提取雷帕霉素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取雷帕霉素的方法，具有以下步骤：①将含有雷帕霉素的发酵液过滤，滤饼用有机溶剂抽提后，再次过滤，滤液经浓缩后，得到第一浓缩液；②将第一浓缩液经大孔吸附树脂柱吸附后，洗脱大孔吸附树脂柱，并将收集的洗脱液浓缩，得到第二浓缩液；③将第二浓缩液萃取后再浓缩，得到第三浓缩液；④将第三浓缩液经柱层析后再次洗脱，并将收集的洗脱液再次浓缩，得到第四浓缩液；⑤将第四浓缩液结晶后，再重结晶，得到雷帕霉素。本发明采用的大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂，洗脱采用的溶剂为丙酮，这样最终可以得到含量、纯度、收率均较高的雷帕霉素。
【专利说明】提取雷帕霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分离纯化【技术领域】，具体涉及一种提取雷帕霉素的方法。
【背景技术】
[0002] 雷帕霉素，又名西罗莫司，属大环内酯类抗生素，是一种疗效好、低毒、无肾毒性的 新型免疫抑制剂，它是从吸水链霉菌发酵液中提取得到的。
[0003] 中国专利文献CN102070652A公开了一种从发酵液中分离提取西罗莫司的方法， 包括将西罗莫司发酵液过滤或离心分离后得到菌丝体，然后经萃取、脱色、减压浓缩得到西 罗莫司粗提物，接着进行高速逆流色谱分离，最后减压浓缩、干燥得到西罗莫司纯品。该方 法需要采用价格昂贵的高速逆流色谱仪，导致生产成本较高，而且纯度较低，不到90%，从而 不适于工业化大生产。
[0004] 中国专利文献CN102372726A公开了一种西罗莫司粗晶的制备方法，包括将西罗 莫司菌丝体的浸提液减压浓缩后加入固体吸附剂吸附，然后经萃取、洗涤、减压浓缩、洗涤、 结晶、洗晶、干燥得到西罗莫司纯品。产物纯度为95%?98%，含量为77. 4%?84. 1%，收率 为63. 3%?72. 3%。该方法采用硅藻土、硅胶等固体吸附剂进行吸附杂质，效果不佳，最终得 到的西罗莫司含量和纯度均较低，收率也不高，同样不适于工业化大生产。
[0005] 中国专利文献CN102443012A公开了一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法，包括 将发酵液过滤后得到的菌丝体抽提后真空浓缩，同时将发酵液过滤后得到的上清液萃取分 离后真空浓缩，将两个浓缩液合并后经大孔树脂吸附洗脱并真空浓缩，接着依次进行萃取、 脱水、真空浓缩、柱层析、洗涤、洗脱、真空浓缩、结晶、真空浓缩、重结晶得到雷帕霉素纯品， 纯品纯度为99. 5%?99. 6%，单杂小于0. 1%，收率最高可达60%。其中大孔树脂吸附洗脱采 用的大孔树脂为乂?-5、0丨&丨〇11即20、5?825，大孔树脂与浓缩液的体积比为1:5?1:20， 洗脱剂为丙酮和水的混合液，洗脱温度为15?35°C，洗脱pH为5. 0?8. 0。该方法采用大 孔吸附树脂吸附可以有效提高雷帕霉素纯度，但是收率仍然较低。
[0006] 关于在提取雷帕霉素的过程采用大孔吸附树脂，邓芸等在《沈阳药科大学学报》 (2011年12月，第28卷第12期，第991-994页)公开了大孔吸附树脂在雷帕霉素分离纯化 中的应用，该文献考察了X-5、D3520、AB-8、MN-200以及MN-202这五种大孔吸附树脂对雷 帕霉素的吸附量，并且考察了甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷以及氯仿这六种洗脱剂 对雷帕霉素的解析率，其中X-5大孔吸附树脂吸附能力最强，乙醇和二氯甲烷的洗脱能力 最强。
[0007] 另外，由上述文献可知，在提取雷帕霉素的过程中需要进行多次浓缩，而目前常用 的浓缩为旋转蒸发浓缩或者升膜降膜浓缩，对于经大孔树脂吸附后洗脱收集的洗脱液，上 述两种浓缩效果均不佳。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于解决上述问题，提供一种分离纯化效果较好的提取雷帕霉素的 方法。
[0009] 实现本发明目的的技术方案是：一种提取雷帕霉素的方法，具有以下步骤：①将 含有雷帕霉素的发酵液过滤，滤饼用有机溶剂抽提后，再次过滤，滤液经浓缩后，得到第一 浓缩液；②将步骤①得到的第一浓缩液经大孔吸附树脂柱吸附后，洗脱大孔吸附树脂柱，并 将收集的洗脱液浓缩，得到第二浓缩液；③将步骤②得到的第二浓缩液萃取后再浓缩，得到 第三浓缩液；④将步骤③得到的第三浓缩液经柱层析后再次洗脱，并将收集的洗脱液再次 浓缩，得到第四浓缩液；⑤将步骤④得到的第四浓缩液结晶后，再重结晶，得到雷帕霉素。
[0010] 上述步骤②中采用的大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂，洗脱采用的溶剂为丙 酮。
[0011] 上述步骤②中所述的浓缩为离心薄膜浓缩。
[0012] 上述步骤②中的洗脱过程如下：先用体积分数为10%?30%的丙酮清洗大孔吸附 树脂2?8个柱体积，然后再用体积分数为20%?50%的丙酮清洗大孔吸附树脂2?8个 柱体积，接着用体积分数为30%?60%的丙酮清洗大孔树脂2?8个柱体积，直至TLC检测 发现流出液中含有雷帕霉素，最后用体积分数为60%?90%的丙酮清洗大孔吸附树脂直至 TLC检测发现流出液中不含雷帕霉素。
[0013] 上述步骤②中的洗脱过程优选如下：先用体积分数为20%的丙酮清洗大孔吸附树 脂5个柱体积，然后再用体积分数为35%的丙酮清洗大孔吸附树脂5个柱体积，接着用体积 分数为50%的丙酮清洗大孔树脂5个柱体积，直至TLC检测发现流出液中含有雷帕霉素，最 后用体积分数为80%的丙酮清洗大孔吸附树脂直至TLC检测发现流出液中不含雷帕霉素。
[0014] 本发明具有的积极效果：（1)本发明通过大量实验最终发现，采用AB-8作为大孔 吸附树脂以及丙酮作为洗脱溶剂，最终可以使的得到的雷帕霉素中几乎没有水溶性杂质， 而且脂溶性杂质残留明显减少，从而可以得到含量、纯度、收率均较高的雷帕霉素。（2)本发 明针对树脂洗脱液对温度较为敏感的特点，采用离心薄膜真空蒸发器进行离心薄膜浓缩， 这样可以大大降低蒸发温度(一般在60°C以下，最低可达30°C以下)，从而保证了浓缩效果， 而且整个浓缩过程仅需1?2秒，既提高了效率，也降低了成本。
【具体实施方式】
[0015] (实施例1) 本实施例的提取雷帕霉素的方法具有以下步骤： ①将含有雷帕霉素的发酵液（300L，效价为I.Og/L)过滤，滤饼用丙酮抽提3次后，再次 过滤，滤液经真空浓缩后，得到第一浓缩液。
[0016] ②将步骤①得到的第一浓缩液先以10倍体积以及5BV/h的流速流过经预处理后 的AB-8大孔吸附树脂柱，使雷帕霉素吸附在大孔树脂上。所述的预处理是将AB-8大孔吸 附树脂先用体积分数为50%的乙醇浸泡过夜，以除去树脂内残存的致孔剂及低聚物；然后 用蒸馏水洗涤树脂5次，直至无乙醇味；最后将树脂滤去水分，装柱。
[0017] 然后对大孔吸附树脂柱进行梯度洗脱，具体如下：先用体积分数为20%的丙酮清 洗大孔吸附树脂5个柱体积，然后再用体积分数为35%的丙酮清洗大孔吸附树脂5个柱体 积，接着用体积分数为50%的丙酮清洗大孔树脂5个柱体积，直至TLC检测发现流出液中含 有雷帕霉素，最后用体积分数为80%的丙酮清洗大孔吸附树脂直至TLC检测发现流出液中 不含雷帕霉素。整个洗脱时间为7h。
[0018] 最后，将收集的洗脱液采用离心薄膜真空蒸发器进行离心薄膜浓缩，得到第二浓 缩液。
[0019] 离心薄膜浓缩具体方法如下： a、 将洗脱液由进料螺杆泵输送至卧式离心薄膜蒸发器，并由变频调速器控制螺杆泵转 速以调节流量； b、 将洗脱液在蒸发器内进行真空浓缩，并通过控制加热蒸汽温度和进料量，达到预定 的工艺浓缩要求； c、 将浓缩后的洗脱液借离心力的作用经由出料管通过出料螺杆泵在锥形转鼓内周面 内可完成整个蒸发过程，并使挥发出的轻组份经二次蒸汽出口进入冷凝器回收，重组分由 浓缩液出口收集管输送进成品储罐。
[0020] ③将步骤②得到的第二浓缩液用乙酸乙酯萃取3次后再次真空浓缩，得到第三浓 缩液。
[0021] ④将步骤③得到的第三浓缩液经硅胶柱层析分离后，用丙酮进行洗脱，并将收集 的洗脱液再次真空浓缩，得到第四浓缩液。
[0022] ⑤将步骤④得到的第四浓缩液先用4倍体积的乙醚在KTC的温度下结晶12h，然 后再用乙醚在5°C的温度下重结晶12h，干燥得到261g的雷帕霉素。
[0023] 经检测，雷帕霉素的含量为98. 5%(HPLC，内外标法)，纯度为99.8% (HPLC，面积归 一法)，收率为85. 5%。
[0024](对比例1?对比例8) 各对比例与实施例1基本相同，不同之处在于大孔吸附树脂种类和洗脱溶剂，具体见 表1。
[0025]表1
【权利要求】
1. 一种提取雷帕霉素的方法，具有以下步骤： ① 将含有雷帕霉素的发酵液过滤，滤饼用有机溶剂抽提后，再次过滤，滤液经浓缩后， 得到第一浓缩液； ② 将步骤①得到的第一浓缩液经大孔吸附树脂柱吸附后，洗脱大孔吸附树脂柱，并将 收集的洗脱液浓缩，得到第二浓缩液； ③ 将步骤②得到的第二浓缩液萃取后再浓缩，得到第三浓缩液； ④ 将步骤③得到的第三浓缩液经柱层析后再次洗脱，并将收集的洗脱液再次浓缩，得 到第四浓缩液； ⑤ 将步骤④得到的第四浓缩液结晶后，再重结晶，得到雷帕霉素； 其特征在于：步骤②中采用的大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂，洗脱采用的溶剂为 丙酮。
2. 根据权利要求1所述的提取雷帕霉素的方法，其特征在于：步骤②中的洗脱过程如 下：先用体积分数为10%?30%的丙酮清洗大孔吸附树脂2?8个柱体积，然后再用体积分 数为20%?50%的丙酮清洗大孔吸附树脂2?8个柱体积，接着用体积分数为30%?60% 的丙酮清洗大孔树脂2?8个柱体积，直至TLC检测发现流出液中含有雷帕霉素，最后用体 积分数为60%?90%的丙酮清洗大孔吸附树脂直至TLC检测发现流出液中不含雷帕霉素。
3. 根据权利要求2所述的提取雷帕霉素的方法，其特征在于：步骤②中的洗脱过程如 下：先用体积分数为20%的丙酮清洗大孔吸附树脂5个柱体积，然后再用体积分数为35%的 丙酮清洗大孔吸附树脂5个柱体积，接着用体积分数为50%的丙酮清洗大孔树脂5个柱体 积，直至TLC检测发现流出液中含有雷帕霉素，最后用体积分数为80%的丙酮清洗大孔吸附 树脂直至TLC检测发现流出液中不含雷帕霉素。
4. 根据权利要求1至3之一所述的提取雷帕霉素的方法，其特征在于：上述步骤②中 所述的浓缩为离心薄膜浓缩。
【文档编号】C07D498/18GK104262358SQ201410511513
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】虞小平, 殷侃 申请人:常州兰陵制药有限公司