专利名称：含有脂和多肽的合成肺表面活性剂的制作方法
本申请为1988年7月1日归档的申请号为NO.214，228的后续申请。
本发明涉及一系列序列与哺乳动物肺表面活性蛋白序列无关的多肽的合成，这些多肽与脂混合物的制备，生产它们和用于治疗哺乳动物呼吸系统窘迫综合症的药用组合物的方法。
幼儿呼吸系统窘迫综合症(RDS)为生命的开始28天中死亡的首要原因。全世界每一百个幼儿中便有一个幼儿患此病，有百分之十死亡。这一综合症很少发生在足月生的幼儿身上，通常发生在早产或出生时重量太小(小于2公斤)的幼儿身上。成人RDS与幼儿的这一疾病有相似的临床和病理学特性，它通过类似的强化护理的方法得到控制。成人的这一疾病有很多原因，是由各种肺损伤引起的，如扩散感染，胃容物或水的吸入，刺激物和毒素的吸入以及由过量麻醉剂等引起的肺水肿。RDS是与肺表面活性剂缺失或功能低下相关联的，肺表面活性剂覆盖在发生气体交换的肺小泡上。
肺表面活性剂主要由脂(90%)组成，含有少量的各种氨基酸(10%)。主要的脂类型为磷脂，它占全脂的97%。磷脂的80%为磷脂酰胆碱(PC)，10%为磷脂酰甘油(PG)。70～80%的磷脂酰基侧链是饱和的，其中85～90%的链长度为16个碳。主要的脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。肺表面活性剂的旦白组分是各种各样的，而且很难定性。主要的旦白质为约32kd，其序列是从其CDNA来预测的(White等人，Nature，317卷，361～363页，1985年)，它并已被克隆化(Floros等人，journalofBiologicalChemistry，260卷，495～500页，1985年)。含量较少的一些低分子量的旦白质也被分离得到了，有些序列也已有报导(Warr，等人，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA82，7915～7919，1987年;Glasser等人JournalofBiologicalChemistry，263卷9页1988年;Tohansson等人，FEBSLetters，232卷，61～64页，1988年;Glasser等人，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA84，4007，1987年;Revad等人，JouraalofclinicalInvest-(gatcon81，826-833，1988年)。
幼儿RDS一直相当成功地用动物肺灌洗液(Smgth等人，Pediatrics，71卷，913～917)，1983;McCord等人，Arch.Dis.Child.63卷，10～16页，1988年)和由人羊膜液中得到的人肺表面活性剂(Hallman等人，Pediatrics，71卷，473～482页，1983年;J.pediatr，106卷，963～969页，1985年;Merritt等人，N.Engl.J.Med.13卷，785～790页，1986年)来治疗。用有机溶剂提取过的母牛肺灌洗液合成脂混合后也是有效的(Fujiwara，等人，Lancet.1卷，55～59页，1980年;Noach等人，Eur.J.RespirDis.69卷，321～335页，1986年;KWong等人，Pediatrics，76卷，585～592，1985年Eahoning等人，Pediatrccs，76卷，145～153页，1985年;Shapiro等人，Pediatrics，76卷，593～599页，1985年;Gitlin等人，Pediatrccs，79卷，31～37页，1987年;Raju等人，Lancet，1卷，651～656页，1987年;Halliday等人，Lancet，1卷，476～478页，1984年)。然而，纯的合成得到的混合物还没确认为有活性的(Morley等人，Lancet，1卷，64～68页，1981年;十中心研究小组，Br.Med.J.294卷，991～996页，1987年;Milner等人，Arch.Dis.Child.58卷，458～460页，1983年;Milner等人，同上，59卷，369～371页，1983年;Wilkinson等人，Lancet，2卷，287～291页，1985年)。我们知道用表面活性剂在成人RDS只做了一次临床研究(Lochman等人，Adv.EXP.Med.Biol.222，511～517页，1988年)，但文献中已指出了其潜在的医疗价值(VanGolde等人，physiol，Rav.68卷，374～455页)。
肺表面活性剂制剂宜含有全部定义的组份，据报道应用单一的脂混合物成功的情况很有限，因此可看到肺表面活性剂中的旦白质成份还是必需。一种方法就是采用基因工程得到的旦白质，其序列基于由肺表面活性旦白质的CDNA预示的氨基酸序列。另一种方法，也就是本发明的主题，是合成一些同定义的脂组份联合使用时其物理特性适于表面活性剂功能的多肽，它们的序列与从肺表面活性剂中得到的旦白质的序列无关。
广义来讲，本发明是有关合成的肺表面活性剂组份的，具体些讲是有关可有效地用于治疗RDS的含有合成多肽和脂类的表面活性组合物。这些合成多肽的序列不同于从哺乳动物肺灌洗液中分离得到的旦白质的序列，这些多太可单一使用与脂组成混合物，也可联合使用与脂形成混合物。多肽只占表面活性混合物的一小部分。
本发明中的化学组份，包括多肽组份以及与脂混合形成可治疗呼吸系统窘迫综合症的组合物均为新的。本发明中的组合物可以高纯度和采用标准方法而制得，因为它为一个合成组份的限定性的组合物。另外，这些组份不是从动物源得到的，从而降低了被病毒和细菌感染的可能性。其次，这些组份是生理型的，因而在哺乳动物存在最终消除混合物组分的代谢途径。再者，没有引入任何非生理性的分子。在图中
图1，为成年大鼠肺核型的对照Ⅰ和Ⅱ的压力一体积曲线，图2，为成年大鼠肺核型中显示例1和2有效的压力-体积曲线。
合成的肺表面活性剂，包括一个多肽和脂的复合物，其中多肽通式为式1
其中X为氢、一个C1～5烷基或C2～10酰基;
Y和Y′各独立地代表一个键或-(Ser)n-其中n为从1到3的整数;
Q为一羟基，氨基，烷基氨基或烷氧基;
Z为一含8到25个氢基酸的多肽残基，它由下列序列
-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A1’-A2’-A3’-A4’-A5’-A6’-A7’-A8’-A9’-A10’-A11’-A1”-A2”-A3”-A4”-A5”-A6”-A7”-A8”-A9”-A10”-A11”-A1”’-A2”’-的低聚物的碎片组成，它们可以从A1～A11代表的氨基酸中任何一个氨基酸残基开始，其中A1，A1′，A1″，A1″′，A4，A4′，A4″，A8，A8′，和A8″各为独自由亲水性氨基酸中选出的基因，包括谷氨酸，天冬氨酸、丙氨酸、谷酰胺，天冬酰胺，甘氨酸，丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸和同型精氨酸;
A2，A2′，A2″，A2″′，A3，A3′，A3″，A6，A6′，A6″，A7，A7′，A7″，A10，A10′和A10″各为独立从亲脂性氨基酸中选出的氨基酸残基，包括壳氨酸，新亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，新缬氨酸，异亮氨酸和酪氨酸;
A5，A5′，A5″，A11，A11′和A11″多为独自从Lys，Ora，Arg，hArg中选出的碱性氨基酸;
A9，A9′，A9″各为由亲脂性的中性或碱性氨基酸中选出的残基，包括Leu，NLe，Met，Ala，Val，Phe，Nva，Ile，Tyr，Thr，Ser，Gln，Asn，Gly，Lys，hArg，Trp，Orn，Trp(For)，或其适于药用的盐，其中的脂包括一种或多种与天然肺表面活性剂有关类型的脂。
这些多肽-脂复合物及其药用组合物可有效地用于治疗哺乳动物呼吸系统窘迫综合症。
本专利说明书中使用的天然存在的氨基酸的缩写如下Ala或A-丙氨酸
Val或V-缬氨酸Leu或L-亮氨酸Ile或I-异亮氨酸Phe或F-苯丙氨酸Trp或W-色氨酸Met或M-旦氨酸Ser或S-丝氨酸Tyr或Y-酪氨酸Asp或D-天冬氨酸Glu或E-谷氨酸Lys或K-赖氨酸Arg或R-精氨酸Nle-新亮氨酸Orn-鸟氨酸hArg-同型精氨酸Nva-新缬氨酸TrP(For)-N-甲酰基-色氨酸除甘氨酸以外天然存在的氨基酸均有一手性碳原子，除非特别指明，这里所指的光学活性的氨基酸为L-构型的。作为惯侧，这里书写多肽结构式时，氨基端写在右边，羧基端写在右边。
式Ⅰ中的某些多肽宜用于治疗本发明中的呼吸系统窘迫综合症。式Ⅰ的这些多肽中，A1，A1′，A1″和A1″′至少有一个为Glu;A4，A4′，和A4″中至少有一个为Glu;A8，A8′和A8″中至少有一个为Glu，这样的多肽较好。式Ⅰ中的另外一些多肽中，A2，A2′，A2″和A2″′中至少一个为Leu;A3，A3′，和A3″至少有一个为Leu;A6，A6′和A6″中至少有一个为Leu;A7，A7′和A7″中至少有一个为Leu;A10，A10′和A10″至少有一个为Leu的多肽较好。另外一些优选的多肽其在式Ⅰ中，A5，A5′和A5″至少有一个为Lys;A9，A9′和A9″至少有一个为Phe;A11，A11′和A11″至少有一个为Lys。另外，申请者认为式Ⅰ中较好的多肽为其中的Q为一氨基。
本发明中的多肽可用文献上已知的很多种方法制得，这些方法包括固相序列法和片段合成，基因克隆以及这些方法的合并应用。固相序列法可采用已有的自动方法，如应用ABI多肽合成仪。在这一方法中，将α-氨基保护)的氨基酸联到树脂上去，树脂可采用文献上通常用于固相合成的树脂，优选的是用0.5%～约3%的二乙稀基苯交联的聚苯乙稀，其中的二乙稀基苯被氯甲基化或羟甲基化来提供与开始引入的α-氨基保护的氨基酸成酯的部位。
羟甲基树脂的一个例子见BodansgRy等人，Chem.lud.(伦敦)，38卷，1597～98页，1966年，中所述。氯甲基树脂可从Bio Rad实验室，Richmand，加利福尼亚洲，购到，对这一树脂制法的描述见Stewart等人，《固相多肽合成》，(Freeman及CO出版公司，旧金山，1969年)，第1章，1～6页，将保护的氨基酸联到树脂上的方法，见Gisin，
elv Chem.Acta，56卷，1476页，1973年。很多带有保护氨基酸的树脂也可以买到。作为例子，为制备一个本发明中羟基端为Thr残基的多肽，可采用联有一个叔丁氧羟基(BOC)保护的Thr的苄基化和羟甲基化的苯基乙酰胺基甲基(PAM)树脂，它可以以商品形式买到。
将α-氨基保护的氨基酸联到树脂上后，用适当的方法如用三氟乙酸在二氯甲烷中，单独使用三氟乙酸，或在二氧六环中用Hcl除去保护基。脱保护在0℃和室温之间进行。也可采用用于除去特定α-氨基保护基的标准试剂和条件。除去α-氨基的保护基后，将其它氨基保护的氨基酸按所需顺序进行偶联。另外，在与树脂上的氨基酸序列相联之前，也可先用液相法将几个氨基酸偶联成肽段。
保护氨基酸的α-氨基可采用文献已知的任何保护基，这些保护基有(1)酰基保护基，如甲酰基，三氟乙酰基，苯二甲酰基，甲苯磺酰基(tosyl)，苯磺酰基，硝基苯基亚磺酰基，三苯甲基亚磺酰基，邻硝基苯氧乙酰基和γ-氯代丁酰基;(2)芳香氨酯基型保护基，如苄氧羰基和取代的苄氧羰基如对氯苄氧羰基，对硝基苄氧羰基，对溴苄氧羰基，对甲氧基苄氧羰基，1-(对-联苯基)-1-甲基乙氧羰基，α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基和二苯甲基氧羰基;(3)脂肪族氨酯基型保护基，如叔丁氧羰基(BOC)，二异丙基甲氧羰基，异丙氧羰基，乙氧羰基和稀丙氧羰基;(4)环烷基氨酯型保护基，如环戊烷基氧羰基，金刚烷基氧羰基和环己基氧羰基;(5)，硫代氨酯型保护基，如苯基硫羰基;(6)，烷基型保护基，如三苯甲基(trityl)和苄基;(7)三烷基硅烷基，如三甲基硅烷，优选的α-氨基保护基为叔丁氧羰基。
按照文献上的方法，选择一个合适的缩合试剂。当所要上的氨基酸为Gln，Asp或Arg时，一个特别合适的缩合试剂为N，N′-二异丙碳二亚胺和1-羟基苯骈三唑、这些试剂的应用阻止了腈和内酰胺的形成。其它的缩合试剂为(1)碳二亚胺类(如，N，N′-二环己基碳二亚胺和N-乙基-N′-(γ-二甲基氨基丙基碳二亚胺);(2)氰酰胺(如，N，N′-二苯基氰酰胺);(3)乙稀酮亚胺;(4)异噁唑盐类(如，N-乙基-5-苯基异噁唑-3′-磺酸盐;(5)芳香性的含1～4个氮原子的单环含氮杂环酰胺，如咪唑酰胺，吡唑酰胺和1，2，4-三唑酰胺，有用的一些杂环酰胺为N，N′-羰基二咪唑和N，N′-羰基-二-1，2，4-三唑;(6)烷氧基化的乙炔(如乙氧基乙炔);(7)，与氨基酸的羧基形成混合酸酐的试剂，(如乙基氯代甲酸酯和异丁基氯代甲酸酯)或形成待缩合的氨基酸的对称酸酐(如(Boc-Arg)2-O)的试剂;(8)，环上氮原子连有一个羟基的含氮杂环衍生物(如N-羟基邻苯二甲酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺和1-羟基-苯骈三唑)。其他的活化试剂及其在肽合成中的应用见Kapoor，J.Pharm Sci，59卷，1～27页，1970年，申请者偏重于使用对称酸酐为缩合剂。
各个保护的氨基酸或肽段与树脂相连时，一般均过量4倍，缩合反应可在二甲基甲酰胺二氯甲烷(1∶1)或单用二甲基甲酰胺，或单用二氯甲烷(较好)中进行。当缩合反应进行得不完全时，在去除保护基前必须重复缩合步骤，这样才可将下一个氨基酸连到树脂上。合成中的任何一个阶段均用茚三酮反应来检测，见E.Kaiser等人，Analyt.Biochem，34，595(1970)。
当得到所需的氨基酸序列时，将多肽从树脂上切下来，这可由甲醇解反应来完成，如用二甲硫醚，对甲苯酚和硫代甲苯酚在稀氢氟酸水溶液中处理连有多肽的树脂而完成。
象文献中揭示的，固相太合成法中，很多氨基酸的侧链功能基需要保护，文献中也提到了保护基的选择和使用，它取决于待保护的氨基酸和多肽上其它已保护的氨基酸残基的存在。侧链保护基选择的关键之处就是在断裂α-氨基保护基时这一保护基不被去除。例如，适于保护赖氨酸的侧链保护基为苄氧羰基和取代的苄氧羰基，这里的取代基为卤素(如氯、溴、氟)或硝基(如2-氯苄氧羰基，对硝基苄氧羰基，3，4-二氯苄氧羰基)，对甲苯磺酰基，叔戊氧羰基，3，4-二氯苄氧羰基和二异丙甲氧羰基，苏氨酸、和丝氨酸的醇羟基可用乙酰基，苯甲酰基，叔丁基，三苯甲基，苄基，2，6-二氯苄基或苄氧羰基保护。优选的保护基为苄基。
这些保护基用文献中已知的方法来去除。一般来讲，保护基在肽链合成完成后去除，但是，它们可以在任何合适的时候被去除。
式1中的多肽与任何无毒的有机或无机酸形成适于药用的盐。典型的无机盐包括盐酸，氢溴酸，硫酸和磷酸以及酸式金属盐如磷酸氢二钠和硫酸氢钾。典型的有机酸有单、双和三羟基羧酸，代表各为乙酸，甘油酸，乳酸，丙酮酸，丙二酸，琥珀酸、戊二酸，富马酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，马来酸，羟基马来酸，苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸，2-苯氧基苯甲酸和磺酸如甲磺酸和2-羟基乙磺酸。
羟基端氨基酸的盐包括任何无毒的与适当的无机或有机碱形成的羧酸盐，这些盐包括碱金属盐，如钠盐和钾盐;碱土金属盐，如钙盐和镁盐;ⅢA族轻金属盐如铝盐;以及有机伯、仲、叔胺，如三烷基胺，有三乙胺，普鲁卡因，二苄基胺，1-乙稀胺，N，N′-二苄基乙稀二胺，二氢枞胺，N-(低级)烷基派啶和任何其它适当的胺。
本发明中的旦白一磷脂复合物中的磷脂可为任何磷脂，这里包括磷酰甘油酯和神经鞘脂类。磷酰甘油酯为甘油的二脂肪酸酯，其中保留一个端基羟基与磷酸形成酯。磷酰甘油酯的磷酸部分通常与一个醇如乙醇胺，丝氨酸，胆碱或甘油形成第二个酯。神经鞘脂类为神经鞘氨醇或二氢神经鞘氨醇的单脂肪酸酯，其中1位的羟基与胆碱磷酸酯形成一个酯。本发明的旦白-磷脂复合物中优选的脂为二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)，含有不同长度和饱和度的酰基链的磷脂酰胆碱(PC)，心磷脂(CL)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰丝氨酸(PS)，脂肪酸(FA)，和三酰基甘油(TG)，DPPC为肺表面活性混合物的主要成分，而PC，CL，PG，FA和TG只占一小部分。本发明中用于磷脂的适当的脂肪酸为长链脂肪酸(通常含碳原子为8或更多)，一般无支链。脂肪酸可为饱和或不饱和的。脂肪酸的典型代表为月桂酸，肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸。
本发明中旦白质-磷脂复合物的药用制剂可制成干的混合物或水性悬浮液，在一些情况下含有少量的有机溶剂，如乙醇或三氟乙醇，去污粉，如十二烷基磺酸钠或去氧胆酸钠盐，盐类，如氯化钙或氯化钠，碳水化合物，如葡萄糖，右旋糖或麦芽糖以及氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸。当制成液体制剂时，可加入稳定剂，防腐剂，渗透压调节剂，缓冲剂和悬浮剂。根据需要，可加入适当的杀菌剂。水性悬浮剂的PH可在2～10之间，可用酸和碱，如盐酸，磷酸钠或氢氧化钠来调节。干燥的混合物可以再制成含有适于药用的盐、有机溶剂和去污剂的水性溶液。水性制剂在使用前可通过渗析，过滤或层析将悬浮溶剂换为适于药用的溶剂。制剂可以以干燥粉末，水性悬浮剂或气雾剂的形式直接施于呼吸窘迫患者的肺上。本发明中的药用组和物可在气密性的容器如小瓶和安瓿中无菌贮存。它们可于小瓶式安瓿中单独贮存，使用前将其于单独贮存的悬浮缓冲液混合。
脂类占肺表面活性剂制剂的50～99.9%，适当的脂为DPPC，PC，CL，PG，PS，FA和TG.DPPC为主要成分，占全脂重的60～100%，其他脂的浓度很低，PC，CL，PG和PS占脂重量的比例可达30%;FA和TG占全脂重的比例可达10%，这些次要脂中的脂肪酰基的链可为任意长度，饱和或不饱和。优选的脂肪链是12～16碳原子，2个不饱和键。优选的脂组成为85～100%DPPC和0～15%PG。
合成肺表面活性剂中的脂组分通常见于哺乳动物肺表面活性物质中，也可从工业来源中以高纯度的形式得到。多太组分是用文献中类似的方法采用固相合成而得到的。类似于本发明中的氨基酸序列曾用于血浆阿朴脂旦白脂结合区域的核型，从未用于合成肺表面活性剂的制剂。本发明中的脂与由哺乳动物灌洗液分离得到的旦白质组成的混合物可有效地治疗新生儿RDS。
但是，这类脂和合成肽混合物作为肺表面活性剂制剂还未见报道。
脂类混合于挥发性溶剂或混合溶剂中，如氯仿和甲醇混合物。有机溶剂在氮气，氩气或真空下蒸除。可以含有有机和无机酸，碱，和盐，和糖和葡萄糖的水溶液加入至此干的脂类混合物中，得到每毫升DPPC的浓度为0.1至100毫克。一般来说最好但并非必须把混合物加热至25～50℃，剧烈混合，并且在25-50℃下孵育2小时。然后，肽或肽混合物以干粉或有些情况下悬浮于含象乙醇或三氟乙醇，或一象盐酸胍或脲变性剂的水溶液加至脂混合物中，所加有机溶剂或变性剂用于增加肽在水溶液中的溶解度。特定的PH值能增强肽与脂的结合，因此水溶液的PH值可在2至10间变化。较好的混合方式是在水中于45-50℃下用超声波混合器混合30-90分钟，然后冷冻干燥并在-20℃保存。
在DPPC浓度为1至100毫克DPPC/毫升的水，一缓冲水溶液或一盐水溶液中，脂与一合适洗涤剂，如辛基葡糖苷或去氧胆酸钠以重量比为1比1至20混合。然后，肽以干粉或悬浮于含或不含有机溶剂，变性剂，或洗涤剂的水溶液的形式加入。混合物通过渗折、过滤，离心或层折的方法去除洗涤剂。
另外，肽和脂于含或不含少量水的挥发性有机溶剂中混合。挥发性溶剂在氮气流或氩气流，或真空炉，或用旋转蒸发，于加入水溶液前或后蒸除。然后混合物通过渗折，过滤或层折的方法把水性介质换成药用合适的介质，虽然此并非必需。在有些情况下，通过超离心，过滤，或层折方法把未反应的肽和脂从结合的肽与脂中分开会提高效率。然后混合物可以冷冻干燥或汽溶化。
本发明的多肽-磷脂复合物可用于治疗新生儿的呼吸不适综合症，这是由于未发育全婴儿的肺不能产生肺表面活性剂而产生的生理状态。作为肺表面活性剂，本发明的复合物在用于RDS病人时，或者代替天然的，缺失的表面活性剂或增加缺少的天然表面活性剂。治疗持续至婴儿的肺能产生足够的天然肺表面活性剂以至不必要进一步治疗时为止。
制剂最好是能用于气管的，即悬浮液体，干粉，或气雾剂。作为悬浮液，干的混合物或悬浮液的混合物与合适的试剂混合，如水，盐水溶液，葡萄糖，和甘油，以得到一有效的药用组成。较好的悬浮液含重量0.8-1.0%的氯化钠和1-20mM的钙离子。制剂过滤消毒。一般，制剂每毫升含DPPC1至100毫克，并以0.2至5毫升/公斤的剂量给药。水悬浮液冷冻干燥得干的混合物。研细的干粉悬浮于象低级烷和如氟里昂的氟化烷烃里制得气雾剂。气雾剂存于加压的容器中。
此表面活性剂以合适的剂量形式，通过气管，通过气雾剂，或通过悬浮液或干粉雾化至呼吸气中给药。此表面活性剂以单剂量或复剂量10至200毫克/公斤给药。较好的给药方法是把肽和脂以5-10毫克/每毫升生理盐水的浓度通过气管给药，达到50-100毫克/公斤的剂量。
实施例1H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-OH肽1的DPPC复合物的制备固相法合成肽1。含DPPC(25毫克)的1毫升氯仿在氮气流下蒸发干并冷冻干燥去除痕量的有机溶剂。往此干的脂混合物中加入3毫升水，然后于45℃下孵育1小时。然后往此液体制剂中加入0.5毫克肽Ⅰ。在45℃下此制剂于超声混合器中混合2小时。所得脂-肽混合物冷冻干燥并于4℃下保存长至1个月。试验前加入9毫升含0.9%Nacl，20mMHEPES缓冲液(PH为7.4)。此制剂在间歇混合，45℃下孵育1小时。此制剂呈半透明白色外观，比只有DPPC略清。
实施例2Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-leu-Lys-Glu-Leu-LeuNH2(肽2)的DPPC复合物的制备固相法合成肽2。除最终悬浮缓冲液(PH为7.40)除含0.9%Nacl，20mM HEPES外，还含5mMCacl2外，肽2与DPPC的混合同实施例1。
实施例3Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2(肽3)的DPPC复合物的制备以类似地方式，制备肽3并与DPPC形成复合物。
类似地但混合重量25份DUPG与75份DPPC得肽2的DUPG/DPPC复合物。
实施例4Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2(肽4)的DPPC复合物的制备类似的方式，制备肽4并与DPPC形成复合物。
实施例5Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH2类似的方式，制备肽5并与DPPC形成复合物。
实施例6Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NH2类似的方式，制备肽6并与DPPC形成复方物。
实施例7Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NH2类似的方式，制备肽7并与DPPC形成复合物。
实施例8Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2类似的方式，制备肽8并与DPPC形成复合物。
实施例9Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH2类似的方式制备肽9并与DPPC形成复合物实施例10
类似的方式，制备肽10并与DPPC形成复合物。
实施例11肽1和2的肺表面活性剂评价。
合成表面活性剂制剂在成年鼠肺模型上试验(Ikegamietal，(1979)Pediatr.Res.13，777-780)。参照Ⅰ和Ⅱ分别单用DPPC和狗肺表面活性剂作为参照标准。实施例1和2的制剂各3毫升在成年鼠肺模型上试验。实施例1和2的制剂几乎全部恢复了鼠肺的活动性。结果见图1和2。参照1。参照Ⅰ的制备如下。DPPC购于AvantPolarLipids。溶有25毫克DPPC的氯仿先在氮气流中蒸发干然后冷冻干燥去除痕量的有机溶剂，往干的脂混合物中加入3毫升水。制剂于45℃孵育1小时并同时用超声混合器混合1小时。此脂冷冻干燥，在4℃下保存长至1周并与9毫升含0.9%Nacl，20mMHEPES缓冲液(PH为7.4)混合。在孵育1小时同时周期性混合后参照Ⅰ在成年鼠肺模型上试验(图1a)。参照1无增强鼠肺的活动性作用并且作为一肺表面活性剂是无效果的。
参照Ⅱ，参照Ⅱ的制备如下。狗肺表面活性剂按文献制备。参照Ⅱ在压力5厘米水柱的情况下恢复肺活量＞75%完全足够的鼠肺。
权利要求
1.一个结构式为的多肽；其中X为氢，一个氨基酸，二肽，或三肽，或含1至10个碳原子的脂肪，芳香，或环有机酸Y和Y′为互不相关的一个键或n为1至3的整数时的一(Ser)n-Q为一羟基氨基，烷基氨基或烷氧基Z为一含8-25个氨基酸的肽，由下列序列的低聚物的一个片段组成-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A1’-A2’-A3’-A4’-A5’-A6’-A7’-A8’-A9’-A10’-A11’-A1”-A2”-A3”-A4”-A5”-A6”-A7”-A8”A9”-A10”-A11”-A1”-A2’”-并且可以从A1-A11的任何一个氨基酸残基开始，其中A1，A1′，A1″，A1′″，A4，A4′，A4″，A8，A8′和A8″选于由Glu，Asp，Ala，Gln，Asn，Gly，Ser，Thr，Lys，Arg，Orn和hArg组成的亲水氨基酸组A2，A2′，A2″，A2′″，A3，A3′，A3″，A6，A6′，A6″，A7，A7′，A7″，A10，A10′，和A10″选于由Leu，Nle，Met，Ala，Val，Phe，Nva和Tyr组成的亲脂性氨基酸组；A5，A5′，A5″，A11和A11′A11″选于Lys，Orn，Arg，hArg组成的碱性氨基酸组；A9，A9′，A9″选于Leu，Nle，Met，Ala，Val，phe，Nva，Ile，Tyr，Thr，Ser，Gln，Asn，Gly，Lys，Arg，hArg，Trp，Orn，Trp(For)组成的亲脂的中性或碱性氨基酸组或其适于药用的盐，但附有一先决条件，Z不能是-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Glu-Lys-Val-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Phe-；-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-lys-Glu-Ala-Phe；-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Na-Phe-；Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Ser-Lys-Val-Ala-Glu-Ala-Leu-Lys-Ala-Phe-。
2.权利要求1中的一个肽，其中A1，A1，A1″或A1″′中至少有一个为Glu。
3.权利要求1中的一个肽，其中A4，A4′，或A4″中至少有一个为Glu。
4.权利要求1中的一个肽，其中A8，A8′，或A8″中至少有一个是Glu。
5.权利要求1中的一个肽，其中A2，A2′，A2″，或A2″′中至少有一个是Leu。
6.权利要求1中的一个肽，其中A8，A3′，或A3″中至少有一个是Leu。
7.权利要求1中的一个肽，其中A6，A6′，或A6″中至少有一个是Leu。
8.权利要求1中的一个肽，其中A7，A7′，或A7″中至少有一个是Leu。
9.权利要求1中的一个肽，其中A10，A10′，或A10″中至少有一个是Leu。
10.权利要求1中的一个肽，其中A5，A5′或A5″中至少有一个是Lys。
11.权利要求1中的一个肽，其中A9，A9′，或A9″中至少有一个是Ala。
12.权利要求1中的一个肽，其中A11，A11′，或A11″中至少有一个是Lys。
13.权利要求1-12中的一个肽，其中Q为氨基。
14.权利要求1中的一个肽，序列为H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-OH.
15.权利要求1中的一个肽，序列为Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
16.权利要求1中的一个肽，序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
17.权利要求1中的一个肽，序列为Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
18.权利要求1中的一个肽，序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH2.
19.权利要求1中的一个肽，序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NH2.
20.权利要求1中的一个肽，序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NH2.
21.权利要求1中的一个肽，序列为Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
22.权利要求1中的一个肽，序列为Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH2.
23.权利要求1中的一个肽，序列为H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp(For)-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-OH.
24.一个结构式为的多肽;其中X为氢，一个氨基酸，二肽，或三肽，或含1至10个碳原子的脂肪，芳香，或环有机酸;Y和Y′为互不相关的一个键或n为1至3的整数时的-(Sern)n-Q为一羟基氨基，烷基氨基或烷氧基Z为一含8-25个氨基酸的肽，由下列序列的低聚物的一个片段组成-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A1’-A2’-A3’-A4’-A5’-A6’-A7’-A8’-A9’-A10’-A11’-A1”-A2”-A3”-A4”-A5”-A6”-A7”-A8”-A9”-A10”-A11”-A1”’-A2”’-并且可以从A1-A11的任何一个氨基酸残基开始，其中A1，A1′，A1″，A1″″，A4，A4′，A4″，A8，A8′，和A8″选于由Glu，Asp，Ala，Gln，Asn，Gly，Ser，Thr，Lys，Arg，Orn和hArg组成的亲水氨基酸组;A2，A2′，A2″，A2″′，A3，A3′，A3″，A6，A6′，A6″，A7，A7′，A7″，A10，A10′和A10″选于由Leu，Nle，Met，Ala，Val，Phe，Nva和Thr组成的亲脂性氨基酸组;A5，A5′，A5″，A11，A11′和A11″选于Lys，Orn，Arg，hArg组成的碱性氨基酸组;A9，A9′，A9″选于Leu，Nle，Met，Ala，Val，Phe，Nva，Ile，Tyr，Thr，Ser，Gln，Asn，Gly，Lys，Arg，hArg，Trp，Orn，Trp(For)组成的亲脂的中性或碱性氨基酸组;或其适于药用的盐，与选于DPPC，PC，CL，PG，PS，FA，和TG的脂或脂混合物形成的复合物。
25.权利要求24中的一个复合物，其中DPPC为脂的主要成份。
26.权利要求24中的一个复合物，其中脂为DPPC和PG的混合物。
27.权利要求24中的一个复合物，其中脂含85-100%的DPPC和0-15的PG。
28.权利要求24至27中的一个复合物，其中多肽序列为H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-NH2.
29.权利要求24至27中的一个复合物，其中肽序列为Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
30.权利要求24-27中的一个复合物，其中肽序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
31.权利要求24至27中的一个复合物，其中肽序列为Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
32.权利要求24至27中的一个复合物，其中肽序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH2.
33.权利要求24至27中的一个复合物，其中肽序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NH2.
34.权利要求24至27中的一个复合物，其中肽序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NH2.
35.权利要求24至27中的一个复合物，其中肽序列为Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
36.权利要求24至27中的一个复合物，其中肽序列为Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH2.
37.权利要求24至27中的一个复合物，其中肽序列为H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp(For)-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-OH.
38.一个治疗呼吸不适综合症的方法，通过给患者一有效剂量的复合物，此复合物为由一个结构式为的多肽;其中X为氢，一个氨基酸，二肽，或三肽，或含1至10个碳原子的脂肪，芳香，或环有机酸;Y和Y′为互不相关的一个键或n为1至3的整数时的-(Ser)n-Q为一羟基氨基，烷基氨基或烷氧基;Z为一含8-25个氨基酸的肽，由下列序列的低聚物的一个片段组成-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A1’-A2’-A3’-A4’-A5’-A6’-A7’-A8’-A9’-A10’-A11’-A1”-A2”-A3”-A4”-A5”-A6”-A7”-A8”-A9”-A10”-A11”-A1”’-A2”’-并且可以从A1-A11的任何一个氨基酸残基开始，其中A1，A1′，A1″，A1″′，A4，A4′，A4″，A8，A8′和A8″选于由Glu，Asp，Ala，Gln，Asn，Gly，Ser，Thr，Lys，Arg，Orn和hArg组成的亲水氨基酸组;A2，A2′，A2″，A2″′，A3，A3′，A3″，A6，A6′，A6″，A7，A7′，A7″，A10，A10′和A10″选于由Leu，Nle，Mlt，Ala，Val，Phe，Nva和Tyr组成的亲脂性氨基酸组;A5，A5′，A5″，A11，A11′和A11″选于Lys，Orn，Arg，hArg组成的碱性氨基酸组;A9，A9′，A9″选于Leu，Nle，Met，Ala，Val，Pys，Frg，hArg，Trp，Orn，Trp(For)组成的亲脂的中性或碱性氨基酸组Val，Phe，Nva，Ile，Tyr，Thr，Ser，Gln，Asn，Gly，lys，Arg，hArg，Trp，Orn，Trp(For)组成的亲脂的中性或碱性氨基酸组;或其适于药用的盐和选自DPPC，PC，CL，PG，PS，FA和TG的脂质或脂质混合物。
39.权利要求38中的一个方法，其中DPPC是脂中的主要成份。
40.权利要求38中的一个方法，其中脂是DPPC和PG的混合物。
41.权利要求38中的一个方法，其中脂为85-100%的DPPC和0-15%的PG组成。
42.权利要求38至41中的一个方法，其中肽的序列为H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-NH2.
43.权利要求38至41中的一个方法，其中肽的序列为Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
44.权利要求38至41中的一个方法，其中肽的序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
45.权利要求38至41中的一个方法，其中肽的序列为Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
46.权利要求38至41中的一个方法，其中肽的序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH2.
47.权利要求38至41中的一个方法，其中肽的序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NH2.
48.权利要求38至41中的一个方法，其中肽的序列为Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NH2.
49.权利要求38至41中的一个方法，其中肽的序列为Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
50.权利要求38至41中的一个方法，其中肽的序列为Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH2.
全文摘要
本发明制备并在动物衰竭肺模型上评价了由具α螺旋结构的一个多肽和一个或多个脂组成的合成肺表面活性剂及天然肺表面活性剂。
文档编号C07K14/00GK1039029SQ8910447
公开日1990年1月24日 申请日期1989年7月1日 优先权日1988年7月1日
发明者拉里·R·麦克列恩, 约翰·L·克拉坦安斯基 申请人:默里尔多药物公司