专利名称：杀虫有效肽类的制作方法
技术领域：
本发明涉及杀虫有效肽类，特别是涉及可从隅蛛属(Tegenaria)蜘蛛毒液中分离出来的杀虫有效肽类，编码该杀虫有效肽类的DNA，以及控制无脊椎有害生物的方法。
近年来，公众开始敏锐地意识到伴随合成杀虫剂的使用而产生的环境公害和对哺乳动物的毒性。结果使这些杀虫剂的使用锐降。然而，对昆虫有效控制的需求并未改变，这促使研究者们开发控制昆虫的新方法。
最广泛使用的微生物杀虫剂得自云苏金杆菌(Bacillusthuringiensis，下文简称B.t.)。这种细菌剂用于控制食叶蝎、日本甲虫和蚊子。1989年1月10日授予karamata等的美国专利No.4，797，279揭示了含有编码B.t.kurstakiδ-内毒素的基因和编码B.t.tenebrionisδ-内毒素的基因的杂交细菌细胞及其制剂。B.t.杂交体对于对B.t.kurstaki株敏感的有害生物和对B.ttenebrionis株敏感的有害生物均有效。一般从杀虫活性水平或从活性谱上或从上述二方面来看，这些杂合体具有优于其亲本株物理混合物上所观察到的有用的杀虫性质。包含这样的微生物的杀虫组合物可通过将此杂交体以杀虫有效量施用于昆虫或其周围环境而用来抗这些昆虫。
在授予Gilroy和Wilcox的欧洲专利申请，公布号No.0325400Al中揭示了从B.t菌中得到的另一分离物，该发明涉及对鳞翅目昆虫有毒的杂交毒素基因。该发明特别是包括含部分B.t.var.kurstakiHD-73毒素基因和得自B.t.var.kurstaki株HD-1的部分毒素基因的δ-内毒素基因的杂交体，揭示了编码对鳞翅目昆虫有活性的蛋白质的杂交毒素基因(DNA)。
授予wilcox等欧洲专利申请，公开号No.0340948，也利用了细菌B.t.的杀虫性质。该发明涉及以如下方法制备的杂交杀虫毒素将昆虫肠上皮细胞B.t.基因识别区与白喉毒素B链融合，以制备对鳞翅目昆虫有活性的杂交B.t.毒素。该发明提出可将杂交B.t.基因插入植物或克隆到杆状病毒中以产生可复原的毒素。或者，含杂交B.t.基因的宿主可通过直接施用于靶昆虫的环境中而用作杀虫剂。
在杀虫化合物的研究中，蝎毒被鉴定为提供杀虫性的化合物的可能来源。Zlotkin等在“AnExcitatoryandaDepressantInsectToxinfromScorpionVenombothAffectsodiumConductanceandPossessaCommonBindingSite”，ArchBiochemandBiophysics，240∶877-87(1985)中揭示了从蝎Leirusquinquestriatusquinques-triatus的毒液中分离到的两种昆虫选择性毒素。在关于它们的化学和药理学性质的研究中，揭示了一种毒素引起蝇幼虫快速兴奋性收缩的麻痹，另一种引起慢速抑制性松弛的麻痹，两种均影响钠电导。
1990年6月19日授予Zlotkin等的加拿大专利2，005，6585揭示了一种得自蝎Leirusquinquestriatushebraeousbuthinae，Buthidae的杀虫有效蛋白质。在该发明中，毒液被冷冻干燥，分离成几部分。将对幼虫具有最高毒性，对小鼠毒性最低的部分作进一步提纯，终产物是称作“LqhP35”的物质。
相应于涉及各种具有杀虫性质组合物的研究开发，研究者们致力于发展制备杀虫基因并将它们引入所要保护的靶中的方法。1989年11月7日授予Smith和Summers的美国专利No.4，879，236涉及将连接于杆状病毒启动子的选择的基因插入杆状病毒基因组以制备能在昆虫细胞表达所选基因的重组杆状病毒表达载体的方法。该方法涉及分割杆状病毒DNA以制备含多面体(polyhedrin)基因或其部分的DNA片断，该基因或其部分包括一多面体启动子。为制备重组转移载体，将此DNA片断插入克隆载体，然后将一选择的基因插入这一经修饰的克隆载体，以至于将其置于多面体启动子的控制之下。然后将重组转移载体在昆虫细胞中与杆状病毒DNA接触，以导致选择的基因重组并插入杆状病毒基因组。杆状病毒Autogrphacalifornica(AcMNPV)及其有关的多面体启动子被发现在制备能在昆虫宿主细胞中极高水平地表达所选基因的病毒表达载体上是有用的。
发明者们提出，该表达载体可用于通过如下方式控制昆虫的系统选择一种基因，该基因产生对特殊昆虫或昆虫谱有毒的蛋白质，并将该基因克隆到AcMNPV表达载体上。他们提出，该载体可施用于受保护的植物或动物。重组病毒在被昆虫摄取后可侵入肠壁细胞并开始复制。
Cutler，“ElectroporationBeingDevelopedtoTransformCropsSuccesswithModelCropConfirmed”，AGBiotech.Newsvol.7(5)3&17(1990)公开了制备杀虫基因并将其导入受保护的靶中的进一步的方法。该文提出可将DNA直接电导(electroporate)入萌芽花粉，将花粉放回到花上以形成种子，种子再长成已转化植株。此方法被成功地应用于烟草植物，也可被成功地应用于玉米和苜蓿。此方法可能比原生质体的电导入容易，因为最终目的是给花传粉，“使花发挥作用”，而不是再生植株。该方法包括收集花粉、使其在萌芽介质中萌芽30-60分钟，此后花粉管从花粉粒中长出，将所需的DNA加到含花粉的液体悬浮液中，加以电击以打开花粉的孔，洗去多余的DNA，将改变了的花粉放在植物柱头下，等到种子形成。这可能是将任何基因移入作物植株的一个简便方法。
在1989年8月29日授予Barnes和Edwards的美国专利No.4，861，595上公开了另一转移系统。该发明涉及使用经处理的本质上完整的微生物细胞作为蛋白质化合物转移到动物和人的转移系统。微生物细胞先经同源基因在胞内产生一蛋白质。在细胞是基本完整的条件下用化学或物理方法处理产生蛋白质的微生物，该处理过程的控制，产生了胞内化合物活性无明显丢失的非增殖性处理细胞，由于细胞未增殖，故具有稳定的细胞壁，该壁然后可由人或动物的消化系统的期望区域破碎、这使主体发明能定时、定向地释放可形成囊状的产物。在适当的处理后，产生蛋白质的微生物细胞本身可被用作转移系统，因此不需对产生的化合物加以提纯。可用微生物方法制备的任何蛋白质、多肽、氨基酸或包括杀虫剂在内的化合物可成为本发明的起始物质。
Carbonell，etal.，“Synthesisofagenecodingforaninsect-specificscorpionneurotoxinandattemptstoexpressitusingbac-ulovirusvectors，”Gene73409-18(1988)揭示了用DNA技术插入合成基因的可能性，该基因编码在蝎毒液中发现的神经毒素。该文提出可用DNA技术将编码蝎Buthuseupeus的毒液中发现的神经毒素的合成基因插入杆状病毒基因，以改进杆状病毒杀虫剂，研究了用载有多面体启动子的AcMNPV表达系统来进行毒素制备的三种表达办法。单单36密码子基因的表达只提供很少的毒素产量。关于信号肽附着于毒素方面发现有某种成功。当毒素基因融合于多面体N-末端上时，产生显著水平的蛋白质合成，但少于多面体本身生成的10-20倍。表达的限制因素据信不在转录水平而在转录后水平，包括翻译和蛋白质稳定性上。毒素产物的麻痹活性未被检出。
研究者们还能分离从蜘蛛毒液中提取的毒素。1990年5月15日授予Jackson和Park的美国专利No.4，925，664揭示了用从蜘蛛Agelenopsisaperta和Hololenacurta得到的毒素治疗心脏和神经系疾病的方法。这些毒素还是有效的特异性钙通道或兴奋性氨基酸受体阻断剂，可用于抗昆虫和有关病虫害。
涉及分离所得的蜘蛛毒液毒素性质的另一研究揭示了从漏斗网(funnel-web)蜘蛛毒液分离到的低分子量因子可逆地结合到钙通道上的能力。1989年8月24日授予Cherksey等的WO89/07608揭示了这些活性低分子量因子，它们以足够的特异性和亲和力可逆地结合于钙通道以抑制神经元的钙电导并可分离和提纯钙通道结构。这些毒液被发现对哺乳动物是有毒的。Jackson和parks，“SpiderToxinsRecentApplicationsinNeurobiology”，AnnRevNeu-rosci12405-14(1989)中讨论了蜘蛛毒素的其他用途。该文提到不同分类群的毒素中有很大的异质性，认识到实验揭示钙通道的种属特异性及蜘蛛毒液可提供钙通道拮抗剂。所讨论的蜘蛛毒液被发现对脊椎动物有影响。该文还将蜘蛛毒液认定为作为农业用途的昆虫特异性毒素的可能来源。
Adams，etal.，“IsolationandBiologicalActivityofSynapticToxinsfromtheVenomoftheFunnelWebSpider，AgelenopsisAperta，”inInsectNeurochemistryandNeurophysiology1986，BorkovecandGelmaneds.，HumanaPress，NewJersey，1986，提出拮抗在昆虫上的突触传递的多种肽毒素已被从蜘蛛Agelenopsisaperta中分离得到。
1989年8月8日授予kyoto等的美国专利No.4，855，405公开了从Joro蜘蛛毒液腺得到的一种受体抑制剂及其制备方法。当昆虫接触到载于液体或固体中的该化合物时，该化合物具有杀虫效应。
1990年4月17日授予Nakajima等的美国专利No.4，918，107涉及具有谷氨酸受体抑制剂活性的化合物，制备该化合物的方法，含该化合物的杀虫组合物。该化合物载于加有分散剂的液体或固体载体，直接施用于受保护的植物或动物低剂量杀虫有效，对哺乳动物和鱼毒性很低，对环境不良影响小。
因而，由于与一些合成杀虫剂(包括药效差的)合并应用的问题，对于发展控制无脊椎动物的新方法有着持久的需求。
本发明提供得自诸如Tegenaria属蜘蛛的新的杀虫有效肽类。这种肽包括a)约51个氨基酸长度;b)6、22、25、32、36和45位的6个半胱氨酸;c)80%序列与以SEQIDNO∶3限定的肽同源，以及其农业上或园艺学上可接受的盐。本发明进一步提供如其中限定的基本相似的肽类及信号引导序列。
本发明还提供的是新的DNA序列，包括编码本发明的杀虫有效肽的DNA序列。
本发明还提供的是重组表达载体，包括编码本发明的杀虫有效肽的DNA序列，其中载体能影响在转化细胞中所述密码序列的表达。
本发明还提供的是含编码本发明的杀虫有效肽的DNA序列的新的转基因植物，其中所述DNA被引入所述植物的种系，或所述植物的祖先，以便所述植物通过有性繁殖或无性繁殖相继传代而使所述DNA序列的表达特征被遗传下来。
本发明还提供的是能表达编码本发明的杀虫有效肽的DNA序列的新的重组杆状病毒表达载体。
本发明还提供制备本发明的杀虫有效肽的新方法，该方法包括a)培养重组宿主细胞，其中在所述宿主细胞中被转化或转染的重组表达载体具有编码所述肽的DNA序列，其中载体能影响所述密码序列在转化细胞中的表达;
b)从重组宿主细胞培养物中回收所述杀虫有效肽。
本发明还提供的是控制无脊椎系害虫的一种新方法，包括使所述害虫与有效量的本发明的肽接触。本发明还提供的是控制无脊椎系害虫的一种新方法，包括使所述害虫与能在该害虫上表达有效量的本发明杀虫有效肽的重组杆状病毒相接触。
本发明还提供的是新的杀虫组合物，包括在农业上或园艺学上可接受的载体中的杀虫有效量的本发明的肽及其农业上或园艺学上可接受的盐。
本发明还提供的是对本发明的肽实际上具有免疫反应性的新颖抗体。
本发明还提供的是从编码本发明的杀虫有效肽的DNA序列得到的新颖DNA探针。
图1NPS-326引物2相应于蜘蛛Tegenariaagrestis编码NPS-326的mRNA序列的完整DNA序列。从成熟毒素断裂开的信号序列下加有划线。框线表示在有关毒素族中转译的序列上可变的位置。
图3蜘蛛Tegenariaagrestis中相应于编码NPS-331的mRNA序列的完整DNA序列。从成熟毒素断裂开的信号序列下加有划线。框线表示在有关毒素族中转译的序列上可变的位置。
图4蜘蛛Tegenariaagrestis中相应于编码NPS-373的mRNA序列的完整DNA序列。从成熟毒素断裂开的信号序列下加有划线。框线表示在有关毒素族中转译的序列上可变的位置。
图5在以0.1%TFA(水)-0.1%TFA(CH3CN)/H2O，1∶1线性梯度洗脱的Vydac C18反相柱上Tegenaria agrestis全毒液的分离色谱。
A.定义如此处所用的，“表达载体”包括能表达包含于其中的DNA序列的载体，在载体上这样的序列可合用地连接于能导致其表达的其它序列上。虽然并不总是叙述得很明确，意思是指这些表达载体必须是既能以游离体又能以染色体DNA整合部分的形式在宿主机体内复制的。显然，可复制性的缺乏使它们不能有效地使用。简言之，“表达载体”被赋予功能性定义，任何能引起位于表达载体上的特异DNA密码表达的DNA序列，当它被用于特异的序列时，均包括在该术语中。一般来说，在重组DNA技术中实用表达载体常常是“质粒”的形式，这是指环状双链DNA，在载体形式时它们不连接在染色体上。“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体最常用的形式。然而，本发明准备包括这样一些其他形式表达载体，它们发挥同等的功能，在此后的本技术领域中被人熟知。
“重组宿主细胞”是指被用重组DNA技术构建载体所转化的细胞。
Tegenaria属蜘蛛是Agelenidae科的成员，一般称作漏斗网(funnel-web)蜘蛛。Tegenaria是一个分布广的大属;很多种生活与人类密切相关。Tegenaria的多数美国种，包括T.agrestis，被认为是从其他大陆偶然引入的(Gertsch，WillisJ.1979.AmericanSpi-ders.VanNostrandReinhold，NewYork.)。Tegenariaagrestis是一种典型的漏斗网蜘蛛，它在高的禾本科植物、或在墙缝、木堆等处织网。目前它的分布限于俄勒冈州、华盛顿和爱达荷部分地区(Roth，VincentD.1968.TheSpiderGenusTegenariaintheWesternHemisphere(Agelenidae).AmericanMuseumNovitates2323∶1-33.)，尽管有迹象表明它偶然转移到邻近州如犹他州。一些严重的人类中毒涉及T.agrestis(Vest，DarwinK.1987.NecroticarachnidisminthenorthwestUnitedStatesanditsproba-blerelationshiptoTegenariaagrestis(Walckenaer)spiders.Toxi-con25(2)∶175-184.)。但是，全部可用的资料(大部分来自NPS国际研究)表明，该毒液的杀虫成分有别于产生哺乳动物毒性的成分。
本发明杀虫有效肽类的作用机制不明。这些毒素对Heliothis，Spodoptera和Trichoplusia幼虫产生独特的一系列症状。在给予毒素或毒液和完全产生神经学症状之间有明显的延搁，有时长达24小时以上。Tegenaria毒液及从中提纯的毒素引起独特的痉挛性麻痹，其特征为连续扭曲48小时或更长时间。这些症状在“杀虫有效肽类”这部分作更完全的描述。
B.从Tegenaria毒液中分离肽类肽的一个来源是Tegenaria毒液。用任何已知的方法例如从头胸分离出毒液腺，可从Tegenaria取出蜘蛛毒液。但是，为了免除蜘蛛毒液和分得的毒素中的杂质，最好是这样获得蜘蛛毒液通过电刺激蜘蛛使毒液释放，接着吸引收集释放出来的毒液并通过回流或血淋巴(hemolymph)预防毒液污染，如U.S.4，925，664所描述的那样。
一旦用电动乳化技术获得蜘蛛毒液后，可用高效液相色谱法(HPLC)和各种分离方式如凝胶过滤、离子交换和反相色谱法等将其分离成肽(毒素)成分。
用电动乳化蜘蛛的技术，结合用反相柱和阳离子交换柱的HPLC，可以获得基本上纯的蜘蛛毒素。但是，将被意识到的是，为了分离蜘蛛毒素，在本发明的范围内也可应用其他同等有效的技术。这样分离到的毒素可被测试其杀虫活性及其用本领域技术人员已知的方法测定的氨基酸顺序。
用很多方法，如注射、局部施用或喂饲，可以测试分离出的肽类、杂质部分或全毒液的杀虫活性。注射是较好的方法，因为它模拟毒液的天然的进入途经，能预定剂量，当消耗比较小量物质时就产生有用的数据。在一种或一种以上主要害虫如Heliothis上的试样提供了精确的及与商业有关的杀虫活性的评估。
C.杀虫有效肽类本发明在一个方面提供了一类杀虫有效肽、其杀虫活性片断及其在农业上或园艺学上可接受的盐。
一旦如此处所描述的，从一来源分离并提纯含肽的杀虫有效部分后，就可按本领域技术人员已知的任何方法如N-末端氨基酸顺序测定并使用自动氨基酸顺序测定仪来进行氨基酸顺序测定。
从这一公开将会认识到，另外的杀虫有效蛋白质可望包括在本发明范围内，即相信该族中存在其他杀虫有效肽，可从Tegenaria及除此处详述的三种来源外的其他来源分离得到。下面提到一类杀虫有效蛋白质。这一族杀虫有效肽类的成员据信有以下特性1)大小全部在约5500至6000道尔顿之间，约50个氨基酸长度;
2)保存的氨基酸末端其前面的11个残基在NPS-326、NPS-331和NPS-373是完全相同的，且有90%以上全顺序同源;
3)均有同型半胱氨酸，很象共享同样的二硫键排列5-[Cys]-15-[Cys]-3-[CYs]-7-[Cys]-3-[Cys]-8-[Cys]-5;
4)所有的肽均是酸性的各毒素的等电点均小于5.5;
5)它们分得的cDNA顺序均编码同样的信号肽以及常被处理成酰胺基的羧基末端甘氨酸残基;但尚不清楚这是否与活性有关;
6)已知它们均在感染TBW上引起特征性的反应。当注入昆虫体内，如烟草夜蛾幼虫(Heliothisvirescens)或甜菜行军虫(Spodopteraexigua)，这些毒素产生一独特系列的症状。一个显著的方面是毒性的延迟发生。甚至当毒素或全毒液以最终产生100%死亡率的剂量加以施用，在24小时以上可不出现症状。毒性症状一旦发生，表现也是独特的。毒性最初的表示是一段时间的活动过度，特征为反复咬上颚，腿和体壁震颤。经几个小时后，逐渐为特殊类型的痉挛性或强直性麻痹所代替，其特征为持续扭曲，幼虫将其身体扭曲成螺旋形。这些痉挛症状可不间断地持续48小时以上。这明显地使昆虫死于伴随着痉挛的大量能量消耗而加剧的饥饿和失水。用这些毒素处理的甘蓝银纹夜蛾(Trichoplusiani)幼虫在较短的时间内经历同样的一系列症状;在24小时内，扭曲行为被较不明显的麻痹所代替。
更特殊的是，此处三种杀虫有效肽及其编码cDNA顺序被分离并鉴定。首先，用反相和阳离子交换色谱法分离得到NPS-326并提纯至均一性，如质谱法所测得的，其分子量为5678.55道尔顿(+/-0.37道尔顿)。部分氨基酸分析可用于插入编码NPS-326的cDNA的寡核苷酸的标记。如SeqIDNo.2中所限定的，由分离的cDNA编码的51个氨基酸的肽以羧基端甘氨酸残基为终端。在肽的这一位置的甘氨酸残基一般被加工成酰胺基(Creighton，T.E.inProteinsStructureandMolecularproperties，W.H.FreemanandCompany，NewYork.1983)。表Ⅱ给出了由分离的cDNA编码的肽的氨基酸成分。如果使C-末端酰胺化，6个编码的半胱氨酸残基用二硫键联结，由Seq.IDNo.2编码的肽的分子量会降低64.08道尔顿，至5678.85道尔顿，这与用质谱法测得的纯NPS-326的分子量相等。因此，如从蜘蛛毒液分离得到的那样，杀虫活性NPS-326经处理的形式看来如SepIDNo.3所限定的。
第二，用反相和阳离子交换色谱法分离了NPS-331并提纯至均一性，如用质谱法所测得的，其分子量为5700.39(+/-0.29道尔顿)。借助于其氨基末端序列与NPS-326同源，分离到了cDNA。编码NPS-331的cDNA序列存在于SeqIDNo.8。表Ⅲ给出了该肽的氨基酸成分。假定如NPS-326，C-末端酰胺化，半胱氨酸残基以二硫键连接，则由SeqIDNo.8编码的肽计算得到的分子量为5，699.86道尔顿。这与用质谱测定的NPS-331析分子量相等。因此，如从蜘蛛毒液中分离得到的那样，杀虫活性NPS-331经处理的形式看来如SeqIDNo.9所限定的。
借助于其氨基末端序列与NPS-326回源，分离到该族的第三个成员，它也是用反相的阳离子交换色谱法分离和提纯的。编码NPS-373的cDNA序列在SeqIDNo.12中给出，其氨基酸成分列于表Ⅳ。假定如NPS-326和NPS-331，C-末端酰胺化，半胱氨酸残基以二硫键连接，则由SeqIDNo.12编码的肽计算得到的分子量为5，642.81道尔顿。这与由质谱法测得的相等。前体分子的翻译和处理产生SeqIDNo.14限定的杀虫活性肽，这种肽即从蜘蛛毒液中提纯的肽。
本发明还提供位于这三种成熟蛋白质NPS-326、NPS-331和NPS-373之前的新的信号或引导序列。编码信号肽的cDNA列于SeqIDNo.5。据信这个唯一的信号序列可被用于这些(可能还有其他)重组蛋白质的导向、制备或合成。在确保新合成蛋白质的合适定位上，信号序列起着重要的作用。Blobel，G.，“Intracellularproteintopogenesis，”Proc.Nat.Acad.Sci.77∶1496-1500(1980)提供了区域发生信号(“topogenicsignals”)，该信号将所附的蛋白质序列导向细胞内或细胞外的各种目标，它对分泌性蛋白质尤为重要，这种蛋白质的靶部位在细胞外。该信号也有助于重组蛋白质的制备，因为比起必须溶解细胞和从完整细胞提取物提纯来说，从细胞外介质提纯表达的蛋白质更为容易。对于这儿要求保护的特殊肽类，可以推测，在确保毒素C-末端酰胺化和将毒素导向细胞内或细胞外部位以在该处加工折叠上，该信号肽可能具有实用性。据信，这一信号序列在其他高级结构的肽分子的表达和处理上同样也具有实用性。
当然，一级氨基酸序列的微小修饰可以产生与此处列举的肽类相比有实质上活性基本相等或更高的蛋白质。这些修饰可以考虑，如通过点突变和固相合成中的氨基酸置换，或可以是偶然的，如通过在宿主中的突变，该宿主产生本发明的肽。只要保持杀虫活性，所有这些修饰均包括在本发明内。由于编码蛋白质的DNA的核苷酸序列改变，蛋白质的“突变”改变其一级结构(与通常存在的或特定位置的蛋白质有关)。这些突变特别包括等位基因变异体。蛋白质一级结构的突变变化来自于缺失、加成或置换。“缺失”规定为多肽中一个或几个外加的内部氨基酸残基失去。“加成”规定为与野生型相比，多肽有一个或几个外加的内部氨基酸残基。“置换”是一个或几个氨基酸残基被其他残基置换的结果。蛋白质“片断”是由一级氨基酸序列组成的多肽，该序列与(多肽与之有关)蛋白质一级序列的部分相同。
较佳的“置换”是保守(conservative)置换，即其中一个残基被同一总类型中另一个残基置换。正如已被广为理解的，天然存在的氨基酸可亚分类为酸性、碱性、中性极性或中性非极性和/或芳香族氨基酸。一般提出，不同于天然形式的肽类含有的氨基酸来自与被取代的氨基酸同一组。
因此，碱性氨基酸赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His)是可互换的;酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸是可互换的;中性极性氨基酸丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)是可互换的;非极性脂肪族氨基酸甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)相互之间是保守的，(但是因为分子大小的关系，甘氨酸和丙氨酸关系较密切，缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸关系较密切);芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)是可以互换的。
脯氨酸是非极性中性氨基酸，由于它对构象的影响而产生困难，被其置换或将其置换是不可取的;除非能得到相同或相似的构象结果。代表保守变换的极性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺;在较少程度上代表这种变换的有甲硫氨酸(Met)。此外，尽管分在不同的类目中，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸看来是可互换的，半胱氨酸也符合这一组，或可被分到极性中性氨基酸中。
D.肽制备的方法重组表达本发明进一步提供的是包含编码本发明的杀虫有效肽的DNA序列的重组表达载体，该载体能在已转化细胞中引起该编码序列的表达。本发明还提供用编码本发明的杀虫有效肽的DNA序列转化或转染的重组宿主细胞，使宿主细胞表达该肽。
提供编码所需蛋白质的合适的DNA序列，用本领域目前已知的重组技术即可制备蛋白质。该编码序列可以这样获得从天然来源蛋白质追溯cDNA或基因组序列，或用从蛋白质的氨基酸序列推断的合成核苷酸序列进行化学方法制备。当编码的DNA是合成制备的时，可以优选利用目的宿主已知密码子。
表达系统包括必不可少的控制序列如启动子，有强化子更好，以及终止控制。对于种种宿主，这些表达系统在现有技术中是已知的，是容易得到的。例如，见Sambrooketal.MolecularCloningaLaboratoryManual，SecondEd.ColdSpringharborPress(1989).
从而，在原核生物和真核生物系统均可制备所需的蛋白质，产生蛋白质的加工形式谱。
最常用的原核生物系统仍是大肠杆菌(E.coli)、尽管其他系统如枯草芽胞杆菌(B.Subtilis)和假单胞菌属(Pseudomonas)也被认为是有用的。原核生物系统适宜的控制序列既包括组成的启动子也包括可诱导的启动子，包括lac启动子、trp启动子、杂交启动子如tac启动子、λ噬菌体pl启动子。一般说来，在这些宿主中，外源性蛋白质可以被制成融合蛋白质或成熟蛋白质。当所需序列被制成成熟蛋白质时，所制备的序列可以甲硫氨酸为先导，此甲硫氨酸并非必须有效地除去。相应地，当在细菌中制备时，此处所要求保护的肽类和蛋白质类可以N-末端甲硫氨酸为先导。此外，构建可这样进行，其中编码肽的序列是以一可操纵的信号肽为先导，该信号肽导致蛋白质的分泌。就此而论，当在原核生物宿主中制备时，信号序列在分泌时被除去。
各种各样真核生物宿主现在对于重组外源蛋白质的制备也是适用的。如在细菌中一样，可以直接产生所需蛋白质的表达系统将真核生物宿主进行转化，但更通常的是提供信号序列以引起蛋白质分泌。真核生物系统有额外的优点，即它们能加工在编码高等生物的蛋白质的基因组序列中可能出现的内含子。真核生物系统还提供各种加工机制，它们可导致某些氨基酸残基的诸如糖基化、羧基末端酰胺化、氧化或衍生作用，构象控制等等。
通常所用的真核生物系统包括酵母、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞和高等植物的细胞。以上列举的并不详尽。合适的启动子是可用的，它们对于这些宿主类型中每一种在使用上是合适的及可操纵的，象例如杆状病毒多面体启动子那样，终止序列和强化子也是可用的。如上所述，启动子可以是组成型的或诱导型的。例如，在哺乳动物系统，可以通过加入重金属离子诱导MTⅡ启动子。
构建适合于所需宿主的表达系统的详细情况已为本领域技术人员所知。对于蛋白质的重组制备，编码该蛋白质的DNA被合适地连接到选择的表达载体上，然后被用来转化适当的宿主，然后将该宿主在产生外源基因表达的条件下培养和保存。如本领域技术人员已知和合适的那样，通过溶解细胞或从培养基中提取的方式，从培养物中回收上述制备的本发明的杀虫有效蛋白质。
因为提供了本发明蛋白质的重组体物质，所以可通过重组技术以及自动氨基酸分析仪来制备这些蛋白质。因为由其他宿主细胞赋予的翻译后特性差异，也可获得对天然存在蛋白质的各种修饰作用。翻译后变化改变了蛋白质的糖基化或脂化方式或一级、二级或三级结构，当然包括在要求保护的本发明的范围内，其结果，“修饰的”蛋白质不同于未修饰的蛋白质。
应进一步注意到的是，如果此处蛋白质是合成的，则也可进行不被基因编码的氨基酸的置换。可供选择的残基包括诸如分子H2N(CH2)nCOOH的ω氨基酸，其中n为2-6。这些是中性非极性氨基酸，如肌氨酸(Sar)、叔丁基丙氨酸(t-BuAla)、叔丁基甘氨酸(t-BuGly)、N-甲基异亮氨酸(N-MeIle)和正亮氨酸(Nleu)。例如，苯甘氨酸可被置换成色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，一种芳香族中性氨基酸;瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亚砜(MSO)是极性的但是中性的，环己基丙氨酸(Cha)是中性非极性的，磺基丙氨酸(Cya)是酸性的，鸟氨酸(Orn)是碱性的。脯氨酸残基的构象变换性质也可获得，如果这些残基中一个或几个被羟脯氨酸(Hyp)置换的话。
E.本发明杀虫有效肽类编码序列的鉴定在本发明的另一方面，提供了编码本发明的肽的实质上被分离的DNA序列。
应用部分氨基酸序列资料，可以分离和鉴定与从某来源蛋白质制备有关的基因。可用多种方法获得与肽的制备有关的基因。例子包括Fuqua，S.etal.，“AsimplePCRmethodfordetectionandcloninglowabundanttranscript”，Biotechnique，Vol.9，No.2(Aug1990);Frohman，M.A.，“RACERapidamplificationofcDNAends”，PCRprotocols，ed.Innisetal.，AcademicPress，SanDiego，CA，(1990)和美国专利No.4，703，008“DNASequencesEncodingErythropoietin”，这些专利被结合起来作参考。
简言之，DNA分子被合成，它编码测得的氨基酸序列或代表与编码测得的氨基酸序列的DNA分子互补的DNA链。然后在含重组DNA分子的细胞克隆中，该合成DNA分子可被用来探测DNA序列的同源性，所谓重组DNA分子部分包括来自生物体如蜘蛛的基因组DNA或来自从生物体如蜘蛛的细胞或组织分离的mRNA分子复制的cDNA。一般来说，同源DNA的独特鉴别要求15个或15个以上核苷酸的DNA分子，对要求独特鉴别所述数目在序列中至少5个氨基酸。可以认识到的是，可编码测得的氨基酸序列的不同DNA分子的数目可以是很大的，因为每个氨基酸可被多至6个独特三核苷酸DNA序列或密码子所编码。因此，分别测试所有可能的合成的DNA探针是不实际的，几个这样的DNA分子库共同作探针使用。这些探针被称作“简并性”探针，其制备是现有技术中已知的。还可认识到的是，当探针混合物中只有一个DNA分子具有与感兴趣的基因精确无误的序列同源性，在分子库中几个合成DNA分子可能是独特地等同于所述基因，因为只要求一个高度同源性。因此，感兴趣的基因的成功分离可能与合成的DNA探针库一起完成，该DNA探针库不包括全部可能的DNA探针序列。一般说来，不经常被机体利用的密码子不必在探针库中描述。事实上，通过仅包括被机体最常应用于每一种氨基酸的DNA密码子，可以制备单一序列DNA探针，尽管可认识到这一方法并非总是成功的。
分离基因序列的一种技术是应用多聚酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)。例如，见美国专利4，683，195和4，683，202，这些专利被结合起来作为参考。当该序列的两个末端部分已知时，基本上PCR使所选的DNA序列的制备成为可能。可获得相应于感兴趣的序列的每一端的引物或寡核苷酸探针，然后用PCR法合成制备DNA序列中央部分。
在这样一种应用PCR以获得编码独特的蜘蛛毒液基因的基因的方法中，从蜘蛛分离并提纯RNA，然后将一以脱氧胸苷酸为末尾的寡核苷酸用作引物，以便逆转录蜘蛛mRNA为cDNA。然后，如上述简并性探针中那样，制得合成DNA分子或合成DNA分子的混合物，它们可编码如前面所确定的毒液蛋白质的氨基末端氨基酸序列。将该DNA混合物与以脱氧胸苷酸为末尾的寡核苷酸合用，以引发PCR反应。因为用于引发PCR反应的合成DNA混合物对于所需mRNA序列是特异性的，所以只有所需的cDNA会被有效地扩增。所得产物代表一扩增的cDNA，它可被连接于很多已知克隆化载体的任何一种。可以认为，肽类“家族”可存在于蜘蛛毒液，它们有类似的氨基酸序列，在这样的情况下，使用混合的寡核苷酸引物序列可导致编码这些有关肽类的一个或几个有关cDNA的扩增。编码有关肽类的基因也包括在本发明的范围内，因为有关肽类也有有用的杀虫活性。
最后，可用常规技术将制得的cDNA序列克隆进适当的载体，分析并测定核苷酸碱基序列。编码杀虫有效蛋白质的DNA序列的例子在序列排列表和表Ⅷ中给出。这些PCR产物的直接氨基酸翻译将揭示，它们相应于成熟蛋白质的完全密码序列。用这一方法可能得不到可编码相应于前体的氨基酸和/或前肽区域的DNA序列部分。用本发明制备的cDNA克隆作为杂交探针(该杂交探针包括在现有技术范围内)，分离基因组或cDNA克隆可以测定这些序列。
F.交叉杂交DNA序列作为相关化合物的探针适当大小(一般从20-150个核苷酸)的DNA探针可从本发明的DNA序列得到。通过与其它来源的核酸杂交，可将这样的探针用于检测编码杀虫有效肽的DNA的存在。用编码信号序列筛选cDNA片断或甚至在严格性减少的情况下筛选完整的cDNA的寡核苷酸，可以得到与我们此外描述的毒素分子族具有功能上同源性的其他活性肽类。同产生于本发明DNA序列的核苷酸探针进行交叉杂交的优秀候选核酸，其来源包括，但不限于同属不同种的蜘蛛、相关属的蜘蛛和同属不同地点的蜘蛛。
G.肽类作为杀虫剂的应用通过使害虫与有效量的本发明肽相接触，据信本发明的杀虫有效肽类可用于控制无脊椎类害虫如鳞翅目害虫。通常，昆虫是最适害虫。
将无脊椎害虫与肽接触以控制所述害虫的方法是已知的。例子有供害虫经口摄取的用合成囊包裹的蛋白质。表达本发明蛋白质的重组宿主如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)可被加热杀死，施用于植物或适当的底物，以用于其后的经口摄入和控制。
当然，用本发明的蛋白质控制无脊椎害虫的方法可以与控制害虫的其他方法合并使用。例如，根据要控制的害虫的类型和存在的其他重要变异，可将本文描述的转基因植株和大肠杆菌用基因工程法来表达其他无脊椎动物毒素。
本发明还提供含有杀虫有效量的按本发明所述的肽及其农业上或园艺学上可接受的盐在农业上或园艺学上可接受的载体上的杀虫组合物。
H转基因植物本发明进一步提供的是含编码本发明的杀虫有效肽的DNA序列的转基因植物，该DNA序列被引入植物的种系，以至通过有性繁殖或无性繁殖的植物相继传代，将该DNA序列的表达性状遗传下来。
通过基因工程技术可将编码按本发明所述杀虫有效肽的基因引入植物，在植物细胞中制备这种肽，可望作控制昆虫类害虫的手段被使用。因此，可能产生一种植物，它比天然存在的植物品种有更大的耐虫性。
可用于转化值物的杀虫有效肽基因的密码区可以是基因的全长或部分活性区长度。但是作为在得到的植物中的功能肽，编码该肽的基因序列必须被表达和制备。据信，编码杀虫有效肽的来自基因组DNA和cDNA的DNA和合成DNA可被用来转化。而且，基因可部分由cDNA克隆、部分由基因组克隆，部分由合成基因及它们的各种结合来构建。此外，编码肽基因的DNA可包含除分离肽来源外还来自各种种属的部分。
此外，据信杀虫有效肽可与另一种或几种化合物合用，以在含表达这些化合物的嵌合基因的转化植物上产生预料不到的杀虫性质。这些其他化合物可包括例如对昆虫有口服毒性的蛋白酶抑制剂或从Bacillusthuringiensis得到的多肽类。B.thuringiensis蛋白质引起昆虫肠细胞膜钾通透性的改变，假设在膜上产生小孔。其他形成孔的蛋白质也可与杀虫有效肽类合用。这些形成孔的蛋白质有以下例子magainins、cecropins、attacins、meiittin、短杆菌肽S、钠通道蛋白质及合成的片断，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)毒素、载脂蛋白及其片断、丙甲菌素和各种合成的亲水亲脂性肽类。结合于细胞膜，促进内胞饮作用的植物凝血素类是另一类蛋白质，可与本发明的杀虫有效肽类合用，以从遗传学上改变植物耐虫性。
肽基因启动子可望在表达嵌合基因序列上有用，而其他启动子也可望是有用的。可能有用的一种高效植物启动子是高产的启动子。与肽的基因序列操纵上连接的该启动子应能启动肽的表达，以使转化植株增加对昆虫害虫的耐受性。在本发明中认为有用的高产植物启动子是已知的。
包含操纵上连接于启动子上的杀虫有效肽基因的嵌合基因序列可被连结到适当的克隆化载体中以转化所需的植株。一般说来，采用含复制和控制序列的质粒或病毒(噬菌体)载体，这些序列得自与宿主细胞相适合的种属。克隆化的载体会典型地携带复制源及特殊基因，这些基因在转化宿主细胞上可提供典型地对抗生素耐药的表型选择标记。在宿主细胞中转化后，转化载体可被这些表型标记选择。
被认为有用的宿主细胞包括原核生物(包括细菌宿主如E.coli，Salmonellaryphimurium和Serratiamarcescens)和真核生物宿主，如酵母或丝状真菌。
克隆化载体和由此载体转化的宿主细胞一般可用于增加载体的复制数。随着增加的复制数，含肽基因的载体可被分离，例如，可被用于将本文描述的基因序列引入植物或其他宿主细胞。
制备表达外源性基因的植物的方法是已知的。例如，通过用A.tumefaciens直接感染植物或将植物、植物组织或细胞与A.tumefaciens共培养;外源性DNA直接基因转移到原生质体上;与聚乙二醇(PEG)一起培育;微量注射和微抛射体(microprojectile)轰击方式等可使植物进行转化。
用AgBiotechnologyNews，Vol.7p.3and17(Sept/Oct1990)描述的一种技术，靠电导(electroporation)可以确定在烟草上的转化。在该技术中，在含杀虫有效肽基因结构的质粒存在下，植物原生质体被电导。高电场强度的电脉冲可逆地提高生物膜通透性，将质粒导入。电导入的植物原生质体重组细胞壁、分割和形成植物愈伤组织(callus)。用上述表型标记可以完成带有已表达的杀虫有效肽的转化植物细胞的选择。外源性DNA可以加到任何形成的原生质体中，诸如裸线性、环形或超螺旋型DNA、囊包于脂质体中的DNA、原生质球状体中的DNA、在其他植物原生质体中的DNA、与盐复合的DNA等等。
可被Agrobacterium转化的全部植物细胞与从转化的植物细胞再生的全植株还可按本发明进行转化，以产生转化的全植株，该植株含有转移的杀虫有效肽基因。D.M.Rainerietal.，“Agrobacteri-um-mediatedtransformationofrice(Oryzasatival.)”，Biotech-nology，Vol.8，pp33-38(January1990)进一步证实了在稻上的转化。
将杀虫有效肽基因引入植物细胞的另一个方法是用以杀虫有效肽基因转化的A.tumefaciens感染植物细胞。在本领域已知的合适条件下，转化的植物细胞被培养生或芽、根、进而发育成转化植株。杀虫有效肽基因序列可被引入适当的植物细胞，例如，用A.tumefaciens的Ti质粒。Ti质粒在受A.tumefaciens感染时被转导到植物细胞，并被稳定地整合到植物基因组中。
Ti质粒含有被认为是制备转化细胞所必需的二个区域。其中一个称作转移DNA(TDNA)的引起肿瘤形成;另一个称作毒性区的是肿瘤形成所必需，而非肿瘤维持所必需的。转移到植物基因组的TDNA区域可因酶基因序列的嵌入而增大，但其转移能力不受影响。通过除去致肿瘤基因使其不再干扰，然后可将经修饰的Ti质粒用作将本发明的基因结构转移到合适的植物细胞中的载体。
用可与细胞摄取的基因物质形成沉淀复合物的聚乙二醇(PEG)，也可将基因物质转移到植物细胞中。
通过注入到被分离的原生质体中、培养的细胞和组织中，以及注入种子和植株的分生组织，也可使DNA转移到植物细胞中。用本领域已知的常规方法可获得转基因植株及其后代。
将外源性DNA序列引入植物细胞的另一个方法包括将DNA附着于颗粒，然后用“基因枪”(geneguns)射击的方法，将颗粒迫入植物细胞。任何植物组织或植物器官均可在体内外试验中用作这一方法的靶子，它们包括但不限于胚胎、顶生的(apical)和其他分生组织、芽、体组织和生殖组织。按已建立的方法选择转基因细胞和愈伤组织。按本领域已知的建立起来的方法，将靶组织诱导生成体胚胎或再生苗，以得到转基因植物。按照所用植物的种，可以选择适当的方法。用调整微抛射体(high-valocitymicroprojectile)将基因转移到胚胎形成细胞中，制备了转基因玉米植株“Inheritanceandex-pressionofchimericgenesintheprogenyoftransgenicmaizeplants”，Biotechnology，Vol.8，pp833-838(September1990)。
相对于掺入的外源DNA，再生的植株可以是嵌合的。如果含外源DNA的细胞发育成小孢子或大孢子，整合的外源DNA则被传递到性后代。如果含外源DNA的细胞是植物的体细胞，则用增殖性(无性)繁殖的常规方法，既可在体内从芽或茎插条，也可在体外，按本领域已知的已建立的方法，产生非嵌合的转基因植物。这些方法可按照所用的植物的种而加以选择。
在植物细胞或植株转化后，这些转化的植物细胞或植株(肽因此而被表达)可被适当的表型标记所选择。这些表型标记包括，但不限于，抗生素耐药性。其他表型标记是本领域已知的，可被用于本发明。
由于存在各种不同的转化系统，所有的植物种类大体上均能被转化，从而表达本发明的杀虫有效肽。
日益增加的证据表明，实际上所有植物均可从培养细胞或组织得到再生，包括但不限于全部种类主要的谷类作物、糖甘蔗、糖甜菜、棉花、水果和其他树、豆类和蔬菜类。在是否所有这些植物均可被Agrobacterium转化上目前只有有限的知识。作为Agrobacterium天然植物宿主的种可在体外被转化。单子叶植物，特别是谷类和草类，不是Agrobacterium的天然宿主。用Agrobacterium转化它们的努力直至最近才成功。目前日益增多的证据表明，某些单子叶植物可被Agrobacterium转化。用目前可以利用的新的实验手段，也可转化谷类和草类的一些种。另外一些可被Agrobacterium转化的植物的属包括Ipomoea，Passiflora，Cyclamen，Malus，Prunus，Rosa，Rubus，Populus，Santalion，Allium，Lilium，Nacissus，Ananas，Arachis，Phaseolus，和Pisum。
植物种和种之间的再生是不同的，但一般先提供含杀虫有效肽基因多副本的转化原生质体悬液。然后可从原生质体悬液诱导胚胎形成，象天然胚胎一样至成熟和发芽阶段。培养基一般含各种氨基酸和激素。正常情况下，茎干和根同时发育。有效的再生依据培养基、遗传型和培养史。如果这三种可变因素均得到控制，那末，再生是完全可再现和可重复的。
从转化的植物细胞长成的成熟植物可被近亲繁殖以产生近交系植物。该近交系植物产生含杀虫有效肽基因的种子。这些种子可被种植，以产生表达杀虫有效肽的植物。例如，近交系可被用来发展对昆虫耐受的杂种。在这一方法中，对昆虫耐受的近交系与另一近交系杂交，以产生杂交种。
在二倍体植物上，一亲本可典型地被杀虫有效肽(毒素)基因序列转化，另一亲本为野生型。亲本杂交后，第一代杂种(F1)会显示1/2毒素/野生型∶1/2毒素/野生型的分布。将这些第一代杂种(F1)近亲繁殖，得第二代杂种(F2)。F2杂种的基因分布为1/4毒素/毒素∶1/2毒素/野生型∶1/4野生型/野生型。带有毒素/毒素基因构造的F2杂种被选作耐昆虫植物。
如此处所使用的，变异体绘制表位变化，这些变化是稳定、可遗传的，包括有性地传递给植物的后代的可遗传的变异，假如此变异体仍表达本发明的杀虫有效肽。又如此处使用的，突变体绘制环境条件如幅射造成的变异，或基因变异造成的变异，在基因变异中，按照公认的遗传法则减数传递遗传性状。但是，该突变体植物必须仍然表达本发明的肽。
一般来说，被选来在转基因植物中表达的理想的杀虫有效蛋白质是这样一种蛋白质，它的特点是对非靶昆虫和脊椎动物的安全性。表达系统将被选择以使表达水平达到提供杀虫功效。从而，获得这些农业上重要的转基因植物的这种技术可行性可望给农民提供另一武器，用于综合虫害处理系统，以环境上可靠的方式来减少对谷物的虫害。
I.遗传工程杀虫微生物杀虫有效肽单独或与另一杀虫毒素合用，在增强或提高微生物如杆状病毒和杂交细菌的毒性上被认为是有用的。
一些杆状病毒，包括感染烟草夜蛾幼虫(Heliothisvirescens)、黄杉毒蛾(Orgyiapseudotsugata)、舞毒蛾卷叶蛾(Lymantriadispar)、苜蓿环纹夜蛾(Autographacalifornica)、松锈锯角叶蜂(Neodiprionsertifer)和苹果蠹蛾(Laspeyresiapomonella)的病毒在某些国家已被注册并用作杀虫剂。将至少一种昆虫选择性毒素引入基因组，可望明显地增强这些杀虫剂的效力。
被认为特别适合于本发明使用的重组表达载体是杆状病毒表达载体如美国专利4，879，236所揭示的类型，该专利被结合起来作参考。又见Carbonelletal.“Synthesisofagenecodingforaninsect-specificscorpionneurotoxinandattemptstoexpressitusingbac-ulovirusvectors，”Gene，73∶409-418(1988)该载体在如下系统中被认为是有用的，在该系统中，如U.S.4，879，236和Milleretal.，Science，219，715-721(1983)中所描述的，编码基本上从隅蛛属蜘蛛毒液分离的杀虫有效肽的DNA序列可被克隆进杆状病毒，如Autographacalifornica(AcMNPV)表达载体。然后可将重组表达载体病毒施用于植物或动物，在这些动、植物上的昆虫是害虫，当病毒被害虫摄入后，重组病毒将侵入中肠壁细胞，并开始复制。在犁制时，杀虫有效蛋白质基因会被表达，导致昆虫伤残或死亡，时间比昆虫摄入野生型AcMNPV病毒所需要的短。
欧洲专利申请0340948提出杂交病毒也可望是有用的。表达本发明DNA的杂交病毒可望产生昆虫宿主谱改变的病毒。例如，作为含本发明DNA的杂交基因的单股多肽产物，可以表达出融合蛋白，特异的昆虫肠细胞识别蛋白可将表达出来的杀虫有效肽导向宿主昆虫靶。
按欧洲专利申请0325400所提供的方法，可转化各种原核细胞和真核细胞微生物，以表达编码杀虫有效蛋白质的杂交毒素基因。
含有带编码本发明蛋白质的基因的质粒的杂交细菌细胞在本发明的方法中被认为是有用的。将此杂种施用于昆虫，可控制昆虫。见美国专利4，797，279，该专利被结合起来作为参考。
Tomalskietal.，“Insectparalysisbybaculovirus-mediatedexpressionofamiteneurotoxingene”，Nature，352∶82-85(1991)和Stewartetal.，“Constructionofanimprovedbaculovirusinsecticidecontaininganinsect-specifictoxingene”，Nature，352∶85-88(1991)中描述了应用杆状病毒的其他例子，它们也适合于本发明的应用。
J.抗杀虫有效肽的抗体本发明的另一方面是抗本发明杀虫有效肽的抗体。下面的描述给出了免疫学领域技术人员所知道的各种方法学的参考，用于检测和提纯能与此处所述抗体能反应的肽。
所谓抗体，是“能够结合”一种分子的，如果它能特异性地与该分子反应。“表位”这一术语是指能被抗体识别和结合的分子的那部分。一个抗原可有一个或一个以上表位。“抗原”能诱导动物产生能结合于该抗原的一个表位的抗体。上面提到的特异性反应意思是指抗原以高度选择性的方式与其相应的抗体发生免疫反应，而不与可被其他抗原激发的众多其他抗体发生免疫反应。
此处所用的术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意思是包括能结合抗原的完整分子及其片断(如Fab和F(ab′)2片断)。Fab和F(ab′)2片断缺乏完整分子的Fc片断，较快地从循环中清除，并且对昆虫抗原有较小的非特异组织结合。
本发明的抗体可用各种方法中的任何一种加以制备。这些抗体的制备和使用方法是众所周知的，在文献中被充分地加以描述。例如，见HarlowandLane，“AntibodiesAlaboratorymanual”，ColdSpringHarborPress，NewYork(1988)。通常，按本领域已知的方法制备和提纯杀虫有效肽，使其基本上不含天然污染物，或合成杀虫有效肽片断。为了制备有较高特异活性的多克隆抗血清，可将提纯的肽或合成的片断或提纯的天然片断和/或合成片断的结合物引入动物体。
用杂交瘤技术可制备单克隆抗体。一般来说，这样的技术涉及用一抗原如杀虫有效肽抗原免疫动物。取出该动物的脾细胞，与适当的骨髓瘤细胞系融合。按照本发明，可采用任何合适的骨髓瘤细胞系。融合后，将得到的杂交瘤细胞在适当的介质中作选择保留，再以限定的稀释度进行克隆。然后将经这样的选择而得到的杂交瘤细胞进行测试，以鉴别出分泌能结合杀虫有效肽抗原的抗体的克隆。
如果肽的来源不纯，则只有某些杂交瘤细胞会产生能结合该肽的抗体(其他杂交瘤细胞会产生能结合肽污染物的抗体)。因此，在杂交瘤细胞中筛选那些能分泌能结合肽的抗体的细胞可能是必需的。筛选最好是这样完成在从一群特定杂交瘤细胞中的每个细胞分泌的单克隆抗体的存在下，培养肽(或毒液)的样品并鉴定能分泌这样一种抗体的任一杂交瘤细胞，这种抗体能中和或减弱毒液麻痹昆虫的能力。一旦这样一个杂交瘤细胞被鉴定出来，可用本领域已知的方法将其克隆化繁殖，以产生肽特异性单克隆抗体。
为了用抗体亲和层析法提纯天然的或重组的昆虫选择性毒素，必须采用能结合到杀虫有效肽上的抗体。这样的抗体一般是单克隆抗体。一旦获得肽特异性抗体，可按本领域公知的方法，通过结合于固体支持物而将其固定，并用免疫亲和层析法，将其用来提纯从天然毒液或其他来源得到的肽。这些方法能介导高度提纯，据此产生基本上无天然污染物的肽。如果它是以这样一种形式存在，即与它天然地和正常地共存的化合物(例如其他蛋白质、脂类、糖类等)并不存在，那末;如此处所用的，肽被称为“其本上无天然污染物”。
抗体也可被用于检测在重组表达系统中产生的蛋白质(ELISA或Western);在田野或实验室中所表达蛋白质的定量，持久性水平等;以及检测由其他蜘蛛毒液(有亲缘关系或无亲缘关系的属)或其他毒液来源结构/功能上有关的其他分子。
下述例子用来说明本发明范围内的特殊组合物与方法，但它们并不为了限制本发明的范围。
材料与方法实施例一般方法按美国专利4，925，664所述，用电刺激使蜘蛛毒液释放，然后吸引收集释放的毒液，用回流或血淋巴方式防止毒液污染，这样来得到蜘蛛毒液。
毒素纯化-将贮存于-80℃的粗制毒液先融化、彻底混匀，在作色谱分离前溶解于原溶剂。用结合Beckman System Gold 126溶剂分送和168光电二极管阵列模件的高敏液相色谱法(HPLC)将粗制毒液分级分离(fractioned)。在纯化中使用下述柱一与条件。用Vydac 300 Angstrom C18柱(25cm×10mm内经，5μm颗粒大小)，在3.5ml/分钟流速下，用0.1%TFA到在CH3CN/H2O(1∶1)中0.1%TFA作50分钟线性梯度洗脱，来进行半制备的反相色谱法。梯度在注入样品后5分钟开始。在下面的实施例中除非说明，反相色谱分析均在以下条件下进行，即用Vydac C18柱(25cm×4.6mm内径，5μm颗粒大小)，用从0.1%TFA到在CH3CN/H2O(1∶1)中0.1%TFA作50分钟线性梯度洗脱。流速在1.0ml/分钟，梯度在样本注入后5分钟开始。于220nm下对反相柱进行监测，用Gilson203型分部收集器收集各流分。在分部收集后，将从反相色谱法得到的流分冷冻干燥，贮存于-20℃。阳离子交换色谱法是这样完成的用HEMA-IECBIOSB柱(15cm×4.6mm内径，10μm颗粒大小)，用从50mM醋酸钠(pH4.0)到在50mM醋酸钠中的IM氯化钠(pH4.0)作70分钟梯度洗脱，梯度开始于注入样品后5分钟，洗脱速率为1ml/分钟。于280nm下监测洗脱液，在Gilson203型分部收集器上收集各流分。如下所述，用对鳞翅目幼虫的一些种进行注射的方法来测定各流分的杀虫活性。
实施例1由Tegenariaagrestis的完整毒液得的杀虫肽的原始流分和鉴定。
用在方法中描述的可得的5μl Tegenaria agrestis完整毒液以95μl 0.1%TFA(水)洗脱，用在方法中描述的VydacRP C18分析柱反向HPLC来分取流分。以在220nm处跟踪监测流出物的方式收集各流分。毒液的第二个5μl部分也在相同的状况下分取流分，将二次层析所得的相似片段混合，冻干。
被冻干的流分再溶于50μl的磷酸盐缓冲液(pH6.5，PBS)中，以将流分注入烟草芽虫(TBW;Heliothisvirescens)的方式测定其杀虫活性。每一流分要采用3个TBW幼虫，在幼虫中注入6μl(1.2wve)的测试溶液，对照组的昆虫注射等量的生理盐水。在处理后，将幼虫分别监放于Petri盘(dish)中，喂食并间歇观察。仅第7和8流分有杀虫活性(表Ⅰ，图5)。
实施例2Tegenariaagrestis流分8的进一步纯化。
由Tegenariaagrestis流分8所得的主要杀虫成分，在阳离子交换柱上再进行一次色谱分离来提纯后，用反向层析对主要成分脱盐。
在TBV测试后留在流分8中的物质(大约在25μl体积中为5wve)以pH4.0，50mM醋酸钠500μl来洗脱。然后按方法中描述的，在HEMA-IECBIOSB柱中作色谱分离。流出物在280nm处追踪监测，杀虫成分在41分钟时被洗脱出。将此流分按方法中描述的，在分析用VydacC18柱上用色谱洗脱盐。纯化毒素NPS-326以单峰形式被洗脱出来，保留时间为30.5分。
实施例3100μlTegenariaagrestis完整毒液的分级分离100μl的Tegenaria agrestis的完整毒液，在与实施例1和2所给予的相似的条件下进行分级分离，以得到大约300μg的毒素NPS-326。特别是，将50μl的Tegenaria agrestis粗制毒液稀释到950μl的0.1%TFA(水)中，在半制备的Vydac RP C18柱上，按方法中所描述，进行分级分离。流出物在220nm进行追踪监测，收集杀虫流分。流分7在35.4分到37.1分钟间洗脱出来，而流分8在37.1分到38.3分钟间洗脱出来。毒液的第二个50μl(被类似地分级分离，从二次色谱法得到的类似流分被合并，冻干。通过在pH4.0的50mM醋酸钠0.2毫升中溶解冻干物质，在HEMA-IEC BIO SB柱上色谱层析来对流分8进一步纯化。按方法中所描述的方法洗脱该柱，在280nm追踪监测流出物。将46分钟时洗脱的杀虫组分按方法中描述的在Vydac C18分析柱上用反相色谱法洗脱盐。纯化的毒素NPS-326在32分钟时被洗脱出来。冻干后可得到310μg毒素。对天然的和还原的及烷基化的(吡啶乙基化的)肽二者进行N末端序列分析，得出了NPS-326的前30个氨基酸。
用SDS-PAGE电泳测得NPS-326的表观分子量为6-8KD。用质谱法测得的实际质量为5678.55±0.37D。
实施例4从Tegenariaagrestis中得到的主要杀虫成分流分7的纯化将从全毒液反相色谱法得到的150wve流分7(100wve得自实施例3，50wve得自类似的色谱层析)用阳离子交换色谱法获得两种主要的杀虫成分，NPS-331和NPS-373。将三次50μl色谱法得到的冻干粉末置于50mM醋酸钠(pH4.0)200μl中，按方法中描述的，在HEMA-IECBIOSB柱上洗脱。流出物在280nm处追踪监测，杀虫成分在37分钟时协同洗脱出来。然后在分析用Vydac C18柱上，用0.1%TFA(水)(溶剂A)和在CH3CN中的0.1%TFA(溶剂B)，以下述梯度洗脱将该流分脱盐0%B洗脱3分钟，0%至15%B洗脱超过3分钟，15%至35%B超过80分钟。NPS-331在29分钟时洗脱出来，而较低活性的NPS-373在32分钟时洗脱出来。冻干较高活性的流分可得到大约30μg的NPS-331。在冻干后回收的NPS-373的量估计在10μg(由色谱层析的峰区面积积分)。
对二个活性肽的N末端序列分析得到NPS-331的前31个氨基酸和NPS-373的前20个氨基酸。
SDS-PAGE电泳得到NPS-331和NPS-373的表观分子量为6-8KD。用质谱仪得到的质量(电动喷雾离子化(electrosprayionization)，由加拿大魁北克生物技术研究所提供的资料)，NPS-331为5700.39±0.29D，NPS-373为5643.09±0.41D。
表1.在TBW中Tegenariaagrestis反相色谱层析流分的活性，各流分以每幼虫1.2wve进行测试流分号24小时TBW麻痹48小时TBW麻痹10/40/420/40/430/40/440/40/450/40/460/40/472/4患病4/4麻痹82/4患病4/4麻痹90/40/4103/4Fi0/4110/40/4
120/40/4130/40/4140/40/4150/40/4Fi＝feedinginhibition拒食实施例5搜集蜘蛛，并在NaturalProductSciences，Inc.鉴定，确定为Tegenariaagrestis。从被麻醉的蜘蛛上取出毒液腺，在液氮中迅速冷冻。用ChomczynskiandSacchi(AnalyticalBiochem-istry，Vol162，p156(1987)方法，从毒液腺中抽提RNA。
与由NPS-326得到的氨基酸序列的残基1到11相对应的寡核苷酸列于图1。用蜘蛛密码子优选和在高度简并的部位上的脱氧胸苷酸残基来设计此寡核苷酸。XhoⅠ限制切点是收编在引物的5′点区。用于第一条链cDNA合成的引物是由邻接于NotⅠ限制内切酶位点的大约15个脱氧胸苷酸残基组成。所有引物均在theUniversi-tyofutah，HowardHughesMedicalInstitute方便地承包合成。从毒液腺制备RNA，信使RNA，用鼠白血病病毒逆转录酶(BethesdaResearchlaboratorins，MD).逆转录为cDNA。含有制造商提供的酶缓冲液的20μl反应混合物中含有500ngRNA，2单位的RNasin(Boeringermannheim，Indianapolis，IN)，35ngd(T)NotⅠ引物，1mM每一种三磷酸脱氧核苷酸，和100单位的逆转录酶。反应混合物在37℃培育1小时，在42℃继续反应10分钟。将反应混合物用酒精沉淀，和重新悬浮于20μl水中。
以热稳定的DNA多聚酶来进行引物定向导引的酶化扩增最初由Saikki et al.Science，239∶487(1988)，(专利4，683，202)描述。在我们应用时，10μl毒液腺DNA用作多聚酶链反应的模板，该反应包含有在GeneAmpTMDNA扩增盒(Perkin Elmer Cetus，Nor-walk，CT)中所含有的试剂。扩增反应含有2μM浓度的正意(sense)和反意(antisense)引物，100uM每一种三磷酸脱氧核苷酸和4单位热稳定重组Taq多聚酶。反应在PerkinElmerCetus(Nor-walk，CT)生产的可设程序的加热块上进行。温度循环参数包括在95℃2分钟的变性，37℃引物退火2分钟和在72℃酶促延伸1分钟。这种循环重复2次，然后将该程序变换到一个等同的情况，编入使退火温度提高到54℃，这种循环重复35次。
利用在the GenecleanTMkit(Bio 101，Vista，CA).中用的玻璃乳树脂(glassmilk resin)从3%NuSieve，/1%SeaKem组成的琼脂糖凝胶(FMC，Rockland，ME)中提纯结合的PCR产物。插入物用限制性内切酶NotⅠ and XhoI(Boeringer Mannheim)作两次消化。载体pKS(Statagene，LaJolla，CA)，用同样的二种酶进行两次消化以形成用于定向克隆的特异位点。在有15%聚乙二醇(polyethy-lene glycol，Sigma，St Louis MO)存在下将载体和插入物连接并转化到足够的大肠杆菌株DH5aF’(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)中，并接种到LB平板上[10克/升胰化胨(Difco)，5克/升酵母浸出物(Difco)，10克/升氯化钠，15克/升琼脂(BBL)，含有氨苄青霉素(50ug/ml)和TPTG(异丙基硫代-β-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)作指示剂]。含有重组质粒的细菌菌落由它们不能含成β-半乳糖苷酶和在指示平板上转兰而作出鉴定。它们能在加有氨苄青霉素的LB培养基上生长和用CsCl梯度来纯化质粒。被纯化的质粒用市售外来引物和Seque-nase
Version 2.0试剂和酶(US Biochemical，Cleveland，OH)来分析序列。
为接近这些cDNA分子的上游序列，一个与编码cDNA序列的三种毒素的同源区相应的内部寡核苷酸被合成，以与双链cDNA的反意链相应。这个寡核苷酸是对应于SeqIDNO.2，NPS-326的cDNA的核酸残基76到97。10微升的单链毒液腺cDNA在其具有脱氧乌苷的3′端，用酶，末端脱氧核苷酸转移酶(BethesdaRe-searchLaboratories)进行加尾。将含有14μm酶和500μmdGTP的20μl反应物在37℃培育15分钟。样品以乙醇沉淀和再悬浮于20μl水中。
内在引物的DNA序列上游用与下游/成熟毒素cDNA序列所用相类似的结合PCR技术来扩增。扩增反应物含有2μM浓度的正意(一种d(C)尾接的引物)和反意引物，每种三磷酸脱氧核苷酸100μM和4单位热稳定的重组Taq多聚酶。温度状况如下94℃2分钟，37℃2分钟，37℃1分钟。这个循环重变2次，然后将程序变换，以使第二步退火温度提高到54℃。这个循环重复35次。
结合PCR得到230bp片段，可在有溴化乙锭存在的4%琼脂糖凝胶中证实。用大肠杆菌DNA多聚酶I(Molecular Biology Re-sources，Madison，WI)的大片段(Klenow片段)，在末端填补反应产物，并加入乙醇来沉淀。产物再悬浮及以限制性内切酶Sall来消化。被消化过的片段在1mM ATP存在下，用T4激酶激活，然后连接到Sall和Eco RV消化过的pKS载体上。转化子以双链DNA序列筛选。以这种方式得到编码NPS-326，NPS-331和NPS-373的cDNA的上游序列。NPS-326，NPS-331，和NPS-373的完整DNA序列分别列于图2、图3和图4。
编码NPS-326的DNA序列被克隆进购自PharmaciaLKBBiotechnology(Piscataway，NJ)的原核细胞表达载体pGEX-3X(Smith，DB，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，8703(1986))的BamHi-EcoRI位点。该载体然后被转化进大肠杆菌细胞系W3110(ATCC27325)和接种在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。种子培养物在37℃生长，然后用新鲜培养基作10倍稀释，接着培养生长直至在595nm处光密度为0.5时止。该培养物然后以0.5mMIPTG诱导和培育生长3小时。用谷胱甘肽交联珠琼脂糖珠(Sigma，St.Louis)作层析，提纯可溶性融合蛋白。被表达蛋白的获量大约为5mg/L。该纯化的融合蛋白被用于提高多克隆抗体，该抗体对于用蛋白印迹试验(Westernblotting)或酶联免疫吸附试验(ELISAassays)来测定被表达的Tegenaria毒素是有用的。
表Ⅱ由SeqIDNo.2编码的肽即NPS-326NPS-326的氨基酸成分与蛋白质特性是由pAda17编码的。计算得的分子量应校准为5，678.85道尔顿，如果估计到所有的半胱氨酸残基均包括在二硫键连接中和C末端酰胺化的话。这些变化使计算所得分子量减少64.08道尔顿。
未处理处理后计算所得分子量=5742.935,678.85估计的pI=4.9765.41氨基酸成分:
非极性数量%Ala611.76Val35.88Leu00.00Ile11.96Pro11.96Met11.96Phe23.92Trp00.00极性数量%Gly35.88Ser11.96Thr23.92
Cys611.76Tyr23.92Asn47.84Gln23.92酸性:数量%Asp35.88Glu611.76碱性No.%Lys35.88Arg35.88His23.92表Ⅲ由SeqIDNo.8编码的肽即NPS-331NPS-331的氨基酸成分与蛋白质特性是由pAdal编码的。计算得的分子量应校准为5，699.86道尔顿，如果估计到所有的半胱氨酸残基均包括在二硫键连接中和C末端酰胺化的话。
未处理处理后计算所得分子量=5763.9395,699.86估计的pI=4.6784.96氨基酸成分非极性数量%Ala611.76Val35.88Leu00.00Ile11.96Pro11.96Met11.96
Phe23.92Trp00.00极性数量%Gly23.92Ser11.96Thr35.88Cys611.76Tyr23.92Asn59.80Gln23.92酸性数量%Asp35.88Glu611.76碱性数量%Lys35.88Arg35.88His11.96表Ⅳ由SeqIDNo.12编码的肽即NPS-373NPS-373的氨基酸成分与蛋白质特性是由pAdal2编码的。计算得的分子量应校准为5，642.81道尔顿，如果估计到所有的半胱氨酸残基均包括在二硫键连接中和C末端酰胺化的话。
未处理处理后计算所得分子量=5706.8905,678.85估计的pI=4.6784.96氨基酸成分非极性数量%
Ala611.76Val35.77Leu00.00Ile11.92Pro11.92Met11.92Phe23.85Trp00.00极性数量%Gly35.77Ser11.92Thr35.77Cys611.54Tyr23.85Asn47.69Gln23.85酸性数量%Asp35.77Glu611.54碱性数量%Lys35.77Arg35.77His11.92生物活性资料受试昆虫为末龄虫(lastinstar)，实验室培育烟草夜蛾幼虫(He-liothisvirescens，TBW);thebeetarmyworm，Spodopteraexigua(BAW);和甘蓝银纹夜蛾(Trichoplusiani，CL)的幼虫。所有三个种均属鳞翅目Noctuidae料。所有样本，不管是全毒液或毒液的部分均在经过滤灭菌的pH6.5生理盐水中制备。样本注入第四腹节的侧中线或侧中线附近的血腔中。针要以浅角度(shallowangle)插入以免损伤内脏。全毒液的剂量按所谓的全毒液当量(WVE)来计算。1个WVE是指正常存在于1微升乳状全毒液中的任一物质。从早期分离部分中所得组分的剂量也按WVE来度算。
从Tegenariaagrestis得的全毒液用每幼虫0.3WVE(～1.0WVE/克)的剂量注射在TBW和BAW中来测试。较小的效果最初在TBW注意到，但在注射16-24小时后幼虫表现为有特点的痉挛性麻痹(见下章节)。5只幼虫中4只最后死亡。BAW幼虫中的几个开初表现为弛缓性麻痹，但在60分钟内恢复。然而在24小时内，6只BAW幼虫中5只表现出同样的痉挛性麻痹，就象在TBW幼虫中见到的那样。每只幼虫0.03WVE剂量在TBW和BAW上仅引起微弱和可逆的作用。然而在CL幼虫中，0.03WVE/幼虫剂量使6只受试幼虫中2只致死。
Tegenaria毒液及由其提纯的毒素可引起受侵犯的幼虫特殊的，近乎螺旋形的不可控制的扭曲，这种扭曲在昆虫死亡前可持续几天。从毒素或毒液的注入至可见症状的出现间存在一个明显的延搁，有时超过24小时。这种延搁的长度与注入的毒素或毒液的量呈反变关系。在注射后头几分钟在BAW中注意到的那种可逆的弛缓性麻痹被认为是芳香胺毒素的作用。已知漏斗网蛛料的几种其他蜘蛛具有这些毒素。
用注射法，NPS-326对TBW，BAW和CL(每剂量6只昆虫)的LD50值为0.5-1.0nmol/gm。在TBW中测试NPS-331仅仅为作最初分级分离的目的，但呈现有大约与NPS-326同样的强度。在BAW和CL中剂量-反应实验表明NPS-331的LD50为0.5-1.0nmol/gm。在BAW和TBW中由NPS-326和NPS-331所引起的症状与由注射完整Tegenaria毒液引起的相同(即延迟发作的痉挛性麻痹)。然而在CL中此种痉挛性麻痹在注射的4-6小时内出现，很快即变为较少特性的症状。大约在注射后24小时，当BAW和TBW幼虫表现出特征性的扭曲行为时，CL幼虫表现出仅仅有快速、轻度的震颤。
哺乳动物毒性试验表明，NPS-326和NPS-331可具有对昆虫的高度选择性。30μg的NPS-326注射到雄性Swiss-Webster小鼠(～30克)的脑室(3只)或腹膜内(2只)，均无作用。
表Ⅴ序列图解ID#1.编码NPS 326的完整cDNA序列2.用于NPS 326合成的编码cDNA序列3.NPS 326的氨基酸序列(成熟毒素)4.带有信号/前导序列的NPS 326的氨基本序列5.信号/前导序列的编码序列6.信号/前导序列的氨基酸序列7.编码NPS 331的完整cDNA序列8.NPS 331的编码cDNA序列9.NPS 331的氨基酸序列(成熟毒素)10.带有信号/前导序列的NPS 331的氨基酸序列11.编码NPS 373的完整cDNA序列12.NPS 373合成的编码cDNA序列13.带有信号/前导序列的NPS 373的氨基酸序列14.NPS要373的氨基酸序列(成熟毒素)
序列表(1)一般信息(i)申请人:卡伦·克拉普料(ii)发明名称:杀虫有效肽类(iii)序列数:14(iv)通信地址:
(A)收件人:Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz&Norris(B)街:One Liberty Place-46th Floor(C)城市:费城(D)州:宾夕法尼亚(E)国家:美国(F)邮政编码:19103(v)计算机可读形式:
(A)中型:盘3.5吋,1.44Mb贮存量(B)计算机:IBM PS/2(C)操作系统:PC-DOS(D)软件:WORDPERFECT 5.0(vi):本申请资料:
(A)申请号:尚未指定(B)申请日:尚未指定(C)分类:
(vii)在先申请资料:
(A)申请号:
(B)申请日:
(viii)律师/代理人信息:
(A)姓名:约翰W·考德威尔(B)登记号:28,937(C)参考/备审案件号码:FMC-0051(ix)电信信息:
(A)电话:(215)568-3100(B)电传:(215)568-3439(2)关于SEQ ID NO:1的信息(i)序列特征:
(A)长度:394(B)类型:核酸(C)股数:单股(D)拓扑结构:未知(xi)序列图谱:SEQ ID NO:1:
(D)拓扑结构未知(xi)序列图谱SEQIDNO∶3
(2)关于SEQIDNO∶4的信息(i)序列特征(A)长度68(B)类型氨基酸(C)股数(D)拓扑结构未知(xi)序列图谱SEQIDNO∶4
(2)关于SEPIDNO∶5的信息(i)序列特征(A)长度51(B)类型核酸(C)股数单股(D)拓扑结构未知(xi)序列图谱SEQIDNO∶5
(2)关于SEQIDNO∶9的信息(i)序列特征(A)长度51(B)类型氨基酸(C)股数(D)拓扑结构未知(xi)序列图谱SEQIDNO∶9Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe151015
Ala Gln Lys NH250(2)关于SEQIDNO∶10的信息(i)序列特征(A)长度68(B)类型氨基酸
(C)股数(D)拓扑结构未知(xi)序列图谱SEQIDNO∶10
(2)关于SEQIDNO∶11的信息(i)序列特征(A)长度252(B)类型核酸(C)股数单股(D)拓扑结构未知
(2)关于SEQIDNO∶13的信息(i)序列特征(A)长度68(B)类型氨基酸(C)股数(D)拓扑结构未知(xi)序列图谱SEQIDNO∶13
(2)关于SEQIDNO∶14的信息(i)序列特征(A)长度51(B)类型氨基酸(C)股数(D)拓扑结构未知(xi)序列图谱SEQIDNO∶14Glu Pro Asp Glu Ile Cys Arg Ala Arg Met Thr Asn Lys Glu Phe151015Thr Tyr Lys Ser Asn Val Cys Asn Gly Cys Gly Asp Gln Val Ala202530Ala Cys Glu Ala Glu Cys Phe Arg Asn Asp Val Tyr Thr Ala Cys354045His Glu Ala Gln Lys NH250
权利要求
1.一种杀虫有效肽，及其农业上或园艺学上可接受的盐，其特征在于a)长度约51个氨基酸；b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基；c)80%序列与SEQIDNO∶3所限定的肽同源。
2.按权利要求1所述的肽，其特征在于该肽来自隅蛛属(Tegenaria)蜘蛛。
3.按权利要求2所述的肽，其特征在于蜘蛛的种为Tegenariaagrestis。
4.按权利要求1所述的肽，其特征在于具有SEQ ID NO∶3中限定的序列。
5.按权利要求1所述的肽，其特征在于具有SEQ ID NO∶9中限定的序列。
6.按权利要求1所述的肽，其特征在于具有SEQ ID NO∶14中限定的序列。
7.按权利要求1所述的肽，其进一步特征在于具有如Seq ID NO∶6中限定的信号序列。
8.按权利要求7所述的肽，其特征在于具有SEQ ID NO∶4中限定的序列。
9.按权利要求7所述的肽，其特征在于具有SEQ ID NO∶10中限定的序列。
10.按权利要求7所述的肽，其特征在于具有SEQ ID NO∶13中限定的序列。
11.具有SEQ ID NO∶6中限定的氨基酸序列的信号序列。
12.包含编码杀虫有效肽的DNA序列的一个DNA序列，其特征在于a)长度约51个氨基酸;b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基;c)80%序列与SEQ ID NO∶3中限定的肽同源。
13.按权利要求12所述的DNA序列，其特征在于肽的来源是隅蛛属蜘蛛。
14.按权利要求13所述的DNA序列，其特征在于肽的来源是蜘蛛Tegenaria agrestis。
15.按权利要求12所述的DNA序列，其特征在于肽具有如SEQ ID NO∶2中限定的序列。
16.按权利要求12所述的DNA序列，其特征在于肽具有如SEQ ID NO∶8中限定的序列。
17.按权利要求12所述的DNA序列，其特征在于肽具有如SEQ ID NO∶12中限定的序列。
18.DNA序列，其特征在于肽进一步具有如SEQ ID NO∶6中限定的信号序列的特征。
19.按权利要求18所述的DNA序列，其特征在于肽具有如SEQ ID NO∶1中限定的序列。
20.按权利要求18所述的DNA序列，其特征在于肽具有如Seq ID NO∶7中限定的序列。
21.按权利要求18所述的DNA序列，其特征在于肽具有如Seq ID NO∶11中限定的序列。
22.DNA序列，其特征在于是编码SEQ ID NO∶6中限定的信号序列的DNA序列。
23.包含编码杀虫有效肽的DNA序列的重组体表达载体，其特征在于所述肽为a)长度约51个氨基酸;b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基;c)80%序列与SEQ ID NO∶3所限定的肽同源，其中载体能引起所述编码序列在转化细胞中的表达。
24.包含编码杀虫有效肽的DNA序列的转基因植物，其特征在于所述肽为a)长度约51个氨基酸;b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基;c)80%序列与SEQ ID NO∶3所限定的肽同源，其中所述的DNA被引入所述植物的种系或所述植物的祖代(ancestor)，以至通过所述植物经有性繁殖或无性繁殖的相继传代，将所述DNA序列的表达性状遗传下来。
25.能够在宿主或宿主昆虫细胞中表达编码杀虫有效肽的DNA序列的重组杆状病毒表达载体，其特征在于所述肽为a)长度约51个氨基酸;b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基;c)80%序列与SEQ ID NO∶3所限定的肽同源。
26.制备具有如下特征的杀虫有效肽的方法a)长度约51个氨基酸;b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基;c)80%序列与SEQ ID NO∶3所限定的肽同源，该方法包括a)掊养重组宿主细胞，其中在所述宿主细胞中转化或转染的重组表达载体具有编码所述肽的DNA序列，其中载体能引起所述编码序列在转化细胞中的表达;b)从重组宿主细胞培养物中回收所述杀虫有效肽。
27.由权利要求26所述方法制备的重组产生的肽。
28.控制无脊椎害虫的方法，其特征在于使所述害虫与具有如下特征的有效量的肽接触a)长度约51个氨基酸;b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基;c)80%序列与SEQ ID NO∶3所限定的肽同源。
29.控制无脊椎害虫的方法，其特征在于使所述害虫与能在所述害虫上表达有效量肽的重组杆状病毒相接触，所述肽的特点为a)长度约51个氨基酸;b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基;c)80%序列与SEQ ID NO∶3所限定的肽同源。
30.杀虫组合物，其特征在于包括有如下特点的杀虫有效量肽a)长度约51个氨基酸;b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基;c)80%序列与SEQ ID NO∶3所限定的肽同源及其农业上或园艺学上可接受的盐，在其农业上或园艺学上可接受的载体中。
31.一种抗体，其特征在于对具有如下特点的肽a)长度约51个氨基酸;b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基;c)80%序列与SEQ ID NO∶3所限定的肽同源在实质上有免疫活性。
32.一种DNA探针，其特征在于得自编码具有如下特点a)长度约51个氨基酸;b)在6、22、25、32、36和45位上有6个半胱氨酸残基;c)80%序列与SEQ ID NO∶3所限定的肽同源的杀虫有效肽的DNA序列。
33.连接于标记物或载体上的权利要求1所述的肽。
34.连接于标记物或载体上的权利要求12所述的DNA。
全文摘要
本发明提供一类可从隅蛛属蜘蛛毒液中分离出来的杀虫有效肽类、编码这些杀虫有效肽的DNA，及控制无脊椎害虫的方法。
文档编号C07K16/00GK1074936SQ93101140
公开日1993年8月4日 申请日期1993年1月22日 优先权日1992年1月24日
发明者卡伦J·克拉普科, 约翰R·H·杰克逊, 贾尼丝H·约翰逊, 埃里克G·德尔马 申请人:Fmc有限公司, Nps药品股份有限公司