸126、谷氨酸110、酪氨酸83、脯氨酸146、精氨酸135、精氨酸96、精氨酸36(SEQ ID N0:1或在SEQ ID N0:2_7中的相应氨基酸)。
[0038] WO 05/091944描述具有增强的医药稳定性的其它FGF-21突变蛋白。这些突变蛋白包括用半胱氨酸取代FGF-21中两个或两个以上的以下氨基酸(参看WO 05/091944的SEQ ID NO:1):精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、苏氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷氨酰胺27、谷氨酰胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、异亮氨酸35、亮氨酸37、缬氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、谷氨酸50、谷氨酰胺54、亮氨酸58、缬氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、赖氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷氨酰胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、丝氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、丝氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、丝氨酸109、谷氨酸110、脯氨酸115、组氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬酰胺121、赖氨酸122、丝氨酸123、脯氨酸124、组氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139。本发明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相应位置处的一个或一个以上所述取代，且/或可包括一个或一个以上其它取代、添加或缺失。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处进行取代:精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、苏氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸
25、丙氨酸26、谷氨酰胺27、谷氨酰胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、异亮氨酸35、亮氨酸37、缬氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、谷氨酸50、谷氨酰胺54、亮氨酸58、缬氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、赖氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷氨酰胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、丝氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、丝氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、丝氨酸109、谷氨酸110、脯氨酸115、组氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬酰胺121、赖氨酸122、丝氨酸123、脯氨酸124、组氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139 (SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 2-7中的相应氨基酸)。
[0039]WO 05/091944进一步描述除在Cys75_Cys93处天然存在的二硫键之外还具有工程改造过的二硫键的特定FGF-21突变蛋白(经半胱氨酸取代的氨基酸)，如下:Gln76Cys-Serl09Cys, Cys75_Ser85Cys、 Cys75_Ala92Cys、 Phe73Cys_Cys93、Serl23Cys-Hisl25Cys、AspI 02Cys-TyrI 04Cys、AspI 27Cys-GIyI 32Cys、Ser94Cys_GlullOCys、 Proll5Cys_Hisll7Cys、 Asnl21Cys_Aspl27Cys、Leu100Cys_Aspl02Cys、Phe95Cys_Tyrl07Cys、Argl9CysProl38Cys、Tyr20Cys_Leul39Cys、Tyr22Cys_Leul37Cys、Arg77Cys_Asp79Cys、Pro90Cys_Ala92Cys、Glu50Cys_Lys69Cys、Thr23Cys-Asp25Cys、Ala31Cys_Gly43Cys、Gln28Cys_Gly43Cys、Thr23Cys_Gln28Cys、Val41Cys-Leu82Cys、 Leu58Cys_Val62Cys、 Gln54Cys_Leu66Cys、 Ile35Cys_Gly67Cys、Gly67Cys_Arg72Cys、Ile35Cys_Gly84Cys、Arg72Cys-Gly84Cys 或 Arg77Cys_Ala81Cys，其中编号是根据WO 05/091944的SEQ ID N0:1。其它具有工程改造过的二硫键的突变蛋白为 Tyr22Cys_Leul39Cys ；Asp24Cys-Argl35Cys ；Leull8Cys-Glyl32Cys ；Hisll7Cys-Prol30Cys ； HisI I 7Cys-AI a I 29Cys ； Leu82Cys-Pro 11 9Cys ；Gly80Cys-Alal29Cys ；Gly43Cys-Prol24Cys ；Gly42Cys-Argl26Cys ；Gly42Cys-Prol24Cys ；Gln28Cys-Prol24Cys ； GI n27Cys-SerI 23Cys ； AIa26Cys-LysI 22Cys ；或Asp25Cys-Lysl22Cys，其中编号是根据 WO 05/091944 的 SEQ ID NO:1。其它具有工程改造过的二硫键的突变蛋白为Leull8Cys_Alal34Cys ；Leu21Cys-Leu33Cys ；Ala26Cys-Lysl22Cys ；Leu21Cys-Leu33Cys/Leull8Cys-Alal34Cys,其中编号是根据 WO05/091944的SEQ ID NO:1。本发明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相应位置处的一个或一个以上所述取代，且/或可包括一个或一个以上其它取代、添加或缺失。本发明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相应位置处的一个或一个以上所述取代(SEQ ID ΝΟ:1或在SEQID NO: 2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽可包括在SEQ IDNO: 34-36中从位置I ( 即，在N末端)之前到C末端的相应位置处的一个或一个以上所述取代。
[0040]WO 05/091944描述聚乙二醇化的其它FGF-21突变蛋白。这些突变蛋白具有一种以下取代:D25C、D38C、L58C、K59C、P60C、K69C、D79C、H87C、E91C、E101C、D102C、L114C、L116C、K122C、R126C、P130C、P133C、P140C。本发明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相应位置处的一个或一个以上所述取代，且/或可包括一个或一个以上其它取代、添加或缺失。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处进行取代:25、38、58、59、60、69、79、87、91、101、102、114、116、122、126、130、133、140(SEQ IDN0:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽可包括在SEQ ID NO: 34-36中从位置I (B卩，在N末端)之前到C末端的相应位置处的一个或一个以上所述取代。
[0041]WO 05/091944描述在以下位置处的半胱氨酸取代:19、21、26、28、29、30、36、39、42、50、56、61、64、65、68、70、71、77、81、85、86、90、92、94、98、107、108、112、113、123 和 124。WO 05/091944说明在以下位置处的半胱氨酸取代:24、27、37、40、44、46、49、57、88、89、106、110、111、115、120和139? WO 05/091944也描述在以下位置处的半胱氨酸取代:18、45、47、48、78、83、99、103、125、128、131、132 和 138。WO 05/091944 也描述在以下位置处的半胱氨酸取代:25、38、58、59、60、69、79、87、91、101、102、114、116、122、126、130、133 和 140。
[0042]在一些实施例中，一个或一个以上工程改造过的键是由一个或一个以上非天然氨基酸产生。分子内的键可以多种方式产生，包括(但不限于)蛋白质中两个氨基酸(一个或两个氨基酸可能为非天然氨基酸)在合适条件下的反应；两个氨基酸(其各自可能为天然编码或非天然编码)与连接子、聚合物或其它分子在合适条件下的反应等。
[0043]在一些实施例中，FGF-21多肽中的一个或一个以上氨基酸可经一个或一个以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些实施例中，FGF-21多肽中的氨基酸可经天然存在或非天然存在氨基酸取代，条件是至少一个经非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，FGF-21多肽中的一个或一个以上氨基酸可经一个或一个以上天然存在氨基酸取代，并且另外至少一个经非天然编码氨基酸取代。
[0044]在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基服基、置氣基或炔基。
[0045]在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构:
[0046]
【权利要求】
1.一种经修饰人类 FGF-21 多肽，其包含 SEQ ID NO: USEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6 或 SEQ ID NO:7 的多肽序列，且在 SEQ ID NO:1 的 108位置处或 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 或 SEQ IDNO:7的相应位置处以一个非天然编码氨基酸进行取代，其中所述非天然编码氨基酸与一个聚合物连接，所述聚合物包含聚乙二醇；所述经修饰人类FGF-21多肽具有至少一种FGF-21的生物活性，且所述非天然编码氨基酸选自对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氣氧基、餅基、酸餅基、氣基服基、置氣基、炔基或对置氣基苯丙氣酸。
3.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含对乙酰基苯丙氨酸。
4.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述聚乙二醇具有介于0.1kDa与10kDa之间的平均分子量。
5.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述聚乙二醇具有30kDa的平均分子量。
6.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述聚乙二醇是分枝或多臂的。
7.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述经修饰人类FGF-21多肽所具有的活体内半衰期，较未包含有所述非天然编码氨基酸以及所述聚合物的相应人类FGF-21多肽为高。
8.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述经修饰人类FGF-21多肽所具有的血清半衰期，为未包含有所述非天然编码氨基酸以及所述聚合物的相应人类FGF-21多肽的血清半衰期的至少五倍。
9.一种经修饰人类FGF-21多肽，其包含SEQ ID NO:1的多肽序列，且在SEQ ID NO:1的108位置处以一个非天然编码氨基酸进行取代，其中所述非天然编码氨基酸与一个聚合物连接，所述聚合物包含聚乙二醇；所述经修饰人类FGF-21多肽具有至少一种FGF-21的生物活性，所述非天然编码氨基酸包含对乙酰基苯丙氨酸，且所述聚乙二醇具有30kDa的平均分子量。
10.根据权利要求9所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述聚合物与所述多肽是以肟键连接，所述肟键是由所述对乙酰基苯丙氨酸与一个和所述聚合物相连接的氨氧基经反应而形成。
11.一种组合物，其包含医药学上可接受的载剂和根据权利要求1至10中任一项所述的经修饰人类FGF-21多肽。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述的组合物更包含第二药剂。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述的第二药剂是选自于由下列所组成之群组:双胍类、噻唑烷二酮、磺酰脲类、苯甲酸衍生物、葡糖苷酶抑制剂和前述物质的混合物。
14.一种根据权利要求11所述组合物的用途，用于制造供用于治疗经投与FGF-21可加以治疗或预防的病状的治疗方案中的药剂，其中所述药剂包含所述组合物的预防或治疗有效量。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述治疗方案包括投与所述组合物以及投与包含附加药物的第二药剂，其中所述投与可同时或分别进行，可依照任一次序投与。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述附加药物是选自于由下列所组成之群组:双胍类、噻唑烷二酮、磺酰脲类、苯甲酸衍生物、葡糖苷酶抑制剂和前述物质的混合物。
17.一种根据权利要求11所述组合物的用途，用于制造供用于经由增加脂肪细胞的葡萄糖摄取而增加葡萄糖利用或治疗、预防或缓解以下病状的治疗方案中的药剂:2型糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合症或前述病症的组合；其中所述药剂包含所述组合物的预防或治疗有效量。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述治疗方案包括投与所述组合物以及投与包含附加药物的第二药剂，其中所述投与可同时或分别进行，可依照任一次序投与。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述附加药物是选自于由下列所组成之群组:双胍类、噻唑烷二酮、磺酰脲类、苯甲酸衍生物、葡糖苷酶抑制剂和前述物质的混合物。
20.一种核酸，其包含編碼SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的多肽的序列，且所述核酸包含一个选择密码子，所述选择密码子編碼在下列位置处进行取代的一个非天然编码氨基酸:所述SEQ ID NO:1的108 位置处或所述 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6 或SEQ ID NO: 7的相应位置处；其中所述核酸在当存在有正交RNA的情况下进行表达时，允许可产生包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7的多肽序列的经修饰人类FGF-21多肽，其中在所述SEQ ID NO:1的108 位置处或所述 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6 或SEQ ID NO:7的相应位置处是以选自对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸的非天然编码氨基酸进行取代。
21.—种分离细胞，其包含根据权利要求20所述的核酸，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶。
22.—种产生经修饰人类FGF-21多肽的方法，所述方法包括:于适当的培养基中培养包含根据权利要求20所述核酸的分离细胞，所述细胞更包含有正交RNA合成酶和正交tRNA;其中当所述核酸在所述细胞中进行表达时，即可产生包含SEQ ID NO: K SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7 的多肽序列的经修饰人类FGF-21多肽，其中在SEQ ID NO:1的108位置处或SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的相应位置处以一个非天然编码氨基酸进行取代，且所述非天然编码氨基酸选自对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法更包括:使所述经修饰人类FGF-21多肽和具有可与所述非天然编码氨基酸反应的聚乙二醇的聚合物接触反应，藉以将所述经修饰人类FGF-21多肽连接至所述具有聚乙二醇的聚合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含对乙酰基苯丙氨酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述聚合物与所述多肽是以肟键连接，所述肟键是由所述对乙酰基苯丙氨酸与一个和所述聚合物相连接的氨氧基经反应而形成。
26.一种经修饰人类 FGF-21 多肽，其包含 SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6或SEQ ID NO:7的多肽序列，且在以下残基位置处以一个非天然编码氨基酸进行取代:SEQ ID勵:1的72、77、86、87、91、104、108、110、126、.131、146 位置处或 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6 或SEQ ID N0:7的相应位置处，且 i)其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中R为并非存在于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的侧链的取代基，且其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代:SEQID NO:1 的 72、77、86、87、91、104、108、110、126、131、146 位置处或另一人类 FGF-21 多肽中的相应氨基酸位置； ?)其中所述非天然编码氨基酸为苯丙氨酸衍生物；或 iii)其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中R为并非存在于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的侧链的取代基，其中所述多肽包括有与 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID N0:6 或 SEQ ID N0:7 具有 95 致性的序列。
【文档编号】C07K14/50GK104163864SQ201410360138
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2008年3月19日 优先权日:2007年3月30日
【发明者】汤姆士·P.·库杰克, 罗伯托·马利安, 安娜玛莉亚·A.·海斯·蒲楠, 威廉·M.·基夫, 尼克·克努森, 何莉莲, 杰森·品克史塔夫, 瓦迪姆·克赖诺夫 申请人:Ambrx公司