专利名称：硫醚类轭合物的制作方法
将细胞毒药物连接到抗体上的双功能化合物是已知的。这些化合物尤其可用于构成对准肿瘤结合抗原的免疫轭合物。该免疫轭合物可以选择性输送有毒药物到达肿瘤细胞(例如参见Hermentin和Seiler，“Investigations With Monoclonal Antiboby Drug Conjugates”，Behring Insti.Mitl.82∶197～215(1988);Gallego等，“Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates With Anti-Tumor Activity”，Int.J.Cancer 33∶737-44(1984);Arnon等，“In Vitro and In Vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin With Anti-Tumor Antibodies”，Immunolgical Rev.62∶5～27(1982))。
Greenfield等近来报道了含有酰肼化合物3-(2-吡啶基二硫)丙酰基酰肼的、通过酰腙键结合到蒽环分子13位的酮上，并且该蒽环衍生物与抗体分子结合的对酸敏感的免疫轭合物的构成(Green-field等，欧洲专利公布号0328147，1989年8月16日公布，该专利对应于未决的美国专利系列号70/270，509，1988年11月16日申请，美国专利系列号07/155，181，1988年2月11日申请，现已放弃)。上述后面的参考文献还公开了具体的含硫醚的连接物和轭合物，包括含有腙硫醚的免疫轭合物。
Kaneko等(美国专利系列号07/522，996，1990年5月14日申请，该专利对应于欧洲专利公布号0，457，250，公布日期1991年11月21日)还公开了含有蒽环抗菌素的轭合物的构成在蒽环分子的C-13位上通过酰腙键连有双功能的连接物。在他们的发明中，连接物含有活性的吡啶基二硫或邻硝基苯基二硫基团，连接物通过这些基团与连接到细胞活性配位体上的合适基团反应，生成完整的轭合物。
提供在靶枪和药物分子之间含有对酸敏感键的另外化合物用于体内治疗是有用的。因此，本发明提供了治疗上有效的药物分子与能够识别选择性靶细胞群体的配位体键合的新化学。然后，可应用该连接物化学来制备治疗上有效的轭合物。本发明还提供了含有该轭合物的组合物、制备本发明轭合物的方法、治疗或预防有选择的疾病的方法，该方法包括给病人服用本发明的轭合物，本发明还提供了制备还原抗体的新方法，该还原的抗体可作为靶枪配位体用于制备本发明的轭合物。
按照本发明，每个药物分子均经过含硫醚的连接物臂连接配位体。药物是通过酰腙键连接连接物。通过配位体上或连接配位体的短的“隔离基团”上的巯基与“迈克尔加成接受体”反应(在反应之后变成“迈克尔加成加合物”)，生成硫醚键。在较好的具体实例中，靶枪配位体通过共价硫醚键直接地连接在连接物上。
上述新的轭合物具有通式(Ⅰ)，
其中D为药物部分，n为1～10，p为1～6，Y为氧或NH+2Cl-，Z为零或1，q为约1～10，x为配位体，A为迈克尔加成加合物部分。
在一个具体实例中，药物部分为蒽环抗菌素，配位体为抗体。
在较好的具体实例中，蒽环化合物13位酮通过酰腙键使蒽环化合物与轭合物的连接物部分结合。在尤其好的具体实例中，上述连接通过还原的二硫化物基团进行(即游离的巯基(-SH)在抗体上)。
在最好的具体实例中，蒽环药物部分为阿霉素，迈克尔加成接受体(由该接受体生成迈克尔加成加合物)为马来酰亚氨基，抗体部分为嵌合的抗体。
本发明的轭合物既保留了选择性处理靶细胞群体的特性，也保留了治疗活性。它们可用于药物组合物，例如该组合物含有药学上有效剂量的式(Ⅰ)化合物以及药用载体、稀释剂或赋形剂。
图1(a)提供了应用SPDP作为巯基化剂制备巯基化抗体的合成反应式。
图1(b)提供了制备本发明免疫轭合物的合成反应式，其中配位体为SPDP-巯基化的抗体。
图1(c)提供了制备本发明免疫轭合物的合成反应式，其中配位体为亚氨基四氢噻吩-巯基化的抗体。
图2表示用DTT还原抗体以制备“宽松的”抗体和合成本发发明免疫轭合物的方法。
图3提供了本发明的BR64-阿霉素轭合物对L2987肿瘤的体外细胞毒活性数据。
图4提供了本发明的BR64-阿霉素轭合物对L2987肿瘤的体内细胞毒活性数据。
图5提供了应用BR64、阿霉素和未结合的配合物(SN7-阿霉素)进行组合治疗的体内细胞毒数据的比较。
图6提供了本发明的蛙皮素-阿霉素轭合物对H345肿瘤的细胞毒活性数据。
图7提供了宽松的嵌合BR96和SPDP-巯基化的嵌合BR96的阿霉素轭合物体外的细胞毒活性数据。
图8提供了宽松的BR64和宽松的嵌合L6的阿霉素轭合物对L2987肿瘤的体内细胞毒活性数据。
图9～11提供了与游离的阿霉素和未结合的配合物相比，宽松的嵌合BR96的阿霉素轭合物对L2987肿瘤的体内细胞毒活性数据。
图12提供了宽松的嵌合BR96的阿霉素轭合物对MCA7人乳房肿瘤的体内细胞毒活性数据。
图13提供了宽松的嵌合BR96的阿霉素轭合物对RCA人结肠肿瘤的体内细胞毒活性数据。
图14为在惰性气流下于宽松的抗体制剂中，以DTT与抗体的摩尔比为函数对-SH滴定度的影响图。
下面详细地进行叙述，以便可以更充分地理解本发明。
本发明提供了新的药物轭合物，它包括能够对准经选择的细胞群体的配位体、药物和含有硫醚的连接配位体和药物的连接物。药物通过酰腙键连接到连接物上。在较好的具体实例中，配位体通过硫醚键直接连接到连接物上。该键一般是通过配位体上或间隔基团(例如由下述的SPDP或亚氨基四氢噻吩化学得到)上的活性巯基(-SH)与迈克尔加成接受体反应产生。
本发明还提供了制备所述药物轭合物和药用组合物的方法，以及输送轭合物到靶细胞的方法，其中生物技术进行修饰是需要的，本发明的轭合物和药用组合物可用于例如治疗疾病如癌、病毒或其他致病性感染、自身免疫疾病或其他疾病。
所述轭合物包括至少一种药物分子，该药物分子通过本发明的连接物连接到对所要求的靶细胞群体是活性的靶枪配位体分子上。配位体分子可以是免疫活性的蛋白质，如抗体或其片段、非免疫活性的蛋白质或肽配位体如蛙皮素或识别有关细胞受体的结合配位体如外源凝集素或甾族化合物分子。
如以上所述，本发明的轭合物可以用通式(Ⅰ)表示，
其中D为药物部分，
n为1～10，p为1～6，Y为氧或NH+2Cl-，Z为零或1，q为约1～10，x为配位体，A为迈克尔加成加合物部分。
为了更好地理解本发明，将药物和配位体逐一进行叙述。然后叙述用于制备轭合物的中间体和轭合物的合成。
药物熟悉本技术领域的专业人员明白，本发明需要用酰腙键通过迈克尔加成加合物和含硫醚的连接物将药物和配位体连接。本发明既不受具体药物的限制，也不受具体配位体的限制。本发明的连接物可以与具有所需治疗作用的、改进生物活性或预防作用的任何药物一起应用，但用于制备轭合物的该药物仅限于能形成腙键的药物。为了制备该腙，该药物最好有可用的活性羰基，如能形成腙(即-C＝N-NH-键)的活性醛或酮(以“[D-(C＝O)]”表示)。药物腙键这里以“[D]＝N-NH-”表示。此外，无论活性是作用在所需部位药物释放的结果，或是整个轭合物本身作用的结果，可用的活性基团与连接物的反应必须不破坏轭合物最终的治疗作用。
熟悉本技术领域的专业人员懂得，对于缺少可用活性羰基的药物，可以用本技术领域已知的方法制备含有该羰基的衍生物。从所述衍生的药物制备的轭合物必须保持在作用部位的治疗活性，无论该活性是由于整体轭合物或是其他方面所致。另外，衍生的药物(例如前体药物)必须以药物治疗上有效的形式作用于作用部位。
本发明的连接物可以用于连接基本上所有种类的治疗药物，例如抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗癌药物、抗支原体剂等。上述构成的药物轭合物可有效地用于通常的目的，虽然相应的药物用于该目的是有效的，但由于配位体具有固有的输送药物到所需细胞位置的能力(这是特别有利的)，因此所述药物轭合物具有更优良的效果。
此外，由于本发明的轭合物可用于改进的已知的生物反应，因此药物部分不应看作限于经典的化学治疗药物。例如该药物部分可以是具有所需生物作用的蛋白质或多肽。所述蛋白质可以包括例如毒素(如红豆毒素、蓖麻毒A、假单胞菌属外毒素或白喉毒素);蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板诱生的生长因子、组织血浆酶原激活剂;或生物反应变更因子如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
用于本发明的较好的药物是细胞毒药物，特别是用于治疗癌的细胞毒药物。一般来讲，所述药物包括烷化剂、抗增殖剂、微管蛋白结合剂等。较好的细胞毒药物包括蒽环类药物、长春花类药物、丝裂霉素类、博莱霉素类、细胞毒核苷类、蝶啶类药物、diynenes和鬼臼毒类。上述各类中特别有效的包括例如阿霉素、洋红霉素、柔红霉素、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲蝶呤、二氯甲氨蝶呤、丝裂毒素C、甲基丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，如表鬼臼吡喃葡萄糖甙或鬼臼吡喃葡萄糖甙磷酸酯、苯丙氨酸氮芥、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春碱酰胺、环氧长春碱等。如以上所述，熟悉本技术领域的专业人员可以进行化学改变，制得所需的化合物，以便使该化合物的反应更适合制备本发明轭合物的目的。
优先选择用作本发明药物的细胞毒药物包括下式化合物，甲氨蝶呤(式2)
其中R12为氨基或羟基，R7为氢或甲基，R8为氢、氟、氯、溴或碘，R9为羟基或形成羧酸盐的基团，丝裂毒素(式3)
其中R10为羟基或甲基，博莱霉素(式4)
其中R11为羟基、氨基、C1～C3烷氨基、二(C1～C3烷基)氨基、C4～C6聚亚甲基氨基、
苯丙氨酸氮芥(式5)
6-巯嘌呤(式6)
阿糖胞苷(式7)
鬼臼毒素(式8)或其磷酸盐
其中R13为氢或甲基，R14为甲基或噻吩基，长春花生物碱类药物(式9)
其中R15为H、CH3或CHO，当R17和R18独立地存在时，R18为H，R16和R17中之一为乙基，另一个为H或OH;当R17和R18与它们所连接的碳一起形成环氧乙烷环时，则R16为乙基;
R19为氢、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO，二氟核苷(式10)
其中R21为下式之一的碱基，
其中R22为氢、甲基、溴、氟、氯或碘，R23为-OH或-NH2，R24为氢、溴、氯或碘，蒽环类抗菌素(式11)
其中R1为-CH3、-CH2OH、-CH2OCO(CH2)3CH3或-CH2OCOCH(OC2H5)2，R3为-OCH3、-OH或-H，R4为-NH2、-NHCOCF3、4-吗啉基、3-氰基-4-吗啉基、1-哌啶基、4-甲氧基-1-哌啶基、苄胺、二苄胺、氰基甲胺或1-氰基-2-甲氧基乙胺，R5为-OH、-OTHP或-H，R6为-OH或-H，条件是当R5为-OH或-OTHP时，R6不是-OH。
最好的药物是以上所述的蒽环类抗菌素(式11)。熟悉本技术领域的专业人员懂得，上述结构式包括作为药物的化合物，或者是药物的衍生物，它们在本技术领域具有各种未注册的名称或俗名。下表Ⅰ表示一些蒽环类药物以及它们的未注册名称或俗名，这些药物特别优先选用于本发明中。
表Ⅰ所示化合物中，最好的药物是阿霉素。阿霉素(本申请中也称为“ADM”)是式(11)蒽环化合物，其中R1为-CH2OH，R3为-OCH3，R4为-NH2，R5为-OH，R6为-H。
配位体熟知本技术领域的专业人员懂得“配位体”所包括的范围，它包括能与某种特定靶细胞群体有关的受体或其他易于接受部分特异性结合、或反应性地缔合或络合的任何一种分子。这种细胞活性分子可以是能够与所述细胞群体结合或络合或反应的任何一种分子。而这种细胞群体通常是试图需要进行治疗或者生物学上需要修饰的细胞，药物能够通过轭合物中的连接物与上述细胞活性分子连接，所述细胞活性分子具有游离的活性巯基(-SH)，或者它能够被改变为含有所述巯基。这种细胞活性分子的作用是把治疗上有效的药物输送到配位体能够与之反应的特定的靶细胞群体。这种分子包括(但不限于)大分子量的蛋白质(通常大于10，000道尔顿)如抗体，较小分子量的蛋白质(通常小于10，000道尔顿)，多肽或肽配位体，以及非肽基配位体。
能够用于形成本发明轭合物的非免疫活性蛋白质、多肽或者肽配位体，可以包括(但不限于)铁传递蛋白、表皮生长因子(EGF)、蛙皮素、促胃液激素、促胃液激素释放的肽、血小板诱生的生长因子、IL-2、IL-6、肿瘤生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β、牛痘生成因子(VGF)、胰岛素生成因子及类胰岛素生成因子Ⅰ和Ⅱ。非肽基配位体可以包括甾族化合物，糖和外源性凝集素等。
免疫活性配位体由识别抗原的免疫球蛋白(也称为“抗体”)及识别抗原的片段组成。特别好的免疫球蛋白是能够识别肿瘤结合抗原的免疫球蛋白。这里所说的“免疫球蛋白”可以指所有公认的免疫球蛋白类和亚类，例如IgG，IgA，IgM，IgD或IgE。较好的免疫球蛋白是IgG类免疫球蛋白。免疫球蛋白能够从任何物种诱生出。但最好是来源于人、鼠或兔的免疫球蛋白。此外，免疫球蛋白可以是多克隆的或者单克隆的，最好是单克隆的。
正如我们已注意到，熟悉本技术领域的专业人员明白，本发明还包括识别抗原的免疫球蛋白片段的应用。这些免疫球蛋白片段可以包括Fab′、F(ab′)2、Fv或Fab片段，或其他一些识别抗原的免疫球蛋白片段。这些免疫球蛋白片段可以通过蛋白水解酶消化(例如可以用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化)、还原烷基化法或基因重组技术进行制备。制备这些免疫球蛋白片段的材料和方法，对于熟悉本技术领域的专业人员是熟知的。通常可参阅以下文献Parham，J.Immunology，131，2895(1983);Lamoyi等，J.Immunological Methods，56，235(1983);Parham，同上，53，133(1982);和Matthew等，同上，50，239(1982)。
免疫球蛋白可以是“嵌合的抗体”，该术语在本专业技术中已被确认。同样，免疫球蛋白也可以是“双功能的”，或者“杂种的”抗体，也就是说，抗体可以是具有一条臂对一种抗原位点(例如对某种肿瘤结合抗原)具有特异性，而另一条臂能识别另一种不同的靶，例如半抗原，这种半抗原本身可以对抗原携带的肿瘤细胞是一种致死性药物，或者这种半抗原与对该抗原携带的肿瘤细胞有致死性的药物相连接。另外，所述双功能抗体可以是其中每一条臂对需治疗或进行生物学修饰的某种细胞的肿瘤结合抗原的一个不同的抗原决定簇具有特异性。总之，这种杂种抗体具有双重特异性，最好是具有一个或多个对某种选定的半抗原有特异性的结合位点，或者具有一个或多个对某种靶抗原有特异性的结合位点，这种靶抗原包括例如与肿瘤细胞结合的抗原、传染性微生物携带的抗原，或者引起其他疾病的抗原。
生物双功能抗体在专利文献中已有介绍，例如欧洲专利公布号0105360中，熟悉本技术领域的专业人员可参考该文献。正如已经提到过的，该杂种抗体或双功能抗体可以通过生物学方法，借助于细胞融合技术诱导产生、或者通过化学方法，特别是借助于交联剂或形成二硫化物桥的试剂来得到，并且还可以构成整个抗体和/或它们的片段。得到所述杂种抗体的方法已经公开，例如见专利合作条约国际申请83/03679，公布于1983年10月27日，以及已公布的欧洲专利申请0217577，公布于1987年4月8日。本申请中已收入这二篇专利作为参考文献。特别好的双功能抗体是通过生物学方法从“polydoma”或“quadroma”制备得到的双功能抗体，或者是用如双-(马来酰亚氨基)-甲基醚(“BMME”)或专业人员熟悉的其他交联剂通过化学合成方法得到的双功能抗体。
此外，免疫球蛋白可以是一个单链抗体(“SCA”)。它们可以由单链Fv片段(“SCFv”)组成，该片段中可变轻链区(“VL”)和可变重链区(“VH”)之间，是通过一个肽桥或借助于二硫化物链连接的。并且，免疫球蛋白也可以由具有抗原结合活性的单一的VH区(dAbs)组成。例如可参见G.Winter和C.Milstein，Nature，349，295(1991);R.Glockshuber等，Biochemistry 29，1362(1990);E.S.Ward等，Nature 341，544(1989)。
用于本发明中特别好的是嵌合的单克隆抗体，特别是对肿瘤结合抗原具有特异性的嵌合抗体。正如本文中所示，术语“嵌合的抗体”是指单克隆抗体，构成这种单克隆抗体的可变区(即结合区)，具有同一来源或来自同一物种，并且其稳定区至少有一部分具有不同来源或来自不同的物种，这种嵌合的单克隆抗体通常是借助DNA重组技术制备的。由鼠可变区和人稳定区构成的嵌合抗体，在本发明的某些应用中是特别好的，尤其是用于人疾病的治疗，因为这种抗体容易被制备，并且与纯的鼠单克隆抗体相比具有更小的免疫原性。这种鼠/人嵌合抗体是免疫球蛋白基因的表达产物，这种基因由编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码人免疫球蛋白稳定区的DNA片段构成。本发明所包括的其他形式的嵌合抗体是其类或亚类已被修饰或改造的不同于原先的抗体。这种“嵌合”的抗体也称为“类一夹心抗体”。制备嵌合抗体的方法包括目前本技术领域已熟知的常规的DNA重组和基因转染技术。参见例如Morrison，S.L.等，Proc.Nat′l Acad Sca.，81，6851(1984)。
术语“嵌合的抗体”的函义包括“人属性化抗体”的概念，与亲本免疫球蛋白相比，其结构框架或“互补性决定区”(“CDR”)已被修饰为包括具有不同特性的免疫球蛋白的CDR。在较好的具体实例中，鼠互补性决定区(CDR)被移殖到人抗体的结构框架之中，其目的是制备“人属性化抗体”。参见例如L.Riechmann等，Nature332，323(1988);M.S.Neuberger等，Nature 314，268(1985)。特别好的互补性决定区是与嵌合和双功能抗体识别上述抗原的代表性程序相符合。读者参见欧洲专利申请0239400(1987年9月30日公布)中有关CDR修饰抗体的论述。它已被收编在本申请中作为参考。
熟悉本专业的人员都将认识到，双功能一嵌合的抗体可以被制备出，这种抗体不但具有嵌合抗体或人属性化抗体的较低免疫原性的优点，并且具有上述双功能的适应性，特别是针对治疗性处理。可以人工合成上述双功能一嵌合的抗体，例如可用交联剂通过化学合成的途径制备，和/或应用上述类型重组技术制备。无论如何也不应该认为本发明局限在用任一具体方法生产抗体的范围，不论这种抗体是双功能抗体，嵌合抗体，双功能一嵌合抗体，人属性化抗体，或者是识别抗原的片段或其衍生物。
此外，本发明范围内还包括与某些活性蛋白质融合的各种免疫球蛋白(如上面已经确定的)或者免疫球蛋白片段，这种活性蛋白质可以是Neuberger等(专利合作条约国际申请86/01533，已于1986年3月13日公布)公开的某种类型的酶。这些产品的有关资料也收入在本申请中作为参考。
已经注意到，“双功能抗体”，“融合抗体”，“嵌合抗体”(包括人属性化的嵌合抗体)和“双功能一嵌合抗体”(包括人属性化的双功能一嵌合抗体)，就其单独而言，其结构也包括各种识别抗原片段组成的结构。熟悉本项技术的专业人员还会认识到，所述片段可以用传统的酶切方法制备，即对完整的双功能抗体，嵌合抗体，人属性化抗体或嵌合一双功能抗体进行酶切。但是，如果由于结构性质的原因，这些完整的抗体对这种酶切不敏感，那么上述结构片段可以通过用作起始物的免疫球蛋白片段来制备;或者如果应用基因重组技术，其DNA序列本身可被修整编码成所需要的“片段”，这种片段在表达时，可以在体内或体外应用化学或生物学的方法，制备成最终所需要的完整的免疫球蛋白“片段”。因此，在这方面使用了术语“片段”一词。
此外，如上所述，本发明中使用的免疫球蛋白(抗体)或其片段，就其性质来说，可以是多克隆的，也可以是单克隆的。但是，最好使用单克隆抗体。制备所述多克隆抗体或单克隆抗体的方法，现在对于本专业技术人员是熟知的，当然他们完全能够制备出可用于本发明的有效的各种免疫球蛋白。例如参见G.Kohler和C.Milstenin，Nature 256，495(1975)。此外，杂种体和/或由该杂种体产生并用于本发明实践的单克隆抗体，可方便地从下列来源得到，例如American Type Culture Collection(“ATCC”)12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，或者可以从Boehringer-Mannheim Biochemicals，P.O.Box 50816，Indianapolis，Indiana46250买到。
用于本发明的特别好的单克隆抗体是能识别肿瘤结合抗原的单克隆抗体。但是并不局限于此，并可以包括下列多种单克隆抗体，例如被识别的抗原位点 单克隆抗体 参考文献肺癌 KS1/4 N.M.Varki等,Cancer Res.44:681,1984.
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Turp-27肾癌 A6H,D5D P.H.Lange等,Surgery,98:143,1985.
在最好的具体实例中，含有轭合物的配位体是从嵌合的抗体BR96得到的，在U.S.Ser.No.07/544，246(申请日期1990年6月26日)中已公开了Chi BR96，该专利与专利合作条约国际申请91/00295(1991年1月10日公开)对应。嵌合的抗体BR96(Chi BR96)是内在化的鼠/人嵌合抗本，并且正如已注意到的，它与墨角藻糖基化的Lewis Y抗原有反应活性，而这种Lewis Y抗原是通过人肿瘤细胞(例如从乳腺癌、肺癌、结肠癌和卵巢癌得到的肿瘤细胞)表达的抗原。表达嵌合抗体BR96的，并被选定为Chi BR96的杂种体已经于1990年5月23日按布达佩斯协议存入美国标准菌种保藏所(“ATCC”)，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852。这种杂种体的样品可以根据其登记号ATCC HB 10460得到。嵌合抗体BR96的一部分可以从其源亲本抗体BR96得到。表达抗体BR96的杂种体也已经于1989年2月21日按布达佩斯协议存入ATCC，并从登记号HB 10036可以获取。培养所希望的杂种体，产生的抗体可以用本技术领域专业人员熟知的一般技术从培养细胞的上清液中分离出。参见例如“Monoclonal Hybridoma AntibodiesTechniques and Applica tions”，Hurell编辑，CRC印刷，1982。
在另一个十分好的具体实例中，免疫复合物是来自BR64鼠单克隆抗体，该单克隆抗体已经在如下专利中公开U.S.Ser.Nos.07/289，635(申请日期1988年12月22日)，以及07/443，696(申请日期1989年11月29日)，它对应于欧洲专利公布的申请0375562(1990年6月27日公布)。如上所述，上述抗体也是内在化的，并且该抗体与来自人结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌的肿瘤细胞表达的Lewis Y抗原有反应活性。表达抗体BR64的，并称为BR64的杂种体，已经于1988年11月3日按布达佩斯协议存入ATCC，可以根据登记号HB 9895得到。培养这种杂种体，所希望的抗原可以用本技术领域专业人员熟知的一般技术分离出。参阅上述所列出的文献。
在第三个十分好的具体实例中，本发明的免疫轭合物是来自鼠单克隆抗体L6，在如下专利中已经公开了这种单克隆抗体U.S.Patent Nos.4，906，562，已于1990年3月6日颁布，以及4，935，495已于1990年6月19日颁布。L6是非内在化抗体，它对神经节苷脂抗原具有活性，这种抗原是由人肿瘤细胞表达的抗原，而这种人肿瘤细胞则来源于人的非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌或卵巢癌等。表达单克隆抗体L6的，并称为K6的杂种体也已经按布达佩斯协议于1984年12月6日存入ATCC。根据登记号HB 8677可以获取。培养这种杂种体，参照上述文献中的一般技术，可以分离出所希望的抗体。如果需要，L6抗体的嵌合形式已经在U.S.Serial No.07/923，244中叙述，该专利与专利合作条约国际申请88/03145(1985年5月5日公布)对应。
1-氰基-2-甲氧基乙胺，R5为-OH、-OTHP或-氢，R6为-OH或-氢，条件是当R5为-OH或-OTHP时，R6不是-OH，n为整数1～10，R为迈克尔加成接受体。
用于本发明的最好的中间体为式(Ⅱc)化合物，
其中R1、R3、R4、R5和R6的定义同以上式(Ⅱb)。
也用作为本发明中间体的是含有自由的活性巯基的靶枪配位体。该巯基可以包含在原有的靶枪配位体内，或者可以由配位体或配位体衍生物直接地得到。在制备本发明轭合物较好的方法中，配位体或变化的配位体上的巯基可以直接地与式(Ⅱa)中间体迈克尔加成接受体反应，生成最终的轭合物。应用该方法，每个配位体一般可以连接约1～10个药物分子。因此，在式(Ⅰ)中，q可以为约1～10。
当轭合物生成时，迈克尔加成接受体变成本发明中应用的“迈克尔加成加合物”。因此，例如，正象本技术领域专业人员所了解的，如果式(Ⅱa)或(Ⅱb)化合物中的迈克尔加成接受体为马来酰亚氨基，那么最终轭合物式(Ⅰ)的“迈克尔加成加合物”部分将是琥珀酰亚氨基。因此，“迈克尔加成加合物”是指经迈克尔加成反应得到的有迈克尔加成接受体的部分，详见以下更详细的叙述。
因此，本发明更进一步的具体体现是提供制备以上定义的式(Ⅰ)化合物的方法，该方法包括使以上定义的式(Ⅱa)化合物与含有或经修饰或者衍生为含有活性巯基的配位体反应，如果需要，将产物进行分离。这是制备式(Ⅰ)化合物较好的方法。另外，式(Ⅰ)化合物可以由药物或经改变的药物与共价连接配位体、经修饰的配位体或衍生的配位体的酰基酰肼连接物部分直接地反应而制得。特别是本发明提供了制备式(Ⅰ)化合物的方法，
该方法包括(a)使式(Ⅱa)化合物与式(Ⅲ)化合物反应，
或者(b)使化合物[D-(C＝O)]与下式化合物反应，并且如果需要，将产物进行分离，
其中D、n、p、Y、Z、q、X、R和A的定义同上。
熟悉本技术领域的专业人员懂得，在合成本发明化合物中，当所需要的反应在分子的其他部位进行时，需要保护或封闭起始化合物和中间体上的各种活性官能团。在所需要的反应完成之后或者在任一所要求的时候，通常需将上述保护基用例如水解或氢解法脱去。所述保护或脱保护步骤在有机化学中是常用的。关于在制备本发明化合物中有用的保护基，熟悉本技术领域的专业人员可参阅Protec-tive Groups in Organic Chemistry，Mcomie编辑，Plenum Press，N.Y.，N.Y.(1973);Protective Groups in Organic Synthesis，Greene编辑，John Wiley&Sons，纽约(1981)。
举例来说，有用的氨基保护基可以包括例如C1～C10链烷酰基，如甲酰基、乙酰基、二氯乙酰基、丙酰基、己酰基、3，3-二乙基己酰基、γ-氯丁酰基等;C1～C10烷氧基羰基和C5～C15芳氧基羰基，如叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基和肉桂酰氧基羰基;卤素-(C1～C10)烷氧基羰基，如2，2，2-三氯乙氧基羰基;以及C1～C15芳烷基和链烯基，如苄基、苯乙基、烯丙基和三苯甲基等。其他通常应用的氨基保护基是与β-酮-酯如甲基或乙基乙酰基乙酸酯制得的烯胺形式。
常用的羧基保护基可以包括例如C1～C10烷基，例如甲基、叔丁基、癸基;卤素-C1～C10烷基，如2，2，2-三氯乙基和2-碘乙基;C5～C15芳烷基，如苄基、4-甲氧基苄基、4-硝基苄基、三苯基甲基、二苯基甲基;C1～10链烷酰氧基甲基，如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基等;以及例如苯甲酰甲基、4-卤素苯甲酰甲基、烯丙基、二甲基烯丙基、三(C1～C3烷基)甲硅烷基如三甲基甲硅烷基、β-对甲苯磺酰基乙基、β-对硝基苯基-硫乙基、2，4，6-三甲基苄基、β-甲基硫乙基、邻苯二甲酰亚氨基甲基、2，4-二硝基苯基亚磺酰基、2-硝基二苯甲基以及有关的基团。
同样，有用的羟基保护基可以包括例如甲酰基、氯乙酰基、苄基、二苯甲基、三苯甲基、4-硝基苄基、三甲基甲硅烷基、苯甲酰甲基、叔丁基、甲氧基甲基、四氢吡喃基等。
一般来讲，含有中间体迈克尔加成接受体的腙药物衍生物(式(Ⅱa)、(Ⅱb)或(Ⅱc))可以根据所应用的迈克尔加成接受体，按方法A中叙述的通法，通过药物(或衍生的药物)与含有酰肼的迈克尔加成接受体反应制得方法A
如以下所述，当迈克尔加成接受体为马来酰亚氨基时，方法A是较好的方法。
另外，式(Ⅱa)化合物可以按方法B所述的通法，通过药物与酰肼反应，生成中间体腙药物衍生物，接着使该化合物与含有迈克尔加成接受体的部分反应，方法B
在方法A和方法B中，D、n和R的定义同前。在方法B中，L代表能进行亲核取代的离去基团，如卤素、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，而C代表可使迈克尔加成接受体R成为良好亲核试剂的基团。C所代表的特别有用的基团包括碱金属离子如Na+、K+或Li+。
本技术领域的专业人员懂得，“迈克尔加成接受体”是能够与亲核试剂反应的部分，以便经历为迈克尔加成反应所特有的亲核加成反应。加以上所述，在发生亲核加成以后，迈克尔加成接受体部分称为“迈克尔加成加合物”。
通常用于方法A的迈克尔加成接受体可以包括如α，β-烯酸或α，β-硫代酸，例如含有-C＝C-COOH、-C＝C-C(O)SH、-C＝C-C(S)SH或-C＝C-C(S)OH基团的化合物;α，β-烯酸酯或硫代烯酸酯，其中烷基部分不是甲基或乙基，例如含有-C＝C-COOR、-C＝C-C(S)OR、-C＝C-C(S)SR或-C＝C-C(O)-SR基团的化合物，这里R为除甲基或乙基之外的形成酯的基团;α，β-烯酰胺、酰亚胺、硫代酰胺和硫代酰亚胺(无论是环状的或非环状的)，例如含有-C＝C-CONR2、-C＝C-CONHCO-、-C＝C-CSNR2、-C＝C-CSNHCO-或-C＝C-CSNHCS-基团的化合物，无论是环状的或非环状的，并且其中-CONR2或-CSNR2代表伯、仲或叔酰胺或硫代酰胺;α，β-炔酸或硫代炔酸，例如含有-C≡C-COOH、-C≡C-C(S)OH、-C≡C-C(S)SH或-C≡C-C(O)-SR的化合物;α，β-炔酯，例如含有-C≡C-COOR、-C≡C-C(S)OR、-C≡C-C(S)SR或-C≡C-C(O)-SR的化合物，其中R为除甲基或乙基之外的形成酯的基团;α，β-烯腈，例如含有-C＝C-≡N的化合物;迈克尔加成活性的环丙烷衍生物，例如1-氰基-1-乙氧基羰基环丙烷
;溴化乙烯基二甲基锍，例如含有-C＝C-S+(Me)2Br-的化合物;α，β-烯砜，例如含有
的化合物;α，β-烯硝基化合物，例如含有-C＝C-NO2的化合物;α，β-烯鏻，例如含有
基团的化合物;含有基团如C＝C-C＝N的化合物，在芳香族杂环中有例如2-或4-乙烯基吡啶;或者是含有α，β-不饱和硫鏻离子的化合物，如
用于方法B的迈克尔加成接受体可以包括α，β-烯醛，例如含有-C＝C-CHO的化合物;α，β-烯酮，例如含有
的化合物;α，β-烯酯或硫代烯酯，例如含有-C＝C-COOR、-C＝C-C(S)OR、-C＝C-C(S)SR或-C＝C-C(O)-SR的化合物，其中R为形成酯的甲基或乙基，例如
;α，β-炔醛或酮，例如含有-C＝C-CHO或-C≡C-CO-的化合物;α，β-炔酯或硫代炔酯，例如甲基或乙基作为酯的烷基部分，例如含有-C≡C-COOR、-C≡C-C(S)OR、-C≡C-C(O)SR或-C≡C-CSSR的化合物，其中R为形成酯的甲基或乙基。
熟悉本技术领域的专业人员对可用于本发明的其他迈克尔加成接受体是熟悉的。对于一般的迈克尔加成反应的讨论，读者可参阅E.D.Bergman，D.Ginsberg和R.Pappo，Org.React.10，179～555(1959);和D.A.Oare和C.H.Heathcock，Topics in Stereo-chemistry，Vol.20，E.L.Eliel和S.H.Wilen编辑，John Wiley和Sons，Inc.(1991)，以及其中所引的参考文献。
用于制备式(Ⅱa)、(Ⅱb)或(Ⅱc)中间体的准确的反应条件是取决于反应中所应用的药物和迈克尔加成接受体的特性。本发明最好的中间体为以上式(Ⅱc)所示，其中药物部分是蒽环药物，并且迈克尔加成接受体是马来酰亚氨基。如以前所述，关于该反应，可以应用上面所述的方法A。对于与配位体(巯基化的、修饰的或相反的情况)的反应，在最终轭合物中，中间体的马来酰亚氨基迈克尔加成接受体变成琥珀酰亚氨基(“迈克尔加成加合物”)。
固有地存在含有巯基的配位体(即配位体未修饰)，或者可以制备，例如(a)通过与巯基化剂如SMCC或N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(“SPDP”)反应，接着还原产物;(b)与亚氨基四氢噻吩(“IMT”)反应，使原有的配位体巯基化;(c)如果配位体(如蛋白质肽或多肽)不具有活性的、有用的巯基，那么加入含有巯基的氨基酸残基(如半胱氨酸残基)到该配位体上;(d)应用还原剂如二硫苏糖醇(“DTT”)还原原有分子中的二硫化物键。方法(d)是用于本发明轭合物中制备抗体分子中巯基最好的方法。
如果将巯基化试剂(例如SPDP或亚氨基四氢噻吩)用于制备本发明的轭合物，那么熟悉本技术领域的专业人员懂得，短的“间隔基团”残基将插在式(Ⅰ)轭合物中迈克尔加成接受体部分和配位体之间。在该情况下，式(Ⅰ)化合物中Z为1。在该情况下，其中配位体上游离的巯基可以直接地应用，例如应用DTT还原的配位体(特别是应用例如DTT制备“宽松的”抗体)，或者其中活性残基如半胱氨酸插入分子的配位体部分，那么式(Ⅰ)中Z为零，并且直接的硫醚键将存在于分子中结合的配位体与迈克尔加成部分之间。
为了形成轭合物，将巯基化的配位体或有自由活性巯基的配位体与含有迈克尔加成接受体的式(Ⅱa)腙进行反应。一般来讲，关于配位体、药物以及连接到配位体上所需药物的数目，必须选择反应条件。例如，熟悉本技术领域的专业人员懂得，连接到配位体上的药物分子的平均数目可以进行变化，通过(1)以轭合物的配位体上活性巯基的数目为基准，改变中间体药物-腙(式(Ⅱa))的量;或者(2)(a)例如仅部分地还原该配位体，改变配位体上活性巯基的数目(在蛋白质、肽或多肽情况下)，(b)引入有限数量的半胱氨酸残基到蛋白质、肽或多肽中，或(c)用少于最大量的巯基化剂如SPDP或亚氨基四氢噻吩，限制巯基化的程度。特别对于宽松的抗体来说，虽然-SH滴定度可以改变，但是自由巯基最好的数量是应用所述特定试剂可以得到的最大数目。-SH滴定度变化的程度在宽松的抗体步骤中可容易地控制。例如图14表明了在37℃反应1.5小时，DTT与配位体的摩尔比对抗体BR64和嵌合的抗体BR96的-SH滴定度的影响。熟悉本技术领域的专业人员懂得，不同种类或不同亚类的免疫球蛋白可以有不同数目的对试剂如DTT还原作用敏感的二硫化物桥。因此，在测定所需水平的轭合抗体或抗体片段中，更重要的是可用于还原为自由-SH基团的二硫化物基团的数量。但是，一般来说，按已知反应的平均值计算，较好的式(Ⅰ)轭合物是每个配位体分子有约1～10个红物分子。药物与配位体摩尔比(“MR”)尤其好的平均值是约4～8。
在轭合物的反应完成之后，可以将轭合物进行分离，并且通常已知的透析、层析和/或过滤方法进行纯化。通常可以将含有轭合物的最终溶液进行冷冻干燥，以便得到干燥、稳定形式的轭合物，该轭合物可以可靠地贮存和运输。为了服用，最终可以将冷冻干燥的产品用无菌水或其他合适的稀释剂重新进行配制。另外，在服用之前可以将最后的产品进行冷冻(例如用液氮进行冷冻)，解冻和温至室温。
在第一个较好的具体实例中，式(Ⅱa)蒽环腙可以通过蒽环与马来酰亚氨基-(C1～C10)-烷基酰肼或其盐反应制备。该反应已在上面方法A的叙述中概述。该反应一般按二步进行。第一步，制备马来酰亚氨基-(C1～C10)-烷基酰肼或其盐。用例如层析和/或结晶法纯化之后，使酰肼的游离碱或其盐与所需的蒽环或蒽环盐反应。反应溶液经浓缩后，收集含有马来酰亚氨基的腙反应产物(式Ⅱa)，并且如果需要，按一般的纯化方法进行纯化。
然后将式(Ⅱa)腙与上述含巯基的抗体进行反应。如果该抗体需巯基化，例如用N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(“SPDP”)，那么巯基化反应通常按二步进行(1)使抗体上游离的氨基与SPDP反应;(2)用DTT还原二硫化物SPDP，得到游离的-SH基团。在较好的方法中，步骤(1)的巯基化反应中SPDP/抗体摩尔比的范围为约7.5∶1～60∶1，这取决于所需的巯基数目，尤其对于BR64来说，较好的比例范围是约7.5∶1～约30∶1，对于BR96来说，较好的比例范围是约20∶1。反应在约0℃～50℃进行，并且最好的反应温度是约30℃。反应可以在pH范围约6～8之间进行，最好的pH是约7.4。步骤(2)中的还原反应最好用DTT进行，应用DTT/SPDP的摩尔比为约2.5∶1～10∶1。DTT/SPDP最好的摩尔比为5∶1，并且SPDP的摩尔数是加在反应步骤(1)中的摩尔数。反应通常在约0℃～40℃，最好在0℃进行，并且反应通常在约20分钟后完成。巯基化的配位体(在最好的具体实例中为抗体)溶液经透析和浓缩之后，测定配位体上巯基的摩尔浓度，并以配位体上活性巯基的摩尔量为基准，使巯基化的配位体与所需摩尔比的式(Ⅱa)腙衍生物进行反应。该比例至少为约1∶1较好。反应一般在约0℃～25℃，最好在约4℃进行。然后将得到的轭合物通过一般的方法进行纯化。该反应式见图1a和1b。
在第二个较好的具体实例中，按以上所述制备式(Ⅱa)腙。然后按图1c所示，使腙与预先用亚氨基四氢噻吩(“IMT”)巯基化的抗体进行反就。配位体(抗体较好)用IMT进行巯基化通常为一步反应。IMT/抗体的比例可以在约30∶1～80∶1，最好为50∶1。反应进行约30分钟～2小时，最好为约30分钟，pH为约7～9.5，最好为约9，温度为给20℃～40℃，最好为约30℃。然后使反应产物与式(Ⅱa)腙于约0℃～25℃，最好在约4℃，pH约7～9.5，最好为约7.4进行反应。然后用本技术领域一般的方法，例如透析、过滤或层析，将轭合物进行纯化。
在第三个尤其好的具体实例中，中间体腙(式Ⅱa)按上述方法进行制备。然后使该腙与配位体(最好是抗体)反应，其中至少一个二硫化物基团被还原形成至少一个巯基。尤其好的配位体是以下所述的“宽松的抗体”。制备游离巯基的较好的还原剂是DTT，但是熟悉本技术领域的专业人员明白，其他的还原剂也适用于本目的。
“宽松的”抗体是其中有一个或一个以上，较好的是三个或三个以上的二硫化物桥已被还原的抗体。宽松的抗体最好是其中至少有四个二硫化物桥被还原。在制备宽松的(即还原的)抗体较好的方法中，还原(尤其是用DTT还原)和反应产物的纯化是在没有氧存在的情况下，于惰性气流(例如在氮或氩气流)中进行。如以下详细叙述，该方法便于人们小心地控制还原的程度。因此，该方法使熟悉本技术领域的专业人员在任何时候均可以再制备所需还原程度的配位体，以及得到可用于制备本发明轭合物的游离的-SH数目。
在另一方法中，反应是在环境条件下进行，但是最好应用充分大量的还原剂(最好是DTT)，以便克服已还原的二硫化物键可能发生的重新氧化。在上述任一情况下，反应完成之后应尽快将产品进行纯化，并且最好在惰性气流如氩或氮气流下进行。但是制备含有游离巯基的配位体较好的方法是从反应液中排除大气中的氧。用两个方法中的任一方法制备的抗体称为“宽松的”抗体。但是应将得到的抗体尽快地用于以后的反应或贮存在避免与氧接触的条件下，并且最好在惰性气流下反应或贮存。
在从反应中排除氧(即反应最好在惰性气流下进行)的方法中，将配位体与摩尔过量的DTT一起温育约30分钟～4小时，最好约3小时。DTT/配位体的比例取决于所需的巯基数目，可以为约1∶1～20∶1，较好的是约1∶1～10∶1，最好是约7∶1～10∶1。对于在氧存在下的还原作用，DTT与配位体的比例范围为约50∶1～400∶1，较好的是约200∶1～300∶1。后者反应进行约1～4小时，较好的是1.5小时，反应温度在约20℃～50℃，较好的是约37℃。反应在pH约6～8，较好的是在7～7.5下进行。然后用一般的方法如透析、过滤和/或层析将产品进行纯化。较好的纯化方法是透析过滤法。为了防止-SH的再氧化，在纯化或贮存时最好将产物保持在惰性气流下，以便排除与氧接触。
熟悉本技术领域的专业人员明白，不同的配位体(尤其是抗体)对还原和/或再氧化作用具有不同程度的敏感性。因此，需要改变以上所述的还原作用的条件，以便得到如以上所述特定的还原配位体。此外，用于轭合物制备的还原抗体另外的制备方法，对于熟悉本技术领域的专业人员来说是明白的。因此，用于制备式(Ⅰ)轭合物的制得的还原配位体也包括在本发明中。
为了制备以上所述式(Ⅰ)轭合物，将已还原的抗体反应产物与式(Ⅱc)腙中间体反应。反应在惰性气流中于约0℃～10℃(最好在约4℃)和pH约6～8(最好约7.4)进行较好。应用一般的方法如透析、过滤或层析将免疫轭合物进行纯化。
本发明的另一具体实例是将式(Ⅱ)蒽环连接到带有游离巯基的配位体上。在该实例中，配位体是非抗体配位体，如蛙皮素。可以将巯基(例如半胱氨酸的残基部分)加到原有的蛙皮素分子上。蒽环通过腙部分连接含有迈克尔加成接受体的部分，然后使其与修饰的蛙皮素反应，以便生成式(Ⅰ)轭合物。再将该产物用一般的技术如透析、离心或层析进行纯化。
本发明另一具体体现是提供了治疗疾病或修饰生物功能的方法，该方法包括给需要处理的温血动物服用治疗上有效或修饰生物系统剂量的式(Ⅰ)轭合物。人们明白，应用的具体轭合物取决于需治疗疾病的情况或需修饰的生物系统。尤其是，熟悉本技术领域的专业人员能够选择具体的配位体和药物，制备对所需治疗的疾病或所需修饰的生物功能具有特异性的式(Ⅰ)轭合物。
本发明又一较好的具体体现是提供了治疗肿瘤疾病的方法，该方法包括给需要治疗的温血动物服用治疗上有效剂量的细胞毒轭合物式(Ⅰ)。用于本目的的特别好的轭合物是式(Ⅰa)免疫轭合物
其中n、p、q、Z、X、R1、R3、R4、R5和R6的定义同前。
上述后一具体体现的最好实例是下述式(Ⅰa)免疫轭合物，其中药物部分是阿霉素，配位体部分系选自BR64、BR96、L6、嵌合的BR64、嵌合的BR96、嵌合的L6及其识别抗原的片段。该实例最好的配位体是嵌合BR96，尤其是宽松的嵌合BR96及其识别抗原的片段。
本发明的轭合物以药用组合物的形式给患者服用，该药用组合物包括式(Ⅰ)轭合物和药学上适用的载体、赋形剂或稀释剂。所用的“药学上适用的”是指用于温血动物治疗或诊断的试剂，温血动物包括例如人、马、猪、牛、鼠、犬、猫或其他哺乳动物，以及鸟或其他温血动物。较好的服用方式是非经胃肠道给药(特别是静脉注射、肌内注射、皮下注射、腹膜内注射或淋巴内注射。所述组合物可以用本技术领域专业人员熟知的载体、稀释剂或赋形剂进行制备。有关方面请参阅e.g.Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，1980，Mack出版公司，由Osol等编辑。该组合物可以包括蛋白质，如血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲剂或缓冲物质如磷酸盐、其他的盐或电解质等。合适的稀释剂可以包括例如无菌水、等渗盐水、稀葡萄糖水溶液、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)或这些醇的混合液等。该组合物可以含有防腐剂如苯乙醇、羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、乙基汞硫代水杨酸等。如果需要，组合物可以含有0.05～约0.20%(重量)的抗氧化剂，如焦亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。
对于静脉注射给药，最好使制得的组合物给患者注射的剂量为0.01～1克所需轭合物。给患者注射的剂量为约0.2克～1克轭合物较好。本发明的轭合物在很大的剂量范围内是有效的，应用的剂量取决于如需治疗的疾病状况或需改变的生物作用、服用轭合物的方式、患者的年龄、体重和体况，以及由治疗医生确定的其他因素。因此，给任何某一患者服用的剂量必须根据各个情况进行确定。
熟悉本技术领域的专业人员明白，虽然在以下制备方法和实例中叙述了所用的具体试剂和反应条件，但是根据本发明精神和范围可以进行改变。因此，本发明提供了以下的制备方法和实例，以便进一步详细地叙述本发明。
制备实例12，5-二氯-2，5-二氧-1H-吡咯并-1-己酰肼和它的三氟乙酸盐(“马来酰来氨基己酰基酰肼”)将马来酰亚氨基己酸(2.11克，10毫摩尔)[见e.g.，D.Rich等，J.Med.Chem.，18，1008(1975);和O.Keller等，Helv.Chim.Acta，58，531(1975)]溶于无水四氢呋喃(200ml)中。溶液于氮气流下搅拌，冷却至4℃，并用N-甲基吗啉(1.01克，10毫摩尔)处理，随后滴加氯甲酸异丁酯(1.36克，10毫摩尔)的THF(10ml)溶液。5分钟后，滴加肼基甲酸叔丁酯(1.32克，10毫摩尔)的THF(10ml)溶液。反应混合物于4℃保持1/2小时，于室温保持1小时。蒸发溶剂，残余物在乙酸乙酯和水之间进行分配。有机层依次用稀HCl溶液、水和稀重碳酸盐溶液洗涤，经无水硫酸镁干燥，并蒸发溶剂。该物质经快速层析纯化，用二氯甲烷∶甲醇(100∶1-2)梯度溶剂系统进行洗脱。得到受保护的酰肼，产率70%(2.24克)。
于0℃～4℃将上述物质(545毫克，2.4毫摩尔)溶于三氟乙酸中并搅拌8分钟。于室温在高真空下除去三氟乙酸。残余物与乙醚一起研磨，得到马来酰亚氨基己酰基酰肼三氟乙酸盐结晶(384毫克，70%)。用甲醇-乙醚结晶制得分析样品，得到产物，m.p.102℃～105℃。NMR和MS谱与结构一致。元素分析，C10H15N3O3·0.8 CF3COOH计算值，C，44.02;H，4.99;N，13.28。实测值(双份分析)，C，44.16，44.13;H，4.97，5.00;N，12.74，12.75。
通过硅胶层析，用二氯甲烷∶甲醇∶浓氨水(100∶5∶0.5)溶剂系统洗脱，将上述盐(220毫克)转变成游离碱。得到的物质(124毫克，80%)用二氯甲烷-乙醚结晶，制得最后产物，m.p.92℃～93℃。NMR和MS谱与结构一致。元素分析，C10H15N3O3计算值，C，53.33;H，6.67;N，18.67。实测值，C，53.12;H，6.67;N，18.44。
制备实例2阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙将阿霉素盐酸盐(44毫克，0.075毫摩尔)、马来酰亚氨基己酰基酰肼[按制备实例1所述方法制备]和2～3滴三氟乙酸的无水甲醇(25ml)混合物在氮气流和避光下搅拌15小时。在此期间的最后阶段经HPLC(流动相0.01摩尔乙酸钠∶乙腈(70∶30))检测无游离的阿霉素。于室温和真空下将溶液浓缩至10ml，并用乙腈稀释。将澄清的溶液浓缩至小体积，离心收集固体，产物在高真空下干燥，得标题化合物。NMR谱与结构一致。高分辨MS分析，C31H42N4O13计算值，751.2827，实测值，751.2804。
也可用阿霉素和酰肼的三氟乙酸盐制备上述腙。因此，将上述盐(40毫克，0.12毫摩尔)[按制备实例1所述方法制备]和阿霉素盐酸盐(50毫克，0.086毫摩尔)于甲醇(30ml)中搅拌15小时。使溶液浓缩至2ml，并用乙腈稀释。离心收集红色固体，并真空干燥。该产物(28毫克，43%)的NMR和TLC谱与上述相同。高分辨MS分析，C31H42N4O13计算值，751.2827;实测值，751.2819。
实例1ASPDP巯基化的单细胞系抗体BR64与阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的轭合物BR64抗体溶液(25ml，10.37毫克/ml;经紫外分析于280nm处确定，1.4吸光度相当于1毫克蛋白质)用SPDP的无水乙醇溶液(1.3ml 10毫摩尔溶液)处理。溶液于31℃～32℃温育1小时，然后用冰冷却，用DTT的磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)(1.3ml 50毫摩尔溶液)处理。该溶液于冰中保持1小时，然后转移到透析管中，于至少8小时期间用PBS透析3次(每次透析用2ml)。透析后按上法测定蛋白质浓度，随后通过Ellman法测定游离巯基的摩尔浓度。
巯基化的蛋白质(3ml)用硫醇摩尔相当量的溶于二甲基甲酰胺(DMF)的阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙(按制备实例2制得)(5毫克/ml，0.131ml)处理，混合物于4℃温育24小时。该溶液于至少8小时期间用PBS(1000ml)透析3次。将溶液离心，上清液与BiobeadsTMSM-2(非极性中性大孔聚苯乙烯聚合物小球，Bio-Rad Laboratories，Richmond CA 94804)一起振荡几小时，最后经Millex-GV(Millipore公司，Bedford，MA 01730)0.22微米滤器过滤。于495nm处(ε＝8030cm-1M-1)的吸光度测定阿霉素的量，于280nm处的吸光度测定蛋白质的量，在280nm处校正阿霉素的吸光度之后按下式测定每分子抗体的阿霉素分子的总平均数(“MR”)
抗体(毫克／ml) = (A280- (0.724－A495))/1.4产物的MR值为5.38;游离阿霉素占0.14%;蛋白质产率为60%。
实例1BSPDP巯基化的BR64与阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的轭合物将BR64抗体(405ml，11.29毫克/ml)溶液搅拌，并用SPDP的无水乙醇溶液(22.3ml 10毫摩尔溶液)处理。该溶液于31℃～32℃温育1小时，同时缓慢地振荡，然后在冰中冷却至4℃，搅拌，并用DTT的PBS溶液(22.3ml 50毫摩尔溶液)处理。溶液冰中保持1小时，然后分成2个等份，各份转入透析管中，于至少8小时期间用PBS(6L/每次透析)透析6次，随后将两管中的物质合并(400ml)，测定蛋白质浓度和游离的巯基(-SH/蛋白质的摩尔比为8.5)。
将巯基化的蛋白质溶液搅拌，并用硫醇摩尔相当量的溶于DMF的阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙(5毫克/ml，35.7ml)处理，混合物于4℃温育24小时。该溶液分成2等份，转入透析管中，于至少8小时期间用PBS(6L/每次透析)透析5次。将两透析管中的物质合并，经0.22微米乙酸纤维素滤器过滤，滤液与Bio-beadsTMSM-2(Bio-Rad Laboratories，Richmond CA 94804)一起振荡24小时。溶液经0.22微米乙酸纤维素滤器过滤。测定蛋白质和阿霉素的浓度(分别为6.26毫克/ml和162.4微克/ml)，得摩尔比(MR)为7.18。蛋白质产率为77%。未轭合的阿霉素为0.07%。
实例2SPDP巯基化的SN7与阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的轭合物按实例1A和1B所述的类似方法，将不与抗原(由BR64识别)结合的单细胞系抗体SN7用SPDP巯基化，并与阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙反应，得摩尔比(MR)为4的轭合物。蛋白质产率为51%。未轭合的阿霉素为0.36%。
实例3SPDP巯基化的Chi BR96与阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的轭合物嵌合的BR96抗体(Chi BR96)的溶液(27.5ml，12.51毫克/ml)用10mM SPDP的无水乙醇(1.7ml)溶液处理。溶液于31℃温育35分钟，在冰中冷却，并于4℃用0.50mM DTT的PBS(1.7ml)溶液处理15分钟。将此溶液转入透析管中，于至少8小时期间用PBS-0.1M组氨酸缓冲液(4.5L/每次透析)透析4次。测定蛋白质的量和巯基的摩尔浓度(分别为9.29毫克/ml和2.06×10-4M)。该溶液(17ml)用摩尔相当量的阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙在DMF中的溶液(5毫克/ml，0.59ml)处理，反应混合物于4℃温育24小时。反应混合物于至少8小时期间在同样的缓冲液(4.5L/每次透析)中透析3次。将透析过的溶液离心，上清液与BiobeadsTMSM-2(Bio-Rad Labora-tories，Richmond CA 94804)一起于4℃缓慢振荡几小时。该溶液经离心，测定上清液(19ml)中蛋白质和阿霉素的浓度(分别为6.5毫克/ml和67.86微克/ml)。药物/蛋白质的摩尔比为2.9。蛋白质的产率为72%;未轭合的阿霉素为1.2%。
实例4改变的蛙皮素与阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的轭合物蛙皮素不含有可通过含有迈克尔加成接受体的连接物用于连接药物的游离的活性巯基。因此，需制备在原来的蛙皮素的氨基末端含有另外的半胱氨酸残基的改变的蛙皮素。此外，将原来的蛙皮素的残基-3变成赖氨酸残基。因此改变的蛙皮素标示为“Cys0-lys3-蛙皮素”。
将Cys0-lys3-蛙皮素(11.3毫克)溶于1.1ml去离子水中，并用10μl 1.5M Tris-HCl(pH8.8)，调至pH7～7.5，然后在室温下与0.45ml阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙(15毫克/ml去离子水)反应数小时。反应混合物在透析管内用水透析过夜(分子量极限1000)。经离心(12，000×g)除去沉淀，留下上清液。用乙酸盐缓冲液(pH6.0)按1∶50稀释，测定蛙皮素-阿霉素轭合物的阿霉素(“ADM”)含量。阿霉素(“ADM”)的含量用下式计算[O.D.495/8030]×50＝ADM(M)其中试液的O.D.495＝0.116，因此阿霉素的含量为7.2×10-4M。
该产物用装有C18(Backman Instruments，Ultrasphere 5微米，4.6毫米×25厘米)柱的HPLC仪进行色谱分析。缓冲液A10mM NH4oAc pH 4.5;缓冲液B90%乙腈/10%缓冲液A。色谱柱用90%缓冲液A/10%缓冲液B平衡，色谱条件90%缓冲液A/10%缓冲液B～60%缓冲液A/60%缓冲液B 2分钟，梯度至50%缓冲液A/50%缓冲液B15分钟。在上述条件下产物的保留时间为9.3分钟。
实例5亚氨基四氢噻吩巯基化的嵌合的BR96和阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的轭合物将嵌合的BR96(15ml，9.05毫克/ml)用4L 0.1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH 9.1)透析2次。然后抗体溶液与亚氨基四氢噻吩(0.75ml，20mM)于32℃加热45分钟。溶液再用4L碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH 9.1)透析，随后用4 L 0.0095 M PBS-0.1 M L-组氨酸(pH 7.4)透析。该溶液-SH/蛋白质的摩尔比为1.35。然后按上述方法将蛋白质再巯基化，得-SH/蛋白质的摩尔比为5.0的溶液。
在搅拌下于4℃向巯基化的蛋白质溶液中加入阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙(3.2毫克/0.640ml DMF)轭合物于4℃温育16小时，然后将其用4 L 0.0095 M PBS-0.1 M L-组氨酸(pH 7.4)进行透析。透析的轭合物通过0.22微米乙酸纤维素膜滤入加有小量(＞5% v/v)BioBeadsTMSM-2(Bio-Rad Laboratories，Richmond CA 94804)的无菌管中。缓慢地振荡24小时后，滤出小球，轭合物在液氮中冷冻并于-80℃贮存。所得轭合物的阿霉素分子/蛋白质分子的摩尔比为3.4，并由嵌合的BR96计算，轭合物产率为24%。
实例6阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙与DTT还原的人体IgG(“宽松的人体IgG”)的轭合物人体IgG(从Rockland，Gilbertsville，PA获得)用0.0095MPBS稀释至蛋白质浓度为10.98毫克/ml。在氮气流下将该溶液于水浴中加热至37℃。加入二硫苏糖醇(16.8ml，10mM)的PBS溶液，并于37℃搅拌3小时。溶液等分在两个Amicon(Amicon Division of W.R.Grace和Co.，Beverly，MA 01915)8400型带搅拌的超滤池中，每个超滤池装配有Amicon YM 30超滤膜(分子量极限30，000，直径76毫米)，每个超滤池通过Amico CDS 10型浓缩/透析选择器连接到Amicon RC 800型小型储存容器上。每个储存容器含有700ml 0.0095M PBS-0.1 M L一组氨酸。将蛋白质溶液进行透析，直至滤液中游离硫醇的浓度为41微摩尔。保留液中-SH/蛋白质的摩尔比经测定为8.13。
将保留液从上述超滤池转移到保持在氮气流下的无菌容器中，在搅拌下加入阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙溶液(36.7ml，5毫克/ml水)。轭合物于4℃温育48小时，将其通过0.22微米乙酸纤维素膜过滤。Bio-Rad EconocolumnTM(2.5厘米×50厘米，Bio-Rad Laboratories，Richmond CA 94804)用100克BioBeadsTMSM-2(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA 94804)在0.00095 M-0.1M L-组氨酸缓冲液中的浆液填充。上述小球依次用甲醇、水和数倍体积的缓冲液洗涤。经过滤的轭合物以2ml/分的速度通过该柱渗滤。层析后轭合物通过0.22微米乙酸纤维素膜过滤，并在液氮中冷冻，于-80℃贮存。获得的轭合物有阿霉素分子/蛋白质分子的平均摩尔比为7.45，由人体IgG计算，轭合物产率为99%。
实例7宽松的BR64与阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的轭合物BR64溶液(435ml;11.31毫克/ml，7.07×10-5M)用DTT(947毫克)处理，并在缓慢搅拌下于42℃～43℃加热2小时。溶液于冰中冷却，转入两个透析管中，每个管用PBS(14L/每次透析)于4℃透析5次，需8小时。合并两管的内含物(400ml)，测定蛋白质和-SH含量(分别为10.54毫克/ml，6.58×10-5M;5.14×10-4M)。-SH/蛋白质的摩尔比为7.8。
在缓慢搅拌下，向抗体溶液中加入阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的DMF溶液(5毫克/ml，32.6ml)，然后于4℃温育24小时。溶液通过0.22微米乙酸纤维素滤器过滤，再转入两个透析管中，并按上述方法进行透析。透析后合并两管的内含物，过滤并与BioBeadsTMSM-2(Bio-Rad Laboratories，Richmond CA 94804)一起于4℃振荡24小时。经乙酸纤维素滤器滤出小球，得轭合物溶液。测定蛋白质和阿霉素的浓度(分别为8.66毫克/ml，5.42×10-5M;168微克/ml，2.89×10-4M)。蛋白质的产率为97%。阿霉素/蛋白质的摩尔比为5.33;未轭合的阿霉素为0.5%。
实例8轭合阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙与宽松抗体的通法1、将抗体(3克，10毫克/ml)在PBS缓冲液(注1)中的溶液(300ml)连续通入氮气，浸没在37℃水浴中并用磁力搅拌器缓慢搅拌。溶液用7摩尔相当量的DTT(注2，3)处理3小时。一开始就测定最大轭合产物的-SH/蛋白质的摩尔比(“MR”)，每小时测定一次，其摩尔比应保持恒定在约15(注2，4)。
2、溶液尽可能迅速地转移到保持在约4℃～约7℃的Amicon透析过滤池(Amicon Division of W.R.Grace和Co.，Beverly，MA01915)(注5)中。该系统用氩气和氮气加压，用含有0.1M组氨酸的PBS缓冲液(预先冷却至约4℃～约7℃)开始透析过滤。在开始透析过滤之后，流出液的最初温度立即为16℃～18℃，在约90分钟内下降到8℃～9℃。检测流出液的-SH/蛋白质的摩尔比，当摩尔比值＜1时完成透析过滤(注6)。
3、将上述溶液转回到装有磁力搅拌器的园底烧瓶中并置于冰中。向溶液中连续通入氮气。记录该溶液的体积。取出0.1ml试样，用PBS缓冲液稀释至1.0ml以便测定蛋白质的量，以毫克/ml表示(也可以蛋白质的摩尔相当量表示，以及-SH的体积摩尔浓度表示)(并可以-SH/蛋白质的MR表示)。制得阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的蒸馏水溶液(5毫克/ml，6.3×10-3M)(注7，8)。按下式确定轭合所需要的上述溶液的量(以ml表示)(－SH的体积摩尔浓度×蛋白质溶液的体积×1.05)/(6.3×10-3)(注9)，将上述确定的量慢慢加到缓慢搅拌的蛋白质溶液中。该溶液于4℃保持30分钟。
4、于4℃用Bio-BeadsTMSM-2，20～50目(Bio-Rad Labora-tories，Richmond CA 94804)填充柱子。红色蛋白质溶液通过0.22微米乙酸纤维素滤器过滤，然后以2.5ml/分的速度通过上述柱子，收集红色流出液。最后将PBS-0.1M组氨酸缓冲液倒入柱顶部，收集流出液直至液出液无色。记录收集的红色流出液的体积。取0.1ml等分试样用PBS缓冲液稀释至1ml，测定蛋白质和阿霉素的量。以495nm处的吸光度(ε＝8030cm-1M-1)测定轭合的阿霉素的量，并以微摩尔/ml和微克/ml表示。按上述方法读出280nm处的吸光度，并于相同波长处校正阿霉素的吸光度，根据以下通式测定蛋白质的量，以毫克/ml和微摩尔表示，抗体(毫克／ml)= (A280- (0.724- A495))/1.4其中A为指定波长处测定的吸光度。然后计算阿霉素/蛋白质的MR。
5、取5ml轭合物等分试样按上述方法通过Econo-PacTM10SM-2柱(预先装填的Bio-BeadsTMSM-2柱(Bio-Rad Laboratories，Richmond CA 94804)，10ml体积，用PBS-0.1M组氮酸缓冲液洗涤和平衡)。测定蛋白质和轭合的阿霉素的量，并测定MR。该值应与大容积溶液的值是相同的(注11)。
6、将轭合物于液氮中冷冻，并于-80℃贮存。取等分试样测定细胞毒性、结合和存在的游离阿霉素(注12)。
通法的注释1、抗体浓度通常为7～10毫克/ml(～6.25×10-5M)，该浓度是最合适的浓度。如浓度太高，溶液可用缓冲液稀释。如果浓度小于10毫克/ml，那么可以按此应用。通过280nm处的紫外吸光度(1毫克/ml＝1.4吸光度单位)测定浓度。
2、应用的DTT是从Boeringer Mannheim Biochemicals Indianapolis，Indiana 46250获得，m.p.42℃～43℃。如果出现质量问题，那么DTT应该重结晶(例如用乙醚-己烷重结晶)。通过m.p.、NMR和-SH含量确定其纯度。根据Ellman方法(Anal.Biochem.94，75～81，1979)进行巯基滴定取0.1ml等分试样用PBS稀释至1ml，并用0.05ml试剂(50毫微摩尔二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(“DTNB”)的100毫微摩尔Na2HPO4溶液;pH7.04)处理。1ml PBS空白按相同的方法用DTNB处理。5分钟后，于412nm处测定试样和空白的吸光度(A)，按下式测定-SH的摩尔浓度(“MCSH”)MCSH= ((A试样 － A空白)×10)/(1.415×104)3、DTT可以固体或溶液的形式加入。最好应用新鲜制备的10毫摩尔在缓冲液中的溶液。为了使反应达到一定规模，通常应用13.13ml。
4、按Ellman方法(见注2)测定SH的摩尔浓度并除以蛋白质的摩尔浓度，从而确定-SH/蛋白质的MR。在反应期间如果MR值小于14，那么加入适当量另外的DTT。
5、就3克/300ml的规模而言，需将该溶液分成2份，每份150ml，这样需用两个各350ml的Amico池。
6、就反应规模而言，透析过滤通常进行2～4小时。持续时间将取决于各种因素，例如膜的使用期限、溶液搅拌速度和池内压力。
7、腙不溶于PBS，并在短时间内形成沉淀。
8、短时间应用超声波粉碎器将有利于在蒸馏水中的溶解作用。所得的溶液是稳定的。
9、该量保证腙过量5%。所述的过程一般需要约15～20分钟。
10、制备Bio-BeadTM用于层析使其于甲醇中膨胀至少1小时，最好过夜，用蒸馏水洗涤，最后用PBS-0.1M组氨酸缓冲液平衡。应用3克蛋白质，需用100克小球装填2.5厘米×30厘米的柱。
11、由于所用的光谱法固有的误差，1MR单位的变差是可接受的满意结果。一般来讲，MR变化小于0.5MR单位。
12、轭合物中游离阿霉素的值通常小于1%很多。
实例9宽松的嵌合BR96与阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的轭合物按前面所述方法制备的嵌合的BR96，用0.0095M PBS稀释至蛋白质浓度为10.49毫克/ml。在氮气流下将该溶液于水浴中加热至37℃。加入二硫苏糖醇(26.2ml，10mM)和PBS溶液，并于37℃搅拌3小时。溶液等分到两个Amicon 8400型带搅拌的超滤池中，每个超滤池装配有YM 30超滤器(分子量极限30，000，直径76毫米)，每个超滤池通过CDS 10型浓缩/透析选择器连接到RC 800型小型储存容器上(Amicon，Division of W.R.Grace and Co.，Beverly MA 01915～9843)。每个储存容器含有800ml 0.0095M PBS-0.1ML一组氨酸。将蛋白质溶液进行透析直至溶液中游离硫醇的浓度为63微摩尔。保留液中-SH/蛋白质的摩尔比经测定为8.16。保留液从上述池转移到保持在氮气流下的无菌容器中，在搅拌下加入阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙溶液(42.6ml，5毫克/ml水)。轭合物于4℃温育48小时，随后将其通过0.22微米乙酸纤维素膜过滤。2.5厘米×50厘米Bio-Rad Econocolumn用100克BioBeadsTMSM-2(Bio-Rad Laboratories，Richmond California 94804)在0.00095M-0.1M L-组氨酸缓冲液中的浆液填充。小球依次用甲醇、水和数倍体积的缓冲液洗涤。经过滤的轭合物以2ml/分的速度通过该柱渗滤。层析以后，轭合物通过0.22微米乙酸纤维素膜过滤，并在液氮中冷冻，于-80℃贮存。获得的轭合物阿霉素/蛋白质的摩尔比为6.77，由嵌合的BR96计算，轭合物产率为95%。
实例10宽松的鼠抗体L6与阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙的轭合物按前述方法制备的鼠抗体L6用0.0095M PBS稀释至蛋白质浓度为11.87毫克/ml。在氮气流下该溶液(350ml)于水浴中加热至37℃。加入二硫苏糖醇(18.2ml，10mM)的PBS溶液，并于37℃搅拌3小时。溶液等分到两个Amico 8400型带搅拌的超滤池中，每个超滤池装配有YM30超滤器(切割分子量30，000，直径76毫米)，每个超滤池通过CDS 10型浓缩/透析选择器连接到RC800型小型储存容器上(Amicon，Division of W.R.Grace and Co.，Beverly MA 01915～9843)。每个储存容器含有800ml 0.0095M PBS-0.1M L-组氨酸。将蛋白质溶液进行透析，直至溶液中游离硫醇的浓度为14微摩尔。保留液中-SH/蛋白质的摩尔比经测定为9.8。将保留液从上述池转移到保持在氮气流下的无菌容器中，在搅拌下加入阿霉素马来酰亚氨基己酰基腙溶液(40.4ml，5毫克/ml水)。轭合物于4℃温育48小时，随后将其通过0.22微米乙酸纤维素膜过滤。2.5厘米×50厘米Bio-Rad Econocolumn用100克BioBeadsTMSM-2(Bio-Rad Laboratories，Richmond California 94804)在0.00095M-0.1M L-组氨酸缓冲液中的浆液填充。该小球依次用甲醇、水和数倍体积的缓冲液洗涤。经过滤的轭合物以2ml/分的速度通过该柱渗滤。层析以后轭合物通过0.22微米乙酸纤维素膜过滤，并在液氮中冷冻，于-80℃贮存。获得的轭合物阿霉素/蛋白质的摩尔比为7.39，由鼠L6计算，轭合物产率为100%。
生物学活性对本发明有代表性的轭合物进行体外和体内系统试验，以测定其生物活性。在这些试验中，通过检测所述轭合物抗人的癌细胞的细胞毒性，测定具有细胞毒作用的药物轭合物的效力。下面阐述所用的有代表性的试验和所得到的结果。在所给出的全部数据中，轭合物用配位体和药物之间的配位体-药物-摩尔比形式表示。这样，例如“BR64-ADM-5.33”指的是抗体BR64和阿霉素的轭合物，并且药物与抗体的摩尔比为5.33。熟悉本技术领域的专业人员将认识到，任何可表达所要求抗原的瘤株都可以用来替代下述各项试验中所用的特定瘤株。
试验ⅠBR64-阿霉素轭合物的体外活性试验了实例1B和2的免疫轭合物在体外抗人肺癌细胞系L2987的活性，该细胞株[从I.Hellstr
m，Bristol-Myers Squibb Seattle公司获得，还可参见I.Hellstr
m等，Cancer Research 50∶2183(1990)]表达由单克隆抗体BR64，L6和BR96识别的抗原。用胰蛋白酶-EDTA(GIBCO，Grand Island，NY)收获L2987细胞的单层培养物，细胞经计数后重新悬浮于含10%热灭活小牛血清的RPMI-1640(简称为“RPMI-10%FCS”)中，使细胞量为1×105/ml。将细胞悬液加到96孔平底微量滴定板中，每孔0.1ml，并在37℃和5% CO2及一定湿度环境条件下温育过夜。移除滴定板中的培养液，将阿霉素或其抗体轭合物的系列稀释液加到各孔中。所有的稀释液都作4次测定。加入药物或轭合物后2小时，将滴定板进行离心(100×g，5分钟)，除去药物或轭合物，用RPMI-10% FCS洗涤板3次，细胞在RPMI-10% FCS中再培养48小时。此时用1.0μci/孔的[3H]标记胸苷(New England Nuclear公司，Boston，MA)攻击细胞2小时。采集滴定板中细胞，测定每分钟计数值(“CPM”)。通过比较处理样品和未处理的对照样品的平均CPM值，测定细胞增殖的抑制作用。图3所列数据表明，与未结合的SN7和阿霉素的免疫配合物相比(阿霉素与SN7的摩尔比等于4，以“SN7-THADMHZN-4”表示)，结合的免疫轭合物(阿霉素与BR64的摩尔比等于7.18，以“BR64-THADMHZN-7.18”表示)具有抗L2987肺细胞的细胞毒性。按实例1B所述方法制备的BR64轭合物是有活性的，并证明在该体外筛选试验中具有抗原特异的细胞毒性。
试验ⅡBR64-阿霉素轭合物的体内活性进行体内试验，评价实例1B和2的免疫轭合物的抗原特异抗肿瘤活性。在这些试验中采用有BALB/C遗传背景的先天无胸腺的雌性小鼠(BALB/C nu/nu;Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)。将小鼠放进能控制温度和湿度的、置于无菌床上的Thoren鼠笼中饲养。给动物随意喂无菌饲料和饮水。如上所述，在这些研究中用的是L2987人肺肿瘤细胞株。业已证明，在反复的体内继代移植后，该细胞株能维持表达BR64、BR96和L6抗原。按前述方法[P.A.Trail等，in vivo 3∶319～24(1989)]通过在无胸腺小鼠上作系列继代移植，保持该肿瘤细胞株。一周1次或二周1次用卡尺量取肿瘤的两条垂直方向的长度。
按下式计算肿瘤的体积V(毫米3)＝ ((L×W2))/2式中V＝体积(毫米3)L＝最长轴的测量值(毫米)W＝与L轴垂直的轴的测量值(毫米)治疗组和对照组的数据以平均肿瘤大小表示。每一治疗组成或对照组有8～10只小鼠。当肿瘤平均大小达50～100毫米3时开始治疗。正如用符号表示的那样，以不同的疗程，经腹腔注射(ip)或静脉注射(iv)途径给药进行治疗。供给药用的阿霉素用生理盐水稀释，自然抗体和阿霉素配合物则用磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)稀释。所有剂量均以体重为基础(毫克/公斤)给与，并计算出每只小鼠的给药量。在这些研究中，将结合的BR64免疫轭合物的抗肿瘤活性与最适剂量的阿霉素、自然BR64与阿霉素的混合物以及未结合的配合物的抗肿瘤活性进行比较。未轭合的阿霉素按照经证明对L2987人异体移植模型是最适的途径、剂量和疗程条件给药。iv途径，每4天注射1次，共注射3次(用“8毫克/公斤，q4d×3，iv”表示)。结合的(BR64)和未结合的(SN7)免疫配合物则在几个剂量水平上，以ip途径给与，每4天注射1次，共注射3次(用“q4d×3，ip”表示)。如图4所示。注射可耐受的BR64-阿霉素轭合物(10和15毫克/公斤/每次注射)后，可观察到明显的抗肿瘤活性。用BR64轭合物治疗后所观察到的抗肿瘤活性明显好于用最适剂量的阿霉素和对等剂量的未结合(SN7)的配合物治疗后所观察到的抗肿瘤活性。
在本实验中，用BR64轭合物治疗(15毫克/公斤每次注射)后可观察到66%动物的肿瘤完全消退，用剂量为10毫克/公斤/每次注射的BR64轭合物治疗后观察到50%动物的肿瘤完全消退。用最适剂量的阿霉素、自然BR64与阿霉素的混合物以及相当剂量的未结合的配合物治疗后尚未观察到确认的L2987肿瘤的部分消退或完全消退。
为了证明所观察到的抗肿瘤活性需要抗体与阿霉素的共价结合，用自然BR64和阿霉素的混合物做了几个对照试验。图5a-c表示若干类型复合治疗方案的有代表性的数据。用单克隆抗体和阿霉素组成的几种复合治疗方案所观察到的抗肿瘤活性和单用最适剂量阿霉素治疗所观察到的抗肿瘤活性，并无显著差别。所有这些数据表明，为了得到图4所示的抗肿瘤活性，BR64和阿霉素的共价结合是必需的。
实验Ⅲ蛙皮素轭合物的体内活性评价实例4轭合物在体内的抗肿瘤活性。用套针将H345人小细胞肺癌瘤小片(由University of Colorado Medical School公司的D.Chan博士提供)植入BALB/C无胸腺裸小鼠的皮下。待肿瘤长至50～100毫米3大小时开始治疗。移植肿瘤后23、26、28和30天给小鼠静注下列药物进行治疗单用阿霉素(1.6毫克/公斤)，或蛙皮素-阿霉素轭合物(“BN-ADM(TH)”，剂量相当于1.6毫克/公斤阿霉素)，或P77-阿霉素轭合物(“P77-ADM(TH)”，剂量相当于1.6毫克/公斤阿霉素)。P77是带有内半胱氨酸残基的12个氨基酸组成的肽(其氨基酸序列为KKLTCVQTRLKI)，按实例4所示方法，该肽不与H345细胞结合，但可与阿霉素的马来酰亚氨基己酰基腙轭合。因此，“P77-ADM(TH)”轭合物代表一种不能与H345细胞结合的轭合物。用卡尺量取肿瘤大小，并按下式计算肿瘤体积V(毫米3)＝ ((L×W2))/2式中V、L和W的定义同试验Ⅱ。
测定了肿瘤的平均体积，观察到的结果见图6。
试验Ⅳ宽松的Chi BR96抗体轭合物的体外细胞毒性数据按实例8所述，采用制备宽松抗体的一般方法，制备阿霉素与Chi BR96抗体的免疫轭合物。按下面的试验方案，测定轭合物的体外细胞毒性，并与游离的阿霉素和按实例1B所述方法制备的SPDP巯基化的免疫轭合物的细胞毒性进行比较。这些试验的结果见图7所示。
L2987人肺细胞的单层培养物置于含10%热灭活的小牛血清的RPMI-1640培养液(RPMI-10% FCS)中保养。用胰蛋白酶-EDTA(GIBCO，Grand Island，NY)收获细胞，计数细胞后重新悬浮于RPMI-10% FCS中，使细胞数达1×105/ml。将细胞悬液加到96孔微量滴定板中，每孔0.1ml，并在37℃约5% CO2的有一定湿度的环境条件下温育过夜。除去滴定板中的培养液，将阿霉素或抗体/ADM轭合物的系列稀释液加到各孔中。所有的稀释液都作4次测定。加入药物或轭合物(接触细胞)后2小时，将滴定板进行离心(200×g，5分钟)，除去药物或轭合物，用RPMI-10% FCS洗涤板3次。细胞在RPMI-10% FCS培养液中再另外培养48小时。此时用1.0μci/孔的氚标记胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)攻击细胞2小时。采集滴定板中细胞，测量每分钟细胞计数值(“CPM”)。通过比较处理样品与未处理样品的平均CPM值，测定细胞增殖的抑制。按相当于阿霉素的微摩尔数，报告半数细胞的抑制值IC50。
试验ⅤBR64和鼠L6轭合物的体内抗肿瘤活性评价阿霉素和宽松的BR64或宽松的L6的免疫轭合物在体内的抗肿瘤活性。所观察到的数据见图8所示。
本试验采用有BALB/C遗传背景的先天性无胸腺雌性小鼠(BALB/C nu/nu;Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)。将小鼠放进能控制温度和湿度的、置于无菌床上的Thoren鼠笼中饲养。给小鼠随意喂无菌饲料和饮水。
按肿瘤异体移植模型，在无胸腺小鼠中建立L2987人肺瘤细胞株。通过在体内作系列继代移植，保持该肿瘤株。每周1次或二周1次，用卡尺在二个垂直的方向上测量肿瘤。按下面的公式计算肿瘤体积V(毫米3)＝ ((L×W2))/2式中V＝体积(毫米3)L＝最长轴的测量值(毫米)W＝与L轴垂直的轴测量值(毫米)每个对照或治疗组的小鼠数通常为8～10只。数据以对照或治疗组的平均肿瘤大小表示。抗肿瘤活性以术语总的对数细胞杀死值(“LCK”)表示，这里LCK＝ (T-C)/(3.3×TVDT)式中T-C定义为被治疗的肿瘤达到目标大小所需要的平均时间(天)减去对照肿瘤达到目标大小所需要的平均时间(天);TVDT为对照肿瘤体积达2倍大小(250～500毫米3)所需要的时间(天)。肿瘤部分消退(“PR”)是指肿瘤体积减少到初始肿瘤体积的50%或50%以下。肿瘤的完全消除(“CR”)是指在一定时间内未触及到肿瘤;治愈定义是确认的肿瘤在≥10 TVDT的周期内未能触及到。
对植入L2987人肺肿瘤的动物，通常在肿瘤体积平均大小达75毫米3时(肿瘤移植后12-14天)开始进行治疗。平均TVDT为4.8±0.9天，在瘤体大小为500毫米3时评价抗肿瘤活性。在几个试验(在下面试验Ⅵ中叙述)中，当L2987肿瘤长至225毫米3大小时开始治疗。
研究中的药物或轭合物经ip或iv途径给与。阿霉素用生理盐水稀释，抗体和抗体/阿霉素轭合物则用磷酸盐缓冲盐水稀释。以每只动物计算的毫克/公斤为基础给与化合物，剂量以相当于一次注射的阿霉素毫克/公斤表示。免疫轭合物按q4d×3疗程投与。对一个治疗方案的最大耐受剂量(“MTD”)定义为，按已定疗程给药，引起死亡率≤20%的最高剂量。
在图8所示的数据中，注射最适剂量的阿霉素产生相当于1.1LCK的抗肿瘤活性，肿瘤未见消退。在所试的所有各剂量下，BR64-ADM轭合物产生相当于＞10 LCK的抗肿瘤活性，在BR64-ADM剂量分别为5毫克/公斤、8毫克/公斤和10毫克/公斤时，观察到治愈率分别为89%、78%和100%。在8毫克/公斤或10毫克/公斤的剂量下，L6-ADM轭合物产生的抗肿瘤活性(分别为1.8和3.5LCK)明显优于最适剂量的阿霉素所产生的抗肿瘤活性，但小于相当剂量的内化BR64-ADM轭合物。因此，该数据表明，可结合的未内化的L6-ADM轭合物的抗肿瘤活性优于未轭合的阿霉素的抗肿瘤活性。用L6-阿霉素轭合物治疗产生的抗肿瘤活性低于用相当剂量内化的BR64-阿霉素轭合物治疗所观察到的抗肿瘤活性。
试验ⅥChi BR96-ADM轭合物的体内抗肿瘤活性对Chi BR96-ADM轭合物抗确定的人肺肿瘤(“L2987”)、乳房肿瘤[“MCF7”，从美国标准菌种保藏所得到，登记号为ATTCC HTB22，也可参见I.Hellstrom等，Cancer Research 50∶2183(1990)]和结肠肿瘤[“RCA”，从M.Brattain，Baylor University得到，也可参见I.Hellstrom等，Cancer Research 50∶2183(1990)]的抗肿瘤活性进行评价。
饲养动物并建立MCF7、RCA和试验V所述的L2987人肿瘤株的异体移植模型。各物质的给药途径和剂量同试验Ⅴ所述。
对带有L2987人肺肿瘤的动物一般是从平均瘤体大小为75毫米3(肿瘤移植后12-14天)时开始治疗。平均TVDT为4.8±0.9天，在瘤体大小为500毫米3时评价抗肿瘤活性。在几个试验中，治疗从L2987肿瘤达225毫米3大小时开始。
MCF7肿瘤是一种与雌激素有关的人乳房瘤株。在MCF7肿瘤移植的当天，给无胸腺小鼠植入0.65毫克(释放速率为65天)雌二醇丸剂(Innovative Research of America，Toledo，Ohio)。当平均肿瘤大小为100毫米3(一般在肿瘤移植后13天)时开始治疗。MCD7肿瘤的平均TVDT为6.4±2.0天，在肿瘤大小为500毫米3时评价抗肿瘤活性。
对带有RCA结肠肿瘤的动物是从肿瘤移植后15天平均肿瘤大小达75毫米3时开始治疗。RCA肿瘤异体移植的平均TVDT为9.5±1.5天，在肿瘤大小达400毫米3时评价抗肿瘤活性。在L2987、MCF7和RCA异体移植模型上最适剂量的阿霉素抗肿瘤活性的数据总结在下面诸表和参考图中。
比较了Chi BR96-ADM轭合物、最适剂量的阿霉素和相当剂量的未结合(IgG)配合物的抗肿瘤活性。在每个异体移植模型上，注射可耐受剂量的Chi BR96-ADM轭合物后，均可观察到已确定的肿瘤完全消退和/或治愈。
图9和图10列示了Chi BR96-ADM轭合物具有抗原特异的抗肿瘤活性的具有代表性的数据。如图9所示，腹腔注射相当于10毫克/公斤阿霉素剂量的Chi BR96-ADM轭合物，能产生相当于＞10 LCK的抗肿瘤活性。在该Chi BR96-ADM轭合物剂量下，78%小鼠的肿瘤可治愈，另外的11%小鼠的肿瘤完全消退。腹腔注射5毫克/公斤的Chi BR96-ADM轭合物也可产生相当于＞10 LCK的抗肿瘤活性，其肿瘤治愈率和肿瘤完全消退率分别为88%和12%。腹腔注射Chi BR96-ADM轭合物后所观察到的抗肿瘤活性(＞10 LCK)显著好于注射最适量的阿霉素所观察到的(1.0 LCK)。而且，Chi BR64-阿霉素轭合物的抗肿瘤作用也比最适剂量的阿霉素强，即在相当于阿霉素5毫克/公斤剂量下，受试的Chi BR96-ADM轭合物的抗肿瘤活性相当于静脉注射8毫克/公斤阿霉素的抗肿瘤活性。未结合的人IgG配合物(MR＝7.16)在相当于阿霉素10毫克/公斤的剂量下进行试验时，无抗L2987异体移植活性，这表明Chi BR96-ADM轭合物优良的抗肿瘤活性是由于该免疫轭合物与L2987肿瘤细胞的抗原特异的结合。
图10表示类似的数据。如图10所示，在相当于阿霉素10毫克/公斤的剂量下，受试的Chi BR96-ADM轭合物(MR＝5.8)能产生相当于＞10LCK的抗肿瘤活性。在该剂量下观察到的肿瘤治愈率和完全消退率分别为90%和10%。腹腔注射5毫克/公斤的Chi BR96-ADM轭合物能产生4.8LCK的抗肿瘤活性，肿瘤的治愈率、完全消退率和部分消退率分别为10%、50%和10%。Chi BR96-ADM轭合物的抗肿瘤活性大大超过最适剂量的阿霉素(1.6LCK)，而且如上所述，Chi BR96-ADM轭合物的抗肿瘤作用也比未轭合的阿霉素强。未结合的IgG-ADM配合物(MR＝7.16)在10毫克/公斤剂量下，是无活性的。
用“宽松”抗体技术制备的各种Chi BR96-ADM轭合物制剂对已确定的L2987人肺肿瘤异体移植的抗肿瘤活性评价结果列于表Ⅱ。
如表Ⅱ所示，Chi BR96-ADM轭合物的抗肿瘤活性优于最适剂量的阿霉素，Chi BR96-ADM轭合物的抗肿瘤效力比未轭合的阿霉素强6～8倍。
Chi BR96-ADM轭合物对已确定的L2987大型肿瘤(225毫米3)的抗肿瘤活性也进行了评价(图11)。腹腔注射相当于阿霉素10毫克/公斤剂量的Chi BR96-ADM轭合物(MR＝6.86)产生相当于＞10 LCK的抗肿瘤活性，观察到的肿瘤治愈率和部分消退率分别为70%和30%。
采用已确定的(50～100毫米3)L2987人肺肿瘤异体移植模型，评价未轭合的Chi BR96抗体的抗肿瘤活性。如表Ⅲ所示，Chi BR96抗体以100、200或400毫克/公斤剂量作静注，对已确定的L2987肿瘤是无效的。Chi BR96和阿霉素混合物的抗肿瘤活性与单用阿霉素无差别。所以，Chi BR96-ADM轭合物的抗肿瘤活性反映了轭合物本身的效力而不是抗体和阿霉素协同的抗肿瘤作用。
总之，在评价Chi BR96-ADM轭合物对已确定的L2987人肺肿瘤的活性时，证明它具有抗原特异的抗肿瘤活性。Chi BR96-ADM轭合物的抗肿瘤活性优于最适剂量的阿霉素、Chi BR96和阿霉素混合物以及相当剂量的未结合的配合物。Chi BR96-ADM轭合物的抗肿瘤效力比未轭合的阿霉素约强6倍。在用≥2.5毫克/公斤剂量的Chi BR96-ADM轭合物治疗的动物中，有50%动物可观察到已确定的肿瘤的治愈率或完全消退。
如图12所示，Chi BR96-ADM轭合物(MR＝7.88)被证实对抗原特异的已确定的(75～125毫米3)MCF7肿瘤具有活性。Chi BR96-ADM轭合物以5毫克/公斤剂量腹腔注射或静注给药，具有的抗肿瘤活性(4.2LCK)均优于最适剂量的阿霉素(1.4LCK)或剂量相当的未结合的IgG配合物(1.2LCK)Chi BR96-ADM和未结合的IgG-ADM配合物的抗肿瘤活性总结于表Ⅳ中。象游离阿霉素的MTD值一样，由于肿瘤生长所需要的雌二醇的补给，在MCF7模型上Chi BR96-ADM轭合物的MTD值较低。
在RCA人结肠癌模型上还评价了Chi BR96-ADM轭合物的抗原特异的抗肿瘤作用和剂量效应。RCA肿瘤对未轭合的阿霉素的敏感性比L2987和MCF7肿瘤小。此外，如前所述，RCA肿瘤的瘤体积倍增时间比L2987和MCF7肿瘤长，形成血管困难，RCA肿瘤中放射性标记的BR64抗体的定位作用低于L2987肿瘤。如图13所示，腹腔注射10毫克/公斤剂量Chi BR96-ADM轭合物(MR＝7.88)的抗肿瘤活性优于阿霉素和剂量相当的未结合的IgG配合物(MR＝7.16)。如表Ⅴ所示，Chi BR96-ADM轭合物在10毫克/公斤剂量下进行试验，产生的抗肿瘤活性相当于＞3 LCK。在Chi BR96-ADM轭合物的该剂量下，可有89%肿瘤治愈率和11%肿瘤部分消退率。本试验中，未轭合的阿霉素显示相当于0.4LCK的抗肿瘤活性。因此，在本试验中，该Chi BR96-ADM轭合物对已确定的肿瘤可产生89%治愈率，而未轭合的阿霉素是无活性的。
总之，在RCA人结肠肿瘤模型上，Chi BR96-ADM轭合物被证明具有抗原特异的抗肿瘤活性。腹腔注射5～10毫克/公斤剂量的Chi BR96-ADM轭合物后，可观察到已确定的RCA肿瘤的治愈和完全消退。
关于本发明的具体实例、材料和数据，业已作了阐述。因为熟悉本技术领域的专业人员明白，应用或制备本发明不同方面的另外方法是存在的。该另外的方法包括在由以下权利要求所述的本发明目的和精神之内。
权利要求
1.式(Ⅱa)化合物，
其中D为药物部分，n为整数1～10，R为迈克尔加成接受体。
2.权利要求1所述的化合物，其中D为细胞毒药物。
3.权利要求2所述的化合物，其中D为蒽环抗菌素、长春花生物碱、丝裂霉素、博莱霉素、胞毒核苷、蝶啶或鬼臼毒。
4.权利要求3所述的化合物，其中D为蒽环抗菌素。
5.权利要求1～4中任何一项所述的化合物，其中R为马来酰亚氨基。
6.式(Ⅱb)化合物，
其中n为整数1～10，其中R1为-CH3、-CH2OH、-CH2OCO(CH2)3CH3或-CH2OCOCH(OC2H5)2，R3为-OCH3、-OH或-氢，R4为-NH2、-NHCOCF3、4-吗啉基、3-氰基-4-吗啉基、1-哌啶基、4-甲氧基-1-哌啶基、苄胺、二苄胺、氰基甲胺或1-氰基-2-甲氧基乙胺，R5为-OH、-OTHP或-氢，R6为-OH或-氢，条件是当R5为-OH或-OTHP时，R6不是-OH，R为迈克尔加成接受体。
7.权利要求6所述的化合物，其中n为5。
8.权利要求7所述的蒽环化合物，其中R为马来酰亚氨基。
9.式(Ⅱc)化合物，
其中R1为-CH3、-CH2OH、-CH2OCO(CH2)3CH3或-CH2OCOCH(OC2H5)2，R3为-OCH3、-OH或-氢，R4为-NH2、-NHCOCF3、4-吗啉基、3-氰基-4-吗啉基、1-哌啶基、4-甲氧基-1-哌啶基、苄胺、二苄胺、氰基甲胺或1-氰基-2-甲氧基乙胺，R5为-OH、-OTHP或-氢，R6为-OH或-氢，条件是当R5为-OH或-OTHP时，R6不是-OH，n为整数1～10。
10.权利要求6～9中任何一项所述的化合物，其中蒽环部分系选自阿霉素、柔毛霉素、阿霉素双乙氧乙酸酯、洋红霉素、去甲氧柔红霉素、表阿霉素、AD-32、4-吗啉基-阿霉素和3′-去氨基-3′-(3-氰基-4-吗啉基)-亚德里亚霉素。
11.权利要求10所述的化合物，其中蒽环为阿霉素。
12.式(Ⅰ)化合物，
其中D为药物部分，n为整数1～10，p为整数1～6，Y为氧或NH+2Cl-，Z为零或1，q为约1～10，X为配位体，A为迈克尔加成接受体。
13.权利要求12所述的化合物，其中D为细胞毒药物。
14.权利要求12所述的化合物，其中D为蒽环抗菌素、长春花生物碱、丝裂霉素、博莱霉素、胞毒核苷、蝶啶或鬼臼毒。
15.权利要求12所述的化合物，其中D为蒽环抗菌素。
16.权利要求12～15中任何一项所述的化合物，其中n为5。
17.权利要求16所述的化合物，其中A为琥珀酰亚氨基。
18.权利要求17所述的化合物，其中X为免疫球蛋白或其片段。
19.权利要求18所述的化合物，其中X为选BR96、BR64、L6、宽松的BR96、宽松的BR64、宽松的L6、嵌合的BR96、嵌合的BR64、嵌合的L6、宽松的嵌合BR96、宽松的嵌合BR64、、宽松的嵌合L6以及它们片段的免疫球蛋白。
20.权利要求19所述的化合物，其中X为嵌合的BR96、宽松的嵌合BR96或它们的片段。
21.权利要求12～17中任何一项所述的化合物，其中X为选自以下的配位体蛙皮素、EGF、铁传递蛋白、促胃液激素、促胃液激素释放的肽、血小板诱生的生长因子、IL-2、IL-6、TGF-α、TGF-β、VGF、胰岛素和类似胰岛素的生长因子Ⅰ和Ⅱ。
22.权利要求21所述的化合物，其中X为蛙皮素。
23.权利要求12～17中任何一项所述的化合物，其中X为选自糖、甾族化合物和外源凝集素的配位体。
24.式(Ⅰa)化合物，
其中R1为-CH3、-CH2OH、-CH2OCO(CH2)3CH3或-CH2OCOCH(OC2H5)2，R3为-OCH3、-OH或-氢，R4为-NH2、-NHCOCF3、4-吗啉基、3-氰基-4-吗啉基、1-哌啶基、4-甲氧基-1-哌啶基、苄胺、二苄胺、氰基甲胺或1-氰基-2-甲氧基乙胺，R5为-OH、-OTHP或-氢，R6为-OH或氢，条件是当R5为-OH或-OTHP时，R6不是-OH，n为整数1～10，p为整数1～6，Y为氧或NH+2Cl-，Z为零或1，q为约1～10，X为配位体。
25.权利要求24所述的化合物，其中Y为氧，p为3，Z为1。
26.权利要求24所述的化合物，其中Y＝NH+2Cl-，p为3，Z为1。
27.权利要求24所述的化合物，其中Z为零。
28.权利要求24～27中任何一项所述的化合物，其中蒽环抗菌素部分系选自阿霉素、柔毛霉素、阿霉素双乙氧乙酸酯、洋红霉素、去甲氧柔红霉素、表阿霉素、AD-32、4-吗啉基-阿霉素和3′-去氨基-3′-(3-氰基-4-吗啉基)-亚德里亚霉素。
29.权利要求28所述的化合物，其中蒽环部分为阿霉素。
30.权利要求28所述的化合物，其中X为免疫球蛋白或其片段。
31.权利要求30所述的化合物，其中X为选自BR96、BR64、L6、宽松的BR96、宽松的BR64、宽松的L6、嵌合的BR96、嵌合的BR64、嵌合的L6、宽松的嵌合BR96、宽松的嵌合BR64、、宽松的嵌合L6以及它们片段的免疫球蛋白。
32.权利要求31所述的化合物，其中X为嵌合的BR96、宽松的嵌合BR96或它们的片段。
33.权利要求24～27中任何一项所述的化合物，其中X为选自蛙皮素、EGF、铁传递蛋白、促胃液激素、促胃液激素释放的肽、由血小板诱生的生长因子、IL-2、IL-6、TGF-α、TGF-β、VGF、胰岛素和类似胰岛素的生长因子Ⅰ和Ⅱ。
34.权利要求33所述的化合物，其中X为蛙皮素。
35.权利要求24～27中任何一项所述的化合物，其中X为选自糖、甾族化合物和外源凝集素的配位体。
36.式(Ⅰb)化合物，
其中n为整数1～10，q为约1～10，X为配位体。
37.权利要求36所述的化合物，其中X为免疫球蛋白或其片段。
38.权利要求37所述的化合物，其中X选自BR96、BR64、L6、宽松的BR96、宽松的BR64、宽松的L6、嵌合的BR96、嵌合的BR64、嵌合的L6、宽松的嵌合BR96、宽松的嵌合BR64、、宽松的嵌合L6和它们片段的免疫球蛋白。
39.权利要求38所述的化合物，其中X为嵌合的BR96、宽松的嵌合BR96或它们的片段。
40.权利要求36所述的化合物，其中X为蛋白质或肽配位体。
41.权利要求40所述的化合物，其中X系选自蛙皮素、EGF、铁传递蛋白、促胃液激素、促胃液激素释放的肽。
42.权利要求41所述的化合物，其中X为蛙皮素。
43.权利要求36所述的化合物，其中X系选自糖、甾族化合物和外源凝集素的配位体。
44.式(Ⅰc)化合物，
其中q为约4～8，X为配位体。
45.权利要求44所述的化合物，其中X为免疫球蛋白或其片段。
46.权利要求45所述的化合物，其中X为选自BR96、BR64、L6、宽松的BR96、宽松的BR64、宽松的L6、嵌合的BR96、嵌合的BR64、嵌合的L6、宽松的嵌合BR96、宽松的嵌合BR64、、宽松的嵌合L6以及它们片段的免疫球蛋白。
47.权利要求46所述的化合物，其中X为嵌合的BR96、宽松的嵌合BR96或它们的片段。
48.权利要求44所述的化合物，其中X为蛋白质或肽配位体。
49.权利要求48所述的化合物，其中X系选自蛙皮素、EGF、铁传递蛋白、促胃液激素、促胃液激素释放的肽。
50.权利要求49所述的化合物，其中X为蛙皮素。
51.权利要求44所述的化合物，其中X为选自糖、甾族化合物和外源凝集素的配位体。
52.式(Ⅰd)化合物，
其中q为约4～8，Ig为宽松的嵌合BR96抗体或其片段。
53.还原含有二硫化物桥的蛋白质的方法，该方法包括(a)在惰性气流下还原该蛋白质，(b)回收产物。
54.权利要求53所述的方法，其中还原剂为DTT。
55.权利要求54所述的方法，其中蛋白质为免疫球蛋白或其片段。
56.权利要求55所述的方法，其中免疫球蛋白系选自BR64、嵌合的BR64、BR96、嵌合的BR96、L6、嵌合的L6以及它们的片段。
57.权利要求56所述的方法，其中DTT与配位体的摩尔比为约1∶1～10∶1。
58.权利要求57所述的方法，其中DTT与配位体的摩尔比为约6∶1～10∶1。
59.权利要求58所述的方法，其中还原步骤的pH为约6.0～8.0。
60.权利要求59所述的方法，其中还原步骤的pH为约7.0～7.5。
61.权利要求60所述的方法，其中产品用透析过滤法纯化。
62.权利要求61所述的方法，该方法还包括使还原的免疫球蛋白与式(Ⅱa)化合物反应，其中D为药物部分，n为整数1～10，R为迈克尔加成接受体。
63.权利要求62所述的方法，其中药物部分为蒽环抗菌素，R为马来酰亚氨基，n为5。
64.权利要求63所述的方法，其中蒽环抗菌素为阿霉素。
65.按权利要求53所述方法制备的还原的免疫球蛋白。
66.由式(Ⅰa)化合物作为有效成分与药学上适用的载体、稀释剂或赋形剂组成的组合物，
其中R1为-CH3、-CH2OH、-CH2OCO(CH2)3CH3或-CH2OCOCH(OC2H5)2，R3为-OCH3、-OH或氢，R4为-NH2、-NHCOCF3、4-吗啉基、3-氰基-4-吗啉基、1-哌啶基、4-甲氧基-1-哌啶基、苄胺、二苄胺、氰基甲胺或1-氰基-2-甲氧基乙胺，R5为-OH、-OTHP或氢，R6为-OH或氢，条件是当R5为-OH或-OTHP时，R6不是-OH，n为整数1～10，p为整数1～6，Y为氧或NH+2Cl-，Z为零或1，q为约1～10，X为配位体。
67.由式(Ⅰb)化合物作为有效成分，与药学上适用的载体、稀释剂或赋形剂组成的组合物，
其中n为1～10，q约为1～10，x为配位体。
68.权利要求67所述的组合物，其中n为5，X为宽松的嵌合BR96抗体，q为约4～8。
69.由式(Ⅰd)作为有效成分与药学上适用的载体、稀释剂或赋形剂组成的组合物，
其中q为约4～8，Ig为宽松的嵌合BR96抗体或其片段。
70.用于治疗的权利要求12～52中任何一项所述的化合物。
71.制备式(Ⅰ)化合物的方法，
该方法包括(a)使式(Ⅱa)化合物与式(Ⅲ)化合物反应，
或者(b)使式[D-(C＝O)]化合物与下式化合物反应，并且如果需要，将产物进行分离，
其中D为药物部分，n为整数1～10，p为整数1～6，Y为氧或NH+2Cl-，Z为零或1，q为约1～10，X为配位体，R为迈克尔加成接受体，A为迈克尔加成加合物。
72.权利要求71所述的方法，其中X为免疫球蛋白或其片段。
73.权利要求72所述的化合物，其中X为选自BR96、BR64、L6、嵌合的BR96、嵌合的BR64、嵌合的L6、宽松的BR96、宽松的BR64、宽松的L6、宽松的嵌合BR96、宽松的嵌合BR64、、宽松的嵌合L6以及它们片段的免疫球蛋白。
74.权利要求73所述的化合物，其中免疫球蛋白为嵌合的BR96、宽松的嵌合BR96或其片段。
75.权利要要74所述的方法，其中D为选自阿霉素、柔毛霉素、阿霉素双乙氧乙酸酯、洋红霉素、去甲氧柔红霉素、表阿霉素、AD-32、4-吗啉基-阿霉素和3′-去氨基-3′-(3-氰基-4-吗啉基)-亚德里亚霉素的蒽环抗菌素。
76.权利要求75所述的方法，其中蒽环抗菌部分为阿霉素。
77.权利要求76所述的方法，其中n为5。
78.权利要求77所述的方法，其中Z为零。
79.权利要求78所述的方法，其中q为约4～8。
全文摘要
本发明提供了药物/配位体化合物(式I)，其中D为药物部分，n为整数1～10，p为整数1～6，Y为氧或NH在较好的具体实例中，配位体为免疫球蛋白，最好为嵌合的抗体或其片段。本发明还提供了由式(I)化合物作为有效成分的组合物、用作为制备式(I)化合物的中间体、制备式(I)化合物的方法，以及应用本发明化合物的方法。
文档编号C07K14/52GK1074684SQ93100709
公开日1993年7月28日 申请日期1993年1月23日 优先权日1992年1月23日
发明者D·韦尔纳, P·A·特雷尔, H·D·金, S·J·霍夫斯泰德, R·S·格林菲尔德, G·R·布拉斯罗斯基 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司