强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，涉及一类强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用。本发明的强分泌性信号肽增强小肽模序，其具有如下通式的氨基酸序列：M(aXf3Yy/aY13Xy)n，其中X代表酸性氨基酸;Y代表碱性氨基酸■’a为0-2个中性氨基酸;P代表0-2个中性氨基酸;Y代表1-10个中性氨基酸；n为1-3。本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的应用，即将本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽模序用于构建一种增强普通信号肽分泌能力的载体，以提高其分泌表达外源蛋白的方法。
【专利说明】强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用
[0001] 本申请是一件发明专利申请的分案申请。原申请的申请日为2013年5月3日，申 请号为201310162455. 9,发明创造名称为"强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用"。
【技术领域】
[0002] 本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，涉及一类强分泌性信号肽增强小肽模序 及其应用。
【背景技术】
[0003] 蛋白质的分泌系统不仅是蛋白质分选、定位和实现生理功能的前提，更是基因工 程及蛋白质工程技术开发的重要手段。人们已经研究出多种原核和真核表达系统用以生产 重组蛋白。大肠杆菌表达系统以其遗传背景清楚、操作简单、能在廉价培养基中迅速生长及 易于大规模发酵培养等特点而备受关注；目前大肠杆菌体系已用于制备多种酶制剂，甚至 一些药用蛋白质，如干扰素、胰岛素和人血清蛋白等，在生物【技术领域】取得了令人瞩目的成 果。
[0004] 在大肠杆菌中，重组蛋白在原则上可以被以下几种方式生产：1、可溶性蛋白胞内 生产；2、包涵体胞内生产；3、分泌至周质空间或胞外培养基中。大肠杆菌体系适合于生产 翻译后无需修饰加工的蛋白质，且由于大肠杆菌缺乏蛋白折叠过程中需要的辅助因子，往 往使中间体大量积聚，易形成包涵体沉淀，还须经过复性等繁琐过程；而周质氧化型的氧化 还原环境有利于蛋白质的折叠。如果蛋白质跨过细胞的内膜定位于周质空间，甚至穿过细 胞外膜直接分泌至胞外培养基中，可以极大简化下游复性及分离纯化工艺，减少表达蛋白 对宿主菌的毒性和代谢负担，显著提高表达量。
[0005] 现有的分泌表达体系大多数是分泌到周质空间，获取重组蛋白仍然需要细胞破碎 和纯化。少数分泌到胞外的则由于大肠杆菌本身的蛋白质分泌系统不够完善，或人类对其 分泌系统认识的局限性，导致了分泌效率极低及融合蛋白的后加工问题。
[0006] 信号肽是一类10-60个氨基酸左右的多肽，一般位于分泌蛋白的N端。利用信号 肽分泌表达蛋白，一般操作方法是将目的蛋白的编码基因克隆到信号肽序列后端，在宿主 中实现目的基因和信号肽序列在转录和翻译水平的融合，依靠蛋白质前体N端信号肽引导 整个多肽链与胞内分子伴侣或分泌信号识别颗粒的结合、膜定位或分泌出胞外。
[0007] 尽管胞外分泌表达策略相比其他表达方式有着显著的优势，但是目前在大肠杆菌 体系中广泛运用此种策略仍有诸多限制。因此，拥有能够携带目的蛋白分泌出胞外的信号 肽是先决条件，并且即使信号肽具有介导蛋白胞外分泌的能力，也并不表明特定的信号肽 对所有的重组蛋白具有这种介导能力或者具有同样水平的介导能力。每个重组蛋白具有自 己特定的编码基因，信号肽和重组蛋白的过渡点序列不同，而且重组蛋白自身的结构也有 差异，因而重组蛋白的分泌水平取决于其信号肽的最优化水平、目标蛋白有利的跨膜结构 以及它们之间的匹配度水平。
[0008] 大肠杆菌表达系统中，分泌蛋白穿越质膜的基本分泌途径以Sec或Tat这两种系 统为主，例如外膜蛋白（OmpA)信号肽、果胶酸脂裂解酶（PelB)信号肽通过Sec途径，三甲 胺N氧化物还原酶（TorA)信号肽通过Tat途径，这两种类型的信号肽都有成功运用于分泌 表达外源蛋白的案例。
【发明内容】
[0009] 本发明的技术目的在于提供一种具有增强信号肽分泌效率的功能的强分泌性信 号肽增强小肽模序，使得通过在诸如ompA信号肽或pelB信号肽前端融合添加本发明的小 肽模序，可以实现上述信号肽在大肠杆菌体系中的分泌表达外源蛋白的能力。
[0010] 本发明的另一个技术目的在于提供上述具有增强信号肽分泌效率的功能的强分 泌信号肽增强小肽模序的应用，即将此小肽模序用于构建一种增强普通信号肽分泌能力的 载体，以提高其分泌表达外源蛋白的方法。
[0011] 本发明中的术语"分泌"，是指蛋白质或肽的分子被转运到细菌细胞的外部，而且 它也包括这样的情况：其中蛋白质或肽分子最终以完全游离的形式置于培养基中，以及其 中部分蛋白质处在细菌外部或部分蛋白质存在于细菌的周质空间。
[0012] 本发明中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：
[0013] 蛋白质氨基酸或多核苷酸的"变体"是指具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的 氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述"改变"可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨 基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有保守性改变，其中替换的氨基酸具有与原氨 基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可以具有非保守性改变， 如用色氨酸替换甘氨酸。
[0014] "缺失"是指氨基酸序列或核苷酸序列中的一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。 "插入"或"添加"是指氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与原先分子相比，一个或多个 氨基酸或核苷酸的增加。"替换"是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核 苷酸。
[0015] 为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案如下：
[0016] -、强分泌性信号肽增强小肽模序，其具有如下通式的氨基酸序列：Μ( α X β Y Y / α Υβ X Y )η,
[0017] 其中X代表酸性氨基酸；
[0018] Y代表碱性氨基酸；
[0019] α为0-2个中性氨基酸；
[0020] β代表0-2个中性氨基酸；
[0021] Y代表1-10个中性氨基酸；
[0022] η 为 1-3。
[0023] 其中，通式中的" / "为"或者"之意。
[0024] 进一步的，X代表的酸性氨基酸优选为Glu或Asp。
[0025] 进一步的，Y代表的碱性氨基酸优选为Arg或Lys。
[0026] 进一步的，中性氨基酸优选为Ala、Cys、Leu、Val、Ile或者Phe。
[0027] 进一步的，当η = I时，本发明的小肽膜序的增强分泌效果较佳。
[0028] 进一步的，作为本发明的一个最优选的实施例，当α为1个中性氨基酸，β为〇个 中性氨基酸，Y为2-5个中性氨基酸，X为Glu，Y为Arg时，该小肽膜序的增强分泌效果最 佳。
[0029] 因此，根据上述通式得出的本发明所保护的小肽模序，其例如原始小肽模序为： MERACVAV ;则其衍生的类似物可以如下变化：
[0030] MREACVAV
[0031] MAERACVAV ；
[0032] MEARACVAV ；
[0033] MDKACVAV ；
[0034] MERLIVFAV； -〇
[0035] 或小肽模序的叠加如MERACVA+VEARLIVFAV等，更多衍化类型详见本发明具体实 施方式。
[0036] 二、本发明还要求保护本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的变体，其具 有对本发明的强分泌性信号肽增强小肽模序的其中1个或多个氨基酸残基的插入或缺失 和/或性质相似的氨基酸取代1个或多个氨基酸残基。根据本领域技术人员的公知常识可 知，这种变体仍具有信号肽的特性或增强分泌的功能，因此，其也应当属于本发明要求保护 的强分泌性信号肽增强小肽模序的范围。
[0037] 三、编码具有本发明所示的强分泌性信号肽增强小肽模序的多肽、类似物或衍生 物的多核苷酸。根据本领域技术人员的公知常识可知，这种类似物或衍生物的多核苷酸仍 具有信号肽的特性或增强分泌的功能，因此，其也应当属于本发明要求保护的强分泌性信 号肽增强小肽模序的范围。
[0038] 四、一种含有外源多核苷酸的重组载体，其是由本发明第三点所述的多核苷酸与 质粒载体构建而成的重组载体。
[0039] 五、一种含有外源多核苷酸的遗传宿主细胞，它是由第四点所述的重组载体转化 或转导的宿主细胞。
[0040] 六、本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的应用，即将本发明所述的强分 泌性信号肽增强小肽模序用于构建一种增强普通信号肽分泌能力的载体，以提高其分泌表 达外源蛋白的方法。
[0041] 具体的，是指通过在信号肽前端融合添加本发明所述的强分泌性信号肽增强小肽 模序，以此构建的分泌载体转化进大肠表达宿主后诱导表达，以实现强分泌性信号肽增强 小肽模序的增强分泌功能。
[0042] 在本发明的【具体实施方式】中，采用Arthrobacter arilaitensis来源的果糖苷酶 FRU6和来源于枯草芽孢杆菌B. subti I is的葡聚糖酶BGL作为目标蛋白，普通的信号肽选自 外膜蛋白的ompA和来自果胶酸脂裂解酶的pelB信号肽。通过在ompA或pelB信号肽前端 融合添加本发明的小肽模序，以此构建的分泌载体转化进大肠表达宿主后诱导表达，通过 检测方法验证本发明的小肽模序的增强分泌功能。
[0043] 本发明采用的宿主为E. coil BL21 (DE3)，以大肠杆菌pET-22b作为载体构建的基 本框架，去除原pET-22b中的peIB信号肽序列。通过重叠 PCR的方法融合ompA信号肽/peIB 信号肽和果糖苷酶FRU6或葡聚糖酶BGL，设计上游引物将小肽模序基因添加到信号肽基因 序列前。通过酶切位点的酶切和连接操作，构建成分泌增强型表达载体pET-EompA-FRU6和 pET-EpelB-FRU6 以及 pET-EompA-BGL 和 pET-EpelB-BGL。
[0044] 将含有融合的增强分泌型信号肽与果糖苷酶FRU6 (或葡聚糖酶BGL)基因的重组 质粒载体 pET-EompA-FRU6 和 pET-EpelB-FRU6 (或 pET-EompA-BGL 和 pET-EpelB-BGL)转化 进宿主大肠杆菌BL21后，分别命名为BL21/pET-EompA-FRU6和BL21/pET-EpelB-FRU6 (或 BL21/pET-EompA-BGL和 BL21/pET-EpelB-BGL)。在 LB培养基进行诱导表达，诱导剂为 IPTG。
[0045] 上述两种目标蛋白分泌表达后的结果通过检测培养基细胞内外的酶活以及 SDS-PAGE 分析。
[0046] 本发明采用的分泌实例为果糖苷酶FRU6以及β -1，3-1，4葡聚糖酶BGL。果糖苷酶 FRU6(分子量约为 55kDa，来源于 Arthrobacter arilaitensis NJEM01，菌种保藏号 CCTCC M2012155)。果糖苷酶系统分类号为EC 3. 2. 1.80,是一种胞外酶，特异性地催化水解由 β -D-果糖组成的果聚糖分子中的非还原性末端2, 1- β -糖苷键或2, 6- β -糖苷键，此外， 还可水解菊糖、蔗糖、棉子糖等。在生物、医药、食品等领域均有着广泛的利用价值。葡聚糖 酶BGL(分子量约为28kDa，EC 3. 2. 1. 73, β-葡聚糖酶，来源于枯草芽孢杆菌Β. subtilis) 是一种内切水解酶，能高效、转移性地水解β -葡聚糖中与β -1，3糖苷键毗邻的β -1，4糖 苷键，从而减少谷物中β -葡聚糖给工业生产带来的负面影响，在啤酒酿造业、饲料业等领 域有着十分重要的应用。
[0047] 除上述以外，本发明的有益效果还在于：本发明的可增强分泌功能的小肽模序，其 对目标蛋白的增强分泌效果显著。运用在果糖苷酶FRU6的分泌表达实例的实验显示，在 ompA信号肽前添加小肽模序比未添加的分泌效率最高提高了达5. 1倍，在pelB信号肽前添 加小肽模序比未添加的分泌效率最高提高了达5. 4倍。运用在葡聚糖酶BGL的分泌表达实 例显示，小肽模序对ompA信号肽最高提高了 2. 3倍，对PelB信号肽最高提高了 2. 5倍。另 夕卜，本发明所构建的分泌表达载体可以运用到多种重组蛋白生产上。
【专利附图】
【附图说明】
[0048] 图1重组载体pET-EompA_FRU6的图谱；
[0049] 其中，ompA SP :外膜蛋白A信号肽编码序列；FRU6 :果糖苷酶FRU6编码序列；Amp sequence :氨节霉素抗性基因编码序列；T7promoter :T7启动子。
[0050] 图2小肽模序增强分泌效率与发酵时间的关系。
[0051] 图 3LB 培养基中 BL21/pET-EompA-FRU6 和 BL21/pET-EpelB-FRU6 与阴性对照发酵 上清液酶活力比较。
[0052] 图4LB培养基中BL21/pET-EompA-FRU6发酵液的SDS-PAGE电泳图谱；
[0053] 其中，M :蛋白质Marker ; 1和2 :阴性对照，果糖苷酶FRU6前不含信号肽序列 的BL21菌株发酵上清液和菌体破碎上清；3和4 :BL21/pET-〇mpA-FRU6菌株发酵液上 清和菌体破碎上清。5和6 :BL2l/pET-EompA-FRU6菌株发酵液上清和菌体破碎上清。 (pET-EompA-FRU6质粒中，ompA信号肽前添加的小肽模序序列为MERACALA)。箭头方向为 果糖苷酶FRU6成熟肽分子量大小位置。
[0054] 图5LB培养基中BL21/pET-EpelB-FRU6发酵液的SDS-PAGE电泳图谱；
[0055] 其中，M :蛋白质Marker ; 1和2 :阴性对照，果糖苷酶FRU6前不含信号肽序 列的BL21菌株发酵上清液和菌体破碎上清；3和4 :BL21/pET-pelB-FRU6菌株发酵液 上清和菌体破碎上清。5和6 :BL21/pET-EpelB-FRU6菌株发酵上清和菌体破碎上清。 (pET-EpelB-FRU6质粒中，pelB信号肽前添加的小肽模序序列为MERACALA)。箭头方向为 果糖苷酶FRU6成熟肽分子量大小位置。
[0056] 图6LB培养基中BL21/pET-EompA-BGL发酵液的SDS-PAGE电泳图谱；
[0057] 其中，M :蛋白质Marker ;1和2 :阴性对照，葡聚糖酶BGL前不含信号肽序列的BL21 菌株发酵上清液和菌体破碎上清；3和4 :BL21/pET-〇mpA-BGL菌株发酵液上清和菌体破碎 上清。5和6 :BL21/pET-EompA-BGL菌株发酵液上清和菌体破碎上清。（pET-EompA-BGL质 粒中，ompA信号肽前添加的小肽模序序列为MERACALA)。箭头方向为葡聚糖酶BGL成熟肽 分子量大小位置。
[0058] 图7LB培养基中BL21/pET-EpelB-BGL发酵液的SDS-PAGE电泳图谱；
[0059] 其中，M为蛋白质Marker ;1和2 :阴性对照，葡聚糖酶BGL前不含信号肽序列的 BL21菌株发酵上清液和菌体破碎上清；3和4 :BL21/pET-pelB-BGL菌株发酵液上清和菌体 破碎上清；5和6 :BL21/pET-EpelB-BGL菌株发酵液上清和菌体破碎上清。（pET-EpelB-BGL 质粒中，peIB信号肽前添加的小肽模序序列为MERACALA)。箭头方向为葡聚糖酶BGL成熟 肽分子量大小位置。
【具体实施方式】
[0060] 下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用涉及质粒、试剂等材料 均可从商业途径获得。
[0061] 实施例1.小肽增强模序在果糖苷酶分泌表达上的应用
[0062] 首先，本实施例所述的果糖苷酶Fru6基因的来源是：Arthrobacter arilaitensis NJEMOl菌，为本发明人的在先中国专利申请CN102732456A，该菌株的保藏编号为：CCTCC NO ：M2012155〇
[0063] 本实施例所涉及的所有引物均由英骏公司合成，见表1。以下引物编号统一用"P" 加序号来表示，例如，表2中的第45号引物，其代码即P45,其在序列表的编号为SEQ ID NO: 45。
[0064] 表1实施例1所需的引物和合成序列的核苷酸序列
【权利要求】
1. 强分泌性信号肽增强小肽模序，其特征在于其具有如下通式的氨基酸序列： Μ(α ΥβΧγ)η, 其中X代表酸性氨基酸Glu或Asp ; Y代表碱性氨基酸Arg或Lys ; α为0-2个中性氨基酸； β代表0-2个中性氨基酸； Y代表1-10个中性氨基酸； η 为 1-3。
2. 根据权利要求1所述的强分泌性信号肽增强小肽模序，其特征在于所述的中性氨基 酸为 Ala、Cys、Leu、Val、Ile 或者 Phe。
3. 根据权利要求I所述的强分泌性信号肽增强小肽模序，其特征在于所述的n为1。
4. 根据权利要求1所述的强分泌性信号肽增强小肽模序，其特征在于所述的α为1个 中性氨基酸，β为〇个中性氨基酸，Y为2-5个中性氨基酸，X为Glu，Y为Arg。
5. 权利要求1所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的变体，其具有权利要求1的强分 泌性信号肽增强小肽模序的其中1个或多个氨基酸残基的插入或缺失和/或性质相似的氨 基酸取代1个或多个氨基酸残基。
6. 编码具有权利要求1所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的多肽、类似物或衍生物 的多核苷酸。
7. -种含有外源多核苷酸的重组载体，其是由权利要求6所述的多核苷酸与质粒载体 构建而成的重组载体。
8. -种含有外源多核苷酸的遗传宿主细胞，它是由权利要求7所述的重组载体转化或 转导的宿主细胞。
9. 权利要求1所述的强分泌性信号肽增强小肽模序的应用，其特征在于将强分泌性信 号肽增强小肽模序用于构建一种增强普通信号肽分泌能力的载体，以提高其分泌表达外源 蛋白的方法。
【文档编号】C07K7/06GK104211776SQ201410461838
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月3日 优先权日:2013年5月3日
【发明者】何冰芳, 陈文华, 米兰, 吴珊珊, 朱芸, 陈珊珊 申请人:南京工业大学