血清脂类、脂蛋白及载脂蛋白高效浓缩提取方法
【专利摘要】本发明提供了一种从血清中浓缩提取脂类、脂蛋白和载脂蛋白的新方法。该方法充分利用阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂的搭配使用，采用合适的沉淀剂浓度，并控制沉淀时间，使得到的溶解液中各种成分的比例接近原血清中各种成分的比例，且减少了操作步骤。所得的血清脂类、脂蛋白和载脂蛋白仍保持较好的水溶性和生物活性。该法简单、高效，适合大规模制备，具有良好的应用前景。
【专利说明】血清脂类、脂蛋白及载脂蛋白高效浓缩提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体的，涉及到一种血清中脂类、脂蛋白和载脂蛋白的 提取浓缩方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着生活水平的提高和生活方式的改变，心脑血管疾病已成为威胁人类 生命健康的头号杀手。目前我国已有超过1. 6亿人患有高血脂,有上千万的心脑血管疾病 病人，平均每十几秒就有一人死于心脑血管病。这使得心脑血管疾病超过癌症、乙肝、艾滋 病等，成为我国死亡率最高的一类疾病。
[0003] 这类疾病涉及到血清中的脂类以及相关的蛋白浓度的异常，这些物质主要有胆 固醇（TC)、甘油三酯（TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)、载 脂蛋白Al (ApoAl)、载脂蛋白All (Ap0AII)、载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白E(ApoE)、载脂蛋白 D(ApoD)、载脂蛋白H(ApoH)以及脂蛋白（a) (Lp(a))等，这些物质在血液中的运输和代谢情 况与人的健康有着密切联系。部分物质的含量或结构发生变化预示着人体健康状况的改 变。所以对于这些脂类、脂蛋白和载脂蛋白的研究有重要意义，因而成为学界的热点。而其 中具有重要诊断学意义的有TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoAl、ApoB和Lp (a)。本发明即以以上 七种物质作为目标进行研究。
[0004] 浓缩提取得到符合条件的血清脂质、脂蛋白和载脂蛋白是进行后续研究的关键， 而国内外关于血清脂蛋白和载脂蛋白的提取浓缩的方法有很多。如超高速离心法，虽然方 法操作也很简便，只需用盐（如NaCl、KC1、NaBr等）来调节血清的密度，然后用离心机分 离，调节合适的转速就可使相关脂类、脂蛋白和/或载脂蛋白有较好的分离，但是所使用的 超高速离心机价格昂贵，一般实验室很难装备；其他提取方法还有毛细管电泳法，此法对少 量样品可以得到较好的分离效果，但不适用于大规模血清脂蛋白的浓缩提取，且电泳后蛋 白质大多已变性，难以进行后续研究；此外还有层析柱色谱法，这类方法都需要用到色谱填 料，价格昂贵，所需成本较高，只适合于制备高纯度的蛋白。另外也有报道用有机溶剂提取 脂蛋白，但是使用有机溶剂后脂蛋白的水溶性会降低，影响后续应用。
[0005] 因此，本发明迫切需要开发一种高效、成本低廉、适合大规模浓缩提取的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种高效、简便，适合大规模浓缩提取脂蛋白和载脂蛋白的 方法。
[0007] 本发明第一方面提供了一种从血清中提取脂蛋白及载脂蛋白的方法，所述方法包 括以下步骤：
[0008] (a)向血清原料中加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第一混合物， 并对所述第一混合物静置后离心，分别得到上清液甲及沉淀乙；
[0009] (b)向上清液甲加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第二混合物，并 对所述第二混合物静置后离心，分别得到上清液丙及沉淀丁；
[0010] (C)将沉淀乙和沉淀丁合并，加入沉淀溶解液溶解，形成合并溶液；
[0011] (d)对所述合并溶液进行离心，获得上清液，即为含有目标脂蛋白和载脂蛋白的溶 液。
[0012] 在另一优选例中，所述方法还包括：
[0013] (e)对步骤（d)中的所述上清液进行检测，其中，检测目标脂类、脂蛋白和载脂蛋 白选自下组：
[0014] 胆固醇（TC)、甘油三酯（TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、载脂蛋白Al (ApoAl)、载脂蛋白B(ApoB)、脂蛋白（a) (Lp (a))或其组合。
[0015] 在另一优选例中，所述的检测项目包括定性或定量检测。
[0016] 在另一优选例中，步骤（a)中的阴离子沉淀剂选自下组：硫酸右旋糖苷（Dextran sulface, DS)和肝素盐；和/或
[0017] 二价金属阳离子沉淀剂包括阳离子选自下组的盐类：Ca2+、Mg2+、Mn 2+或其组合。
[0018] 在另一优选例中，所述的盐类为可溶性盐类。
[0019] 在另一优选例中，阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂的组合为DS和CaCl2。
[0020] 在另一优选例中，步骤（a)中，在所述第一混合物中，阴离子沉淀剂的最终浓度范 围为0.02%-0.1%，优选地，为 0.04-0.06%^/^);和/或
[0021] 在所述第一混合物中，二价金属阳离子沉淀剂的最终浓度范围为0. 0 2mo 1 / L-0. 2mol/L，优选地，为 0? 08mol/L-0. 15mol/L。
[0022] 在另一优选例中，步骤（a)中静置时间为10-20小时，较佳地为12-18小时，和/ 或静置温度为〇_4°C ;和/或
[0023] 步骤（b)中静置时间为2-4小时，和/或静置温度为0-4°C。
[0024] 在另一优选例中，步骤（a)和步骤（b)的离心条件包括：转速为3000-5000r/min, 离心时间为20-60min ;和/或
[0025] 步骤（d)中的离心条件包括：转速为10000-15000r/min，离心时间为20-60min。
[0026] 在另一优选例中，在步骤（C)中，先用沉淀溶解液将沉淀乙溶解，获得第一溶液， 然后放置备用；
[0027] 并在获得沉淀丁后，将所述沉淀丁与所述第一溶液合并，充分溶解，获得所述合并 溶液。
[0028] 在另一优选例中，所述的沉淀溶解液选自下组：Triton X-114、NaCl、NP-40、SDS、 DOC 和 Triton X-100, K2C2O4 或其组合物。
[0029] 在另一优选例中，血清与沉淀溶解液的体积比范围为100:1-20:1，较佳的为 80:1-20:1，更佳的为 60:1-20:1。
[0030] 在另一优选例中，所述的沉淀溶解液含有选自下组的一种或多种组分：
[0031] K2C2O4 ：0. 2-lmol/L ；
[0032] SDS ：0. 5-2% (w/w)；
[0033] DOC :0.2-1% (w/w)；
[0034] NP-40 ：0. 5-1. 5% (w/w)；
[0035] Triton X-114 ：1~3% (v/v)；
[0036] Triton X-100 :1-3% (v/v)；
[0037] NaCl :100_200mmol/L。
[0038] 在另一优选例中，所述沉淀溶解液中含有0. 25M的K2C2CO4或其与其他所述组分的 组合。
[0039] 在另一优选例中，步骤（b)中，所述第二混合物中，阴离子沉淀剂的最终浓度范围 为 0? 5-1 % (w/w)，优选地，为 0? 6-0. 8% (w/w);和 / 或
[0040] 步骤（b)中，所述第二混合物中，二价阳离子沉淀剂的最终浓度范围为0. Imol/ L-0. 5mol/L，优选地，为 0? 1-0. 3mol/L。
[0041] 在另一优选例中，所述阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂的组合为DS和 CaCl2。
[0042] 在另一优选例中，所述的脂类、脂蛋白和载脂蛋白选自下组：胆固醇（TC)、甘 油三酯（TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)、载脂蛋白 八1(六口〇六1)、载脂蛋白8(六口〇8)、脂蛋白（&)(14)(&))或其组合。
[0043] 本发明的第二方面提供了一种血清中脂类、脂蛋白及载脂蛋白的提取物，所述的 提取物是用本发明第一方面的方法制备的。
[0044] 在另一优选例中，所述的提取物含有选自下组的7种脂类、脂蛋白和载脂蛋白：胆 固醇（TC)、甘油三酯（TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)、载 脂蛋白Al (ApoAl)、载脂蛋白B(ApoB)、脂蛋白（a) (Lp (a))或其组合。
[0045] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0046] 图1显示了血清原料。
[0047] 图2显示了所得第一混合物。
[0048] 图3显示了第一混合物离心后的分层状态。
[0049] 图4显示了第一混合物离心分离后的沉淀乙和上清甲。
[0050] 图5显示了第二混合物。
[0051] 图6显示了第二混合物离心之后的状态。
[0052] 图7显示了第二混合物离心后的上清丙和加入了沉淀溶解液的沉淀丁。
[0053] 图8显示了沉淀乙和沉淀丁合并加入沉淀溶解液离心后的产物，上清即为含有目 标蛋白的溶液。
【具体实施方式】
[0054] 本发明人经过长期广泛而深入的试验，通过实验和筛选，首次成功开发了一种高 效方便地从血清中浓缩提取脂蛋白和载脂蛋白的方法。本发明方法不仅操作简单，提取效 率高，而且特别适合大规模制备。用本发明方法制备的脂蛋白和载脂蛋白提取物可充分保 持了其水溶性和生物活性。在此基础上完成了本发明。
[0055] 术语
[0056] 如本文所用，术语"脂蛋白"指脂质与蛋白通过非极性相互作用结合在一起形成的 脂质-蛋白质复合物。
[0057] 如本文所用，术语"载脂蛋白"指脂蛋白中的蛋白质部分。
[0058] 如本文所用，术语"非离子型去污剂"指在水溶液中不产生离子的表面活性剂，这 类表面活性剂通常同时具备亲水和亲脂的基团。
[0059] 脂蛋白
[0060] 脂蛋白是脂质与蛋白通过非极性相互作用结合在一起形成的脂质-蛋白质复合 物。
[0061] 常见的脂蛋白有高密度脂蛋白（HDL)、低密度脂蛋白（LDL)、中等密度脂蛋白 (IDL)、极低密度脂蛋白（VLDL)和脂蛋白（a) (Lp (a))等。
[0062] 载脂蛋白
[0063] 载脂蛋白是脂蛋白中的蛋白质部分。常见的载脂蛋白载有脂蛋白Al (ApoAl)、载 脂蛋白All (Ap0AII)、载脂蛋白B (ApoB)、载脂蛋白E (ApoE)、载脂蛋白D (ApoD)、载脂蛋白 H(ApoH)以及载脂蛋白（a) (Ap (a))等。
[0064] 在诊断学上具有重要意义的脂类、脂蛋白和载脂蛋白有TC、TG、HDL-C、LDL-C、 ApoAl、ApoB和Lp (a)。本发明以以上七种物质作为目标进行研究。
[0065] 非离子型去污剂
[0066] 非离子型去污剂是在水溶液中不产生离子的表面活性剂，同时具备亲水和亲脂基 团，对于增加脂蛋白的溶解性有良好的效果，但又不至于像离子型去污剂那样可能导致蛋 白质变性，这样保证了脂蛋白最大限度的溶解。
[0067] 在本发明中，代表性的非离子型去污剂包括（但并不限于）：NP-40、DOC、Triton X-114、Triton X-100 或其组合。
[0068] 提取方法
[0069] 本发明的提取方法为化学沉淀法，采用阴离子沉淀剂和二价金属阳离子组合，与 血清中的脂类及其相关脂蛋白复合物相结合形成更大的复合物颗粒，表现为血清溶液变浑 浊，较易沉淀。然后通过离心使脂类及其相关脂蛋白与沉淀剂形成的复合物沉淀而与血清 中的其他成分分离。沉淀之后采用特定的沉淀溶解液，破坏沉淀剂与脂类及其相关脂蛋白 形成的复合物结构，释放出脂类及其相关脂蛋白，并使这些脂类及其相关脂蛋白呈溶解状 态，而二价阳离子及其他成分则形成沉淀，通过离心分离即可得到目标脂蛋白溶液。
[0070] 本发明主要优点：
[0071] 本发明的主要优点是步骤简单，实验所需设备普通，适合大规模生产，并且目标物 回收率很高，得到的目标蛋白溶液充分保持了其水溶性和生物活性，可以作为大多数血清 脂蛋白分离纯化的第一步分离步骤，也可直接作为体外诊断试剂校准品、质控品的原料，有 广泛的应用前景。
[0072] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0073] 实施例1
[0074] 沉淀剂筛选试验
[0075] 实验仪器
[0076] 所述自动分析仪为CA400自动化生化分析仪，日本古野电器株式会社生产，蓝怡 公司贴牌销售。
[0077] 在本实施例中，通过使用不同的沉淀剂组合，从而确定优化的沉淀剂组合。
[0078] 具体而言，方法包括：
[0079] (a)向血清原料IOOOml中加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第一 混合物，并对所述第一混合物静置后离心，分别得到上清液甲及沉淀乙；
[0080] (b)向上清液甲加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第二混合物，并 对所述第二混合物静置后离心，分别得到上清液丙及沉淀丁；
[0081] (C)将沉淀乙和沉淀丁合并，加入溶解液，形成合并溶液；
[0082] (d)对所述合并溶液进行离心，获得上清液，即为含有目标脂蛋白和载脂蛋白的溶 液。
[0083] (e)将步骤（d)的上清液，在自动分析仪上检测TC、TG。HDL-C、LDL-C、ApoAl、ApoB 和Lp (a)项目进行定值，并将各项目测定值记录在管上，-20°C低温保存备用。
[0084] 其中，在步骤（a)、（b)中添加的阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂见表1。
[0085] 在步骤（a)中，静置条件为静置时间为10-20小时,较佳地为12-18小时,和/或 静置温度为〇_4°C ;离心条件为转速为3000-5000r/min，离心时间为20-60min。
[0086] 在步骤（b)中，静置条件为静置时间为2-4小时，和/或静置温度为0-4°C ;离心 条件为转速为3000-5000r/min，离心时间为20-60min。
[0087] 在步骤（d)中，离心条件为转速为10000-15000r/min，离心时间为10-50min。
[0088] 由以上实验步骤所得到的产物经过仪器检测，结果见表2.
[0089] 表1 :沉淀所用的阴离子沉淀剂与二价阳离子组合及其浓度
[0090]
【权利要求】
1. 一种从血清中提取脂类、脂蛋白及载脂蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步 骤： (a) 向血清原料中加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第一混合物，并对 所述第一混合物静置后离心，分别得到上清液甲及沉淀乙； (b) 向上清液甲加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第二混合物，并对所 述第二混合物静置后离心，分别得到上清液丙及沉淀丁； (c) 将沉淀乙和沉淀丁合并，溶解，形成合并溶液； (d) 对所述合并溶液进行离心，获得上清液，即为含有目标脂蛋白和载脂蛋白的溶液。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a)中的阴离子沉淀剂选自下组：硫酸 右旋糖苷和肝素盐；和/或 二价金属阳离子沉淀剂包括阳离子选自下组的盐类：Ca2+、Mg2+、Mn2+或其组合。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a)中，在所述第一混合物中，阴离子沉 淀剂的最终浓度范围为〇. 02-0. 1% (质量）；和/或 在所述第一混合物中，二价金属阳离子沉淀剂的最终浓度范围为〇. 02mol/L-0. 2mol/ L〇
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a)中静置时间为10-20小时；和/或 静置温度为〇_4°C ;和/或 步骤（b)中静置时间为2-4小时，和/或静置温度为0-4°C。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a)和步骤（b)的离心条件包括：转速 为 3000-5000r/min，离心时间为 20-60min ;和 / 或 步骤（d)中的离心条件包括：转速为10000-15000r/min，离心时间为20-60min。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（c)中，先用沉淀溶解液将沉淀乙溶 解，获得第一溶液，然后放置备用； 并在获得沉淀丁后，将所述沉淀丁与所述第一溶液合并，充分溶解，获得所述合并溶 液。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的沉淀溶解液含有选自下组的一种或 多种组分： K2C204 ：0. 2-lmol/L ； SDS :0? 5-2% (质量）； DOC :0? 2-1% (质量）； NP-40 :0? 5-1. 5% (质量）； Tri ton X-114:l-3% (体积）； Tri ton X-100:l-3% (体积）； NaCl ：100-200mmol/L〇
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b)中，所述第二混合物中，阴离子沉淀 剂的最终浓度范围为0.5-1 % (质量）；和/或 步骤（b)中，所述第二混合物中，二价阳离子沉淀剂的最终浓度范围为0. lmol/ L_0. 5mol/L〇
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血清脂类、脂蛋白和载脂蛋白选自下 组：胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白A1、载脂蛋白 B、脂蛋白（a)或其组合。
10. -种血清脂类、脂蛋白及载脂蛋白的提取物，其特征在于，所述的提取物是用权利 要求1-9中任一方法制备的。
【文档编号】C07K14/47GK104356227SQ201410632451
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】李子樵, 陈亮德 申请人:浙江蓝怡医药有限公司, 上海蓝怡科技有限公司