专利名称：以氨基葡聚糖为还原剂和保护剂制备胶态金属分散体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有交联多糖涂层的稳定胶态金属颗粒的制备方法，其中所说的交联多糖上连接有官能团。更具体地说，本发明涉及一种以氨基葡聚糖为金属离子还原剂及所得胶粒的涂层保护剂来制备所选胶态金属颗粒的方法，涂覆在颗粒上的氨基葡聚糖利用交联剂予以稳定。
溶液中的金属离子吸引在官能化的聚合物分子附近。金属离子还原成金属(O)原子使得金属(O)原子在某一特定聚合物位点处于过饱和状态。因此，金属颗粒的核化发生在各个聚合物分子的自身区域内。不同聚合物-金属区域间的空间位阻使得所述区域彼此独立，而颗粒上聚合物的官能团与金属原子之间的引力又使颗粒处于一个单一的区域范畴之内。由此产生的综合效应是，金属核被各个聚合物分子所固定，同时又防止了金属(O)颗粒聚集生长，即防止各聚合物分子中的核发生迁移和聚集形成较大的颗粒。
虽然聚合物分子可以防止金属(O)颗粒聚集生长，但由于金属离子向金属(O)颗粒核附近扩散，颗粒生长仍可能发生。当溶液中的可迁移金属离子耗尽时，颗粒的生长终止。由此生成的金属(O)颗粒粒度均匀，形状一致。有关均匀沉淀的详细资料可由下述文献查寻A.E.Nielsen的“沉淀动力学”(McMillan，纽约，1964);E.Matijevic，Accts.Chem.Res.，1422(1981);T.Sugimoto，Adv.Coll.Interface Sci.，2565-108(1987)。
通过审慎选择聚合物、金属离子、还原剂、各组份的选择浓度及进行反应时的温度已经生产出了不同金属的胶态分散体。在有保护聚合物如PVA(聚乙酸乙烯酯)存在时，简单的醇如甲醇或乙醇已被用作溶剂和还原剂。多元醇、乙二醇、二甘醇已同样用作溶剂和还原剂。官能化的聚合物如聚丙烯酸
(hydrazinium polyacrylate)在制备金、银、铜、铂和硒单分散颗粒时已作为还原剂和保护聚合物用。在制备金水溶胶时，含有连接在糖上、一般是葡萄糖上一至三个三羟基苯基羧酸基团的单宁可以作为还原剂和保护物质。例如，参见L.Hernandez等人，J.Colloid Sci.，3363-375(1948)(以氢为还原剂的铑-聚乙酸乙烯酯[Rh-PVA]聚合物);H.Thiele等人，J.Colloid Sci.，20679-695(1965)(聚丙烯酸的酰肼(PAH)-Au，Ag，Cu，Pt和polyethyleneimiacid-Au);H.Harai等人，J.Macromol.Sci.Chem.，A121117-1141(1978)(以甲醇为还原剂的Rh-PVA);H.Harai等人，J.Macromol.Sci.Chem.，A13633-649(1979)(以甲醇为还原剂的Rh-、Pd-、Os-、Ir-、和Pt-PVA);H.Harai等人，ibid.，A13727-750(1979)(以乙醇为还原剂的Rh-、Pd-、Ag-、Os-和Ir-PVP);F.Fievet等人，MRS Bulletin，1989，12，pp.29-34(Au-、Ag-、Pd-、Pt-、Cu-、Co-、Ni-、Cd-和Pb-多元醇);O.Siiman等人，J.Chem.Soc.Faraday Trans.，82851-867(1986)(Au-PVP-乙醇);H.B.Wieser的“无机胶体化学，Vol.I，胶体元素”(Wiley，纽约，1933)(单宁-Au);T.W.Smith等人，Macromol.，131203-1207(1980)(Se-PA肼)和T.W.Smith等人，J.Phys.Chem.，841621-1629(1980)(Fe-聚合物)。
胶态金已常用作抗体、酶、植物凝血素和其它蛋白质的吸附剂，这主要是因为蛋白质能非特异性地吸附在胶态金上。实际上，任何蛋白质材料都可吸附在胶态金上。保持活性状态的蛋白质-金物种已作为细胞表面标记物用于光学和电子显微镜。[参见“胶态金原理、方法及应用”，Vol.Ⅰ.Ⅱ和Ⅲ，M.A.Hayat，ed.(Academic Press，纽约，1989)，以及A.J.Verkleij和J.L.M.Leunissen的“细胞生物学中的免疫-金标记”(CRC Press，Boca Raton，Fla.1989)]。在M.J.De Brabander等人的US4，752，567中对用光显微镜通过偏振光外照明来检测粒径为10-100nm的胶态金属颗粒作了说明，特别令人感兴趣的是那些直接或间接吸附了抗体的胶态金颗粒。间接吸附是指抗体连接在第一吸附层上，例如，第二抗体、抗生物素蛋白或蛋白质A或G。配位体一葡聚糖复合物已吸附在胶态金上了。配位体包括植物凝血素、刀豆球蛋白A、蓖麻凝集素和小麦胚凝集素[D.Hicks和R.S.Molday，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.，261002-1013(1985)]以及哇巴因[R.J.Mrsny等人，Eur.J.Cell Biol.，45200-208(1987)]。
但是，蛋白质在水溶液中胶态金颗粒上的吸附是一可逆平衡反应。吸附有蛋白质的颗粒与未吸附即游离蛋白一般是通过离心法分离开的。但在分离除去游离蛋白后，重新制成纯化的蛋白-金属胶体悬浊液时，由于其自身发生再平衡，由此进一步损失了所吸附的材料。因此，长期保存纯的吸附蛋白-金共轭体尚不现实。本领域的一些工作者把纯化的蛋白-金胶体悬浮在含有阻滞剂如牛血清蛋白(BSA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)和其它聚合材料的缓冲溶液中以期提高稳定性。聚合材料可以覆盖在胶态金颗粒表面的任何裸露面上，由此防止了金颗粒的聚集然而，由于聚合材料大大地超过了吸附在胶态金上的蛋白质的量，因此会与蛋白质竞争胶态金位点，这样，不可避免地会有一些蛋白质从金上解吸下来，并作为游离蛋白存在于溶液中。
本发明的目的即在于制备出具有稳定化多糖材料涂层的胶态金属颗粒，优选是胶态金或银颗粒。本发明的另一个目的是利用所述的带涂层胶体制备稳定的蛋白-胶体共轭物。本发明的蛋白-胶体共轭物克服了因蛋白直接吸附在胶体金属表面而造成的不稳定性和定向问题。
本发明提供了制备具有固体芯核的单分散胶态金属(O)颗粒的方法，所说的胶态金属颗粒上涂覆有胺衍生的多糖层，该涂层带有多个不稳定的(pendent)官能团并在化学交联剂的作用下发生交联或被固定。所说的不稳定的官能团可以是，或者是带有末端醛或羧酸根，胺基，巯基或马来酰亚胺基以及多克隆或单克隆抗体。
本发明提供了一种一步法制备带涂层胶态金属(O)颗粒的方法，即，在足以能使金属盐还原为金属(O)颗粒，同时多糖又能涂覆在颗粒上的温度下，加热含金属盐和至少有一个，最好有多个还原糖组分的胺衍生多糖的水溶液一定时间。随后，用双官能交联剂，优选戊二醛、二胺(优选1，3-二氨基丙烷)，和还原剂，优选硼氢化钠，处理已涂层的颗粒，然后，纯化得到稳定化的涂有胺衍生多糖层的金属(O)颗粒。在此多糖既为金属离子的还原剂，又是所生成的零价胶态金属颗粒的涂层剂。多糖涂层用适当的交联剂通过交联而稳定化。此后，可将所得的已涂层且稳定的胶态金属颗粒与蛋白质如酶、植物凝血素、多克隆或单克隆抗体等进行共轭。这些蛋白质可连接亦可不连接可检测标记物如染料、含放射性元素的化合物、电子密集元素(electron dense elements)、酶等。所得的含蛋白胶态金属(O)共轭物可用于各种诊断和分析方法。
附图简要说明
图1A-1D示出了按本发明采用不同氨基葡聚糖/Au(Ⅲ)之比制备的金水溶胶在其可见光区的吸收消光光谱。
图2示出了混合氨基葡聚糖T-40和硝酸银水溶液而制成的银水溶胶的消光光谱。
图3中图3B为FITC-葡聚糖-Au(Ⅲ)溶液的吸附光谱，使混合的FITC-葡聚糖-Au(Ⅲ)溶液接近沸点温度形成金水溶胶，其吸附光谱示于图3A(上光谱)中。
本发明描述了具有多糖涂层的胶态金属(O)颗粒的制备，所说的颗粒特别有益于与抗体和其它蛋白质共轭。氨基葡聚糖是优选的多糖。本发明所述的葡聚糖是指任何D-葡萄糖的支链多糖，而不管其重复单元的支链点，即不管支链点在否1→2，1→3，1→4位。氨基葡聚糖是指已经过改性的带有一个或多个胺(NH2)基的葡聚糖。为了避免糖残基内部和残基之间发生交联(因为交联会使葡聚糖的胺官能化失效)，1，3-二氨基丙烷是优选的二胺。
许多不同的，且一般是双官能的交联剂如双[2-(琥珀酰亚胺基氧代羰氧基)乙基]砜、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯及戊二醛均可用于实施本发明。普通商购的戊二醛为优选的交联剂，其一般主要含在280nm处吸收的单体。但此戊二醛产品同时还含有某些在235nm处有吸收的聚合物种。聚合物种，三聚物或线形低聚物可能有足够的长度使存在于所吸附的氨基葡聚糖上的氨基之间形成分子内和分子间桥接。通过审慎选择反应条件，氨基葡聚糖可以适当地固定在胶态芯核颗粒上，这样，在后续处理过程中所说的糖不致被除去。由此，可以避免因游离氨基葡聚糖过度交联而形成较大的絮凝物，并可防止粒间交联。
为了适用于生物和医学领域，固定或交联在胶态金颗粒上的氨基葡聚糖涂层应带有能与生物活性物质共轭的官能团。生物物质如单克隆抗体共价偶合到涂层上比简单如吸附要好。利用“短链”二胺或聚胺及异双官能试剂可以使抗体即多克隆或单克隆抗体偶合到交联氨基葡聚糖表面涂层上。(后文中二胺一词包括三个或三个以上胺基的多胺)。二胺能与存在于交联氨基葡聚糖表面的残留醛或羧酸根发生反应，后二者是固有的或在本发明过程中存在的。二胺不仅能够阻滞醛和羧酸根，而且可以补充在交联过程中反应的胺基。二胺与醛基反应生成席夫碱类。然后席夫碱通过还原反应，最好用硼氢化钠还原成稳定的胺基。
为了避免同一颗粒上相邻醛或羧酸根交联，或者避免不同颗粒上这些基团相互连接，优选短链二胺。一个二胺基与涂层表面反应，其它未反应的可以直接或间接地偶合蛋白材料。二胺通常选自下组物质H2NCH2-(CH2)x-CHy(CH3)z和C6H4+a(NH2)2，其中x＝0-3，y＝1或2，当y＝1时，z＝1，或当y＝2时，z＝0;a＝0或6。其实例包括乙二胺、苯二胺、丙邻二胺、1，4-环已二胺、环已烯二胺、四亚甲基二胺等。三胺包括二亚乙基三胺和1，5-二氨基-3-(2-氨乙基)戊烷等。优选乙二胺。
生物物质偶合到固定的带有氨基葡聚糖涂层的胶态金颗粒上包括用水溶性异双官能试剂激活自由氨基，所说的试剂如盐酸2-亚胺基硫醇烷(iminothiolane)(IT)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环已烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、间-马来酰亚胺基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯、琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯，上述所列试剂作为戊二醛等的取代物。其中盐酸2-亚胺基硫醇烷及马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺基试剂是优选的。参见E.Ishikawa的Immunoassay Supp.，11-16(1980)和J.Immunoassay，4209-227(1983);M.Imagawa等人的J.Appl.Biochem.，441-57(1982);M.D.Partis的J.Protein Chem.，2263-227的(1983)。当用磺基-SMCC，在pH7.0-7.5时，磺基-SMCC的活性磺基琥珀酰亚胺基酯端与胺发生反应形成肽键。所形成的磺基-SMCC/二胺桥键单元其长度大约为16A°。
pH为6.5-7.5时，磺基-SMCC的马来酰亚胺基将与自由巯基反应形成稳定的共价硫醚键。因此，与磺基-SMCC反应的涂层颗粒不含任何会与磺基-SMCC中马来酰亚胺基端反应的自由巯基是必不可少的条件。用氨基葡聚糖作涂层剂解决了此问题，因为该糖与其它涂层材料如明胶不同，其不含任何自由巯基。
蛋白质，特别是单克隆抗体或多克隆抗体可以凭借其自身固有的或衍生而来的巯基连接到用磺基-SMCC官能化的氨基葡聚糖金胶粒涂层上的所说的磺基-SMCC中的马来酰亚胺基端上。带半胱氨酸残基的蛋白质本身即含巯基。为了引入外源巯基，可用Traut试剂，即盐酸2-亚胺基硫醇烷(IT)在pH7-10条件下激活蛋白质的胺基。当蛋白质为抗体时，用IT激活抗体上的赖氨酰和末端胺基。参见M.Ereinska的Biochem.Biophys.Res.Commun.，76495-500(1977);J.M.Lambert等人的Biochemistry，175406-5416(1978)和M.E.Birnbaumer等人的Biochem.J.，181201-213(1979)。
当使用本发明的氨基葡聚糖涂层金胶粒时，可以改变反应条件和试剂浓度以确定最佳偶合反应，由此，蛋白质，特别是抗体可以保持其最大的官能活性。马来酰亚胺在溶液中与巯基的反应速度相当快，因此应该使固定在所述颗粒上的这些基团有一定较长的反应时间，以确保反应完全。在抗体共轭反应中，特别是当采用IgM抗体时，为避免聚集作用，应选择最佳的颗粒和抗体浓度。IgM抗体的最佳方法可适用于等电点在约5.0-9.0范围内的所有单克隆抗体。一般说来，完成共价偶合所需要的抗体量比简单吸附所需要的重量少大约30倍，这对昂贵或难以获得的抗体来说是很重要的结论。
本发明不必再分别进行如下步骤先制备胶态金属颗粒，然后制成用于聚合物(涂层)吸附的胶体并交联。这些步骤通过采用下述本发明方法可以合而为一，即在足以使金属盐还原为胶态金属(O)颗粒的温度下，使金属盐与含有可氧化糖的胺衍生多糖如氨基葡聚糖反应一段时间，在该反应的同时多糖涂覆在所说的颗粒上。优选的温度为约90-100℃。根据本发明，可以使用还原电势等于或大于+0.7伏(H3IO6/IO5)的金属离子。[其实例可见“物理化学手册”第64版(CRC Prese，Boca RatonFL(1983-84)，第D-156页]。金和银盐是优选的，也可以用Rh(Ⅲ)、Pd(Ⅱ)、Pt(Ⅱ)和Ir(Ⅲ)的盐类。以金和银盐为非限制性实例，本发明所用的氨基葡聚糖在制备胶态金属颗粒及后续反应中具有如下多重作用1、作为Au(Ⅲ)→Au(O)或Ag(I)→Ag(O)的还原剂，其中，吡喃葡萄糖环首先氧化为醛
然后，再氧化为有机酸
2、作为胶体保护物种，因为氨基与金属离子或原子间有很强的相互作用力。另外，在溶液中氨基与金属阳离子结合后带正电荷，并使阳离子分散体稳定。虽然葡聚物能够还原Au(Ⅲ)或Ag(Ⅰ)离子，但其不能使所得胶体稳定。
3、在胶体形成过程中，使由糖基氧化而产生的醛基与已经存在于氨基葡聚糖上的氨基发生交联，生成席夫碱，-HC＝N-，由此进一步加强了颗粒-聚合物复合体。
4、交联剂如戊二醛可用于进一步桥接金属(O)颗粒涂层上的氨基，并包封住胶态颗粒，这样仅凭纯物理方法是不能使之释放的。按照上述平衡反应，后来共价连接到交联涂层上的蛋白质不会与胶态金属颗粒分离。
5、未反应的聚合物上的氨基和用二胺阻滞未反应的醛基所产生的氨基成为抗体或其它蛋白质连接到胶态颗粒涂层的连接位点。在蛋白质和涂层氨基之间可用桥连基团。
本发明的方法可用于制备粒径为5-100nm范围的胶态金属(O)颗粒。随着反应中所用原料试剂(氨基葡聚糖、金属离子)的浓度，形成胶体的温度，搅拌金属离子和氨基葡聚糖混合物的速率以及反应中所用氨基葡聚糖的平均分子量，所形成的颗粒的具体尺寸会有所变化。
在实施本发明时，应该考虑到用共价偶合法金属颗粒可能会出现的特殊问题。具体地说，表面金属原子或离子由于蛋白质共价结合到有机涂层时所常用的偶合剂、激活剂和阻滞剂的作用可能会很容易参与化合反应和沥滤。蛋白质结合至有机涂层时所用的含有此影响的一些典型试剂是亚胺基硫醇烷(iminothiolane)、戊二醛、乙二胺、半胱氨酸、碘乙酰胺及磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环已烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)。在实施本发明时，必须认真选择试剂及控制它们的浓度。尽管第一层聚合涂层通常可能容易涂覆到金属颗粒上，但在后来使用涂层颗粒过程中仍必须加以防范，因为小分子很容易穿过聚合物层中的微孔，金属颗粒表面仍可接触这些分子。
采用本发明方法实现的聚合涂层不必覆盖胶态金属颗粒的整个表面。因此，仍有颗粒聚集的可能性。然而，在用交联剂固定化之前，通过审慎选择聚合物浓度和分子量，可将胶体颗粒上的裸露斑点减少到最低程度。通过几次超离心分离和淘汰非流动残渣使涂层金胶体再分散后，可以消除聚集体。聚合物的大小应小于胶体金属颗粒的直径。对于直径为20nm的金粒，为了防止聚合物发生桥连絮凝，聚合物平均分子量应为约40，000道尔顿。聚合物分子必须围绕金粒，而不是金粒包裹聚合物分子。对于浓度为1012粒/mL的20nm直径的金粒，聚合物浓度范围应为约0.1-2.5mg/mL。
活化金粒与活性蛋白质如单克隆抗体反应的最佳条件可以依与其它胶粒的同类反应来确定。例如，为了避免颗粒聚集和得到在1μm平均直径的磁珠上载有单克隆抗体的良好表面，颗粒浓度为1.83-3.73×108粒/cm8，总的抗体浓度为0.313-0.625mg/mL。该颗粒浓度的平均粒子间距为64-81μm或64-81个粒径。20nm直径的胶态金粒一般在1.30×1012粒/cm3浓度下制备，得到的平均粒子间距为0.92μm或46个粒径。因此，为了在类似于磁粒的动力学条件下操作，必须将金溶液稀释3-6倍。
实施例1 氨基葡聚糖的制备方法1 小规模制备氨基葡聚糖用下述步骤制备氨基葡聚糖将葡聚糖中的吡喃葡萄糖环部分分解并氧化成醛官能基团，使醛基与1，3-二氨基丙烷偶联形成席夫碱键，将席夫碱键还原成稳定的氨基。在一个典型的步骤中，使20g葡聚糖溶解在150mL pH值为6.5的50mM醋酸钾缓冲液中。在大约10分钟期间和剧烈磁力混合条件下，向葡聚糖中滴加一种由2.14g高碘酸钠和25mL蒸馏水形成的溶液。在15-27℃的室温下搅拌得到的溶液约1.5小时，然后用蒸馏水渗析。将20mL 1，3-二氨基丙烷与20mL蒸馏水相混合，在冰浴中冷却，剧烈搅拌，并通过加入冰醋酸在约15分钟内将pH值从11.5调整到约8.7。通常用15-20mL冰醋酸。在15-20分钟内将渗析的葡聚糖滴入冷的二胺溶液中。加入完成后，在室温下搅拌生成的溶液约2.25小时。在室温下于约15分钟内向葡聚糖反应混合物加入一种由0.8g硼氢化钠在10mL0.1mM氢氧化钠中形成的还原溶液。在硼氢化物加入期间搅拌反应混合物，以消除大部分的泡沫。用蒸馏水彻底渗析该粗氨基葡聚糖溶液，直到流出物的电导率为3-4μmho/cm为止。此后用一个0.2μm的过滤器过滤渗析的溶液，在一台TDS-00030-A型号的Dura-Dry微信息处理机控制的冷冻干燥机中(FTS Systems，Inc.)冷冻干燥24小时，得到4.25g浅黄色片状晶体，产率为21%。
方法2 大规模制备氨基葡聚糖将方法1的程序改进为大规模制备氨基葡聚糖，并增加引入葡聚糖的氨基数目。用空心纤维膜过滤代替渗析，用较小的二胺-高碘酸盐摩尔比来避免进一步切割糖聚合物成为低分子量的片段。一个空心纤维筒(聚砜，3ft3膜表面积，1mm直径纤维和截滞5000MW)与一台输入动力泵(两个泵头，带有18号Norprene食品级管，最大流量为约4.56升/分)垂直安装在一起，输送压为15-20psi，该压力与滞留管线(retenate line)中的5-1Opsi压力相对应。以50-100mL/min的速度收集滤液。用20-30升蒸馏水冲洗6-8小时。电导率降低为约3-4μmho-cm-1，pH值为6.0-6.5。在脱盐期间维持2升的进料体积，而后在第一次洗涤氧化葡聚糖时浓缩到800mL，在第二次洗涤氨基葡聚糖时浓缩到400mL。
在一种标准的放大制法中，将80g葡聚糖传到装有600mL蒸馏水的1夸[升]玻璃混合器的杯中。以中等速度将该固体在2-5分钟内加入其中以溶解所有葡聚糖。将8.56g高碘酸钠溶入100mL蒸馏水中，在10分钟内利用剧烈的磁力搅拌将形成的溶液滴入到葡聚糖溶液中。加入完毕后，在室温下再搅拌形成的溶液3小时。随后用蒸馏水稀释所得粘稠反应混合物至2升，并用一个空心纤维筒脱盐。初始电导率为1.5mmho-cm-1或更高，初始pH值为4.0。用18-22升蒸馏水，使最终电导率约为3-4μmho-cm-1，最终pH为6.0-6.5。洗后的氧化葡聚糖溶液的最终体积为800mL。
在10分钟内和室温下，向洗过的氧化葡聚糖溶液中慢慢加入80mL无色的1，3-二氨基丙烷液体。然后在室温下再搅拌生成的混合物3小时。搅拌结束后，在磁力搅拌条件下，在5分钟内将溶于40mL1mM氢氧化钠水溶液的3.2g硼氢化钠加到室温下的氨基葡聚糖反应混合物中。硼氢化钠加完后，再搅拌生成的混合物1小时，然后用一个空心纤维筒脱盐。初始电导率为5.0mmho-cm-1或更高，初始pH值为12.0。用了约20-25升蒸馏水来将电导率降低到约3-4μmho-cm-1和pH降到6.0-6.5。氨基葡聚糖的最终体积为400mL。使该溶液通过一个0.2μm的无菌醋酸纤维素过滤器单元，然后冷冻干燥48小时，得到48克浅黄色片状晶体，产率为52%。
对用上述方法由葡聚糖T-2M制备的两种氨基葡聚糖样品进行了元素分析(C，H，N)，结果如下样品120g葡聚糖规模，渗析脱盐。
试验值C，43.04;H，6.60;
N，1.09;
O(有差别)，49.27。
样品280g葡聚糖规模，膜过滤脱盐。
试验值C，42.53;H，5.52;
N，1.01;
O(有差别)，49.94。
对C46H79NO37·3H2O的计算值C，42.76;H，6.63;N，1.08;O，49.53。
对两种方法制备的氨基葡聚糖的分析结果是很相似的，这说明不管是渗析脱盐还是膜过滤脱盐都得到了同样的产物。对样品1，得到的经验公式C46H84NO40非常类似于式C46H79NO37·3H2O，后者基于29个葡萄糖单元(C6H10O5)，1个完全由二胺取代的糖环单元(C12H28N4O3)和12个单位的水。所以，葡聚糖中的二胺取代程度在样品1中为1/30，而基于100%高碘酸盐分解和二胺取代的理论值为1/12。由样品2得到的经验式C49H90NO43非常近似于式C49H84NO40·3H2O，后者基于31个葡萄糖单元、1个二胺完全取代的糖环单元和12个单元的水。样品2的葡聚糖中二胺的取代度为1/32。
实施例2 用氨基葡聚糖制备金水溶胶。
先制备一种贮备金溶液将112.4mg HAuC1(49%Au)溶入1L蒸馏水中，得到一种2.8×10-44MAu(Ⅲ)溶液。使贮备金(Ⅲ)溶液(380mL)沸腾，快速搅拌，并用吸管加入45.0mL浓氨基葡聚糖(10.3mg/mL)。约1分钟后，混合物的初始浅紫红色变成酒红色。煮沸混合物并搅拌15-20分钟，以完成反应，并使金溶胶总体积变为200mL，使氨基葡聚糖浓度为2.3mg/mL(0.23%w/v)。使用带有1X(1X＝3.3%糖残基取代基)、2X(6.6%)和3X(9.9%)摩尔数量氨基的平均分子量为10，000、40，000和2，000，000(T-10，T-40和T-2M)的氨基葡聚糖，得到类似的结果。使用在实施例1所述葡聚糖的1X氧化中所用量2和3倍的高碘酸钠，得到2X和3X氨基葡聚糖。用来形成席夫碱的1，3-二氨基丙烷量保持不变。
下列氧化还原反应式给出了反应的化学计量。第一个反应式涉及分解和氧化吡喃葡萄糖环成为醛和还原Au(Ⅲ)成为Au(O)2AuCl4-+3-(OH)CH-CH(OH)-→2Au(O)+8Cl-+6-CH(O)+6H+第二个反应式是醛氧化成为羧酸和Au(Ⅲ)还原成Au(O)
Au(Ⅲ)转化为Au(O)的下一步是在可见光区域监测金胶体的吸收光谱。约20nm直径的小金粒一般在水溶液中在520nm处有最大吸收光谱。该峰移向较长波长转移表示较大的颗粒或初始颗粒集结成为双重体、三重体等等。通过分析一系列制品的可光光谱，确定了产生单一型、聚合物稳定化颗粒所需的最佳氨基葡聚糖-金摩尔化。利用1X氨基葡聚糖、衍生T-10，在0.005、0.010、0.015和0.020%w/v的浓度下，得出了图1A-1D。未反应的糖单元分别为1.49×10-5、2.98×10-5、4.47×10-5和5.95×10-5摩尔。用了50mL贮备Au(Ⅲ)溶胶或1.40×10-5金。未反应的糖与Au的摩尔比分别约为1∶1(图1A)、2∶1(图1B)、3∶1(图1C)和4∶1(图1D)。图1所示结果表明，要获得一种稳定的氨基葡聚糖保护的金水溶胶，需要3∶1或更高的摩尔比。使用较低的比率，结果形成了聚集的颗粒。
实施例3 葡聚糖与氯金酸反应。
将2.5g葡聚糖T-40溶于50mL蒸馏水中。将10mL(3mmol糖残基)这种溶液加到95mL(0.03mmol Au)沸腾的贮备Au(Ⅲ)溶液(2.8×10-4M Au)中。煮沸该混合物，并进行剧烈的磁力搅拌2-3分钟，在此期间出现一种红紫色悬浮液。继续煮沸5分钟后，在容器壁上形成浅红色沉淀物。该沉淀物是不稳定的固体金，它被葡聚糖分解成细小的胶体状态。
实施例4 用氨基葡聚糖制备银水溶胶。
将135μL 0.589M的硝酸银(0.080mmol Ag)溶液加到95mL蒸馏水中。使该溶液沸腾并加入16.1mL(0.6mmol糖残基)氨基葡聚糖T-40(6.2mg/ml)。继续使之沸腾并剧烈地磁力搅拌该混合物20分钟，在此期间，溶液慢慢变黄，尔后变红。将银粒悬浮液冷却到室温，测出其特性吸收光谱图2，在395nm有一波峰，接近500nm有肩峰，A395/A500＝4.56。在烘箱中处于90℃的一个派热克斯(pyrex)反应瓶中进行相同的反应3小时后还未见颜色变化，但得到一种黄色银溶胶，在24小时后该溶胶变红。在90℃进行的一种贮备Au(Ⅲ)溶液与氨基葡聚糖的平行烘箱反应用了3.5小时，得到一种酒红色金溶胶。
实施例5 用荧光素异硫氰酸酯(FITC)-葡聚糖制备金水溶胶。
将25mg FITC-葡聚糖(δ型;17，000MW;0.01mol FITC/mol葡萄糖残基)加到5mL沸腾的贮备Au(Ⅲ)溶液(2.8×10-4M Au)中。尽管固体葡聚糖衍生物溶在了水中，但未检测到反应。5分钟后，向沸腾的混合液中再加入10mL贮备Au(Ⅲ)溶液，再过15分钟后，出现表征胶态金的酒红色。图3A和3B示出了吸收光谱。Au(Ⅲ)在420nm有一吸收峰，接近480nm处有一肩峰，细分散金粒在535nm处有一附加带。用25mg FITC-葡聚糖(2，000，000 MW;0.04mol FITC/mol葡萄糖残基)在20ml贮备Au(Ⅲ)溶液中得到了类似的结果。在一台的Beckman L8-70超离心机的SW60转子中，在15℃和20，000rpm转速下对FITC-葡聚糖金溶胶离心分离30分钟，除去上层清液，将流动性胶体金残余物再分散在pH值为7.2的1X磷酸盐缓冲的盐水中。红色的胶态金粒在一台荧光显微镜下没有显示任何FITC的绿色辐射。
实施例6 交联胶态金上的氨基葡聚糖将0.8mL 25%的戊二醛加到200mL在0.23%w/v氨基葡聚糖存在下制备的pH约为6的胶态金悬浮液(实施例2)中。在室温下搅拌该反应混合物1小时。向其中加入乙二胺(0.320mL)，得到的混合液再搅拌2小时。通常，二胺选自H2NCH2-(CH2)x-CHy(CH3)z-NHz和C6H4+a(NH2)2，其中x＝0-3，y＝1或2，和y＝1时z＝1或者y＝2时z＝0;a＝0或6。优选乙二胺。通过加入0.303g溶在2mL 1mM氢氧化钾水溶液中的硼氢化钠并搅拌该反应混合液30分钟，还原添加二胺后形成的席夫碱键。还原之后，用蒸馏水彻底渗析该混合物，使电导率大约为66μmho/cm。然后，在15℃和25，000rpm转速下，于一台Bckman L8-70超离心机Ti50.2转子的25mL管中对渗析的溶液进行40分钟离心分离。使大部分胶态金-氨基葡聚糖流动层很容易地再分散于100mL 1X磷酸盐缓冲的盐水(PBS)溶液中。用一个1mm光程石英比色皿，观察到λmax＝520nm处的吸收度读数为0.24-0.29单位。该读数表示存在单粒金。
用多角度多普勒电脉光在一台Coulter DELSA 440上散射，测定用T-40衍生的、交联的氨基葡聚糖涂覆的金粒的流动性。在水溶液中，pH范围为3.5至10.3时，记录的流动性为+0.486(11)×10-4cm2V-1S-1。利用Huckel方程，用该数据算得电势为+9mV，并将涂层金粒确立为阳离子探针。将T11单克隆抗体(Coulter Immunology，Hialeah，Florida)共轭到氨基葡聚糖涂覆颗粒(见下文)上，不改变颗粒的阳离子性质。
实施例7 用FITC-葡聚糖交联胶态金上的氨基葡聚糖将0.519mL氨基葡聚糖、T-2M(10.3mg/ml，0.033mmol葡萄糖残基)溶液加到10mL沸腾的贮备Au(Ⅲ)溶液中(2.8×10-4M)。煮沸该混合物并剧烈地磁力搅拌15分钟，以得到一种酒红色金粒悬浮液。向酒红色混合物中加入溶于2mL蒸馏水的26.5mg FITC-葡聚糖T-2M(δ，0.004取代度)，在室温下再搅拌40分钟得到的混合物。由于FITC共轭到葡聚糖上需要一元胺基团或葡聚糖，δ材料因而大概含有与FITC共轭的氨基葡聚糖。因此，通过向混合物加入40μL25%的戊二醛并进一步搅拌1小时来进行交联反应。为了骤冷交联反应，加入16μL乙二胺，并将形成的混合物搅拌1.5小时。最后，加入含15mg硼氢化钠的0.1mL 1mM KOH并混合0.5小时，以便通过还原来稳定席夫碱。然后，在一个SW60转子中于15℃和20，000rpm转速下离心分离30分钟由氢硼化物还原的混合物，除去上清液，使可流动金渣再分散在1%BSA、0.17%叠氮化钠和1X磷酸盐缓冲的盐水中。在荧光显微镜下观察到的这些金粒产生了鲜绿色的TIFC辐射。
实施例8 用磺基-SMCC活化交联的氨基葡聚糖-金。
虽然试用过不同的磺基-SMCC/金比，但用每毫升交联氨基葡聚糖金悬浮液2.25μL磺基-SMCC(10mg/ml，在1XPBS中)得到了最好的结果。在一典型反应中，将56.25μL磺基-SMCC加到25mL交联的氨基葡聚糖金悬浮液中。搅拌混合物1小时，然后在15℃和20，000rpm下离心分离2次30分钟。借助于超声混合，将大部分可流动层首先在25mL此后在7.8mL 1X PBS中再分散。在使用前，用一台低蛋白质结合的0.2μm过滤机过滤得到的活化氨基葡聚糖金溶胶。
实施例9 用盐酸2-亚胺基硫醇烷(IT)活化抗体制备在含0.1%NaN3的1X PBS中含有43.77mg/mL T11单克隆抗体的贮备溶液。对于在15mg/mL浓度下利用30mg T11抗体的反应，总的反应体积应为2.00mL。若利用15∶1的IT∶T11活化比，需要2.81μmol(0.388mg)或194μL在1X PBS中的2mg/mL的IT。因此，将1.121mL 1XPBS溶液加到0.685mL T11贮备溶液中。混合了所有反应物溶液的总体积为0.194mL IT+1.121mL PBS+0.685mL T11＝2.0mL。在反应试管中滚动混合该溶液1小时。然后将反应试管中的物料加到一个100mL G-50交联葡聚糖凝胶柱的顶部，平衡，并用500mL 1X PBS洗涤。用1X PBS洗脱衍生的单克隆抗体，用一紫外监测器收集多个50mL的馏份。汇合在280nm处吸收谱带中间的各馏份，用A280值确定T/IT产物浓度。通常，该浓度约为2.5mg/mL。
实施例10 T11/IT和磺基-SMCC衍生XL-氨基葡聚糖金粒的共轭。
将2.200mL在1X PBS中的2.854mg/mL T11/IT试样加到7.8mL如上所述制备的磺基-SMCC活化的涂有氨基葡聚糖的金粒中。该T11/IT溶液以0.5mL增量方式加入，每次添加之间进行声波处理和迅速的物理混合。然后使形成的悬浮液在一15mL试管中滚动混合大约2小时。通过加入L-半胱氨酸共轭抗体后，阻滞磺基-SMCC活化颗粒上未反应的马来酰亚胺基团。通常，将0.120mL在1X PBS中的5mg/mL L-半胱氨酸加到10mL共轭混合液中[(0.0120mL L-半胱氨酸)×(共轭混合液体积)]，滚动混合得到的悬浮液约15分钟。然后，在15℃和10，000rpm条件下，于一个Beckman 50.2Ti转子中离心分离该混合物30分钟。使大部分流动层再悬浮在含0.1%NaN3和1%BSA的1X PBS中，并用一台0.2μm过滤机过滤。得到的抗体共轭、交联氨基葡聚糖涂覆的金粒发现适合在光学和电子显微镜检测中用作标记物。用下述方法验证了这些金粒上T11抗体的高活性(1)用GAM-FITC(对鼠免疫球蛋白-FITC有抗性的山羊抗体，Coulter免疫学)作为第二抗体加到一种T11-氨基葡聚糖-金粒和全血液的混合物中，并在一台荧光显微镜下观察到T11+细胞被金标记完全涂覆;(2)用一台非照明结构(epiillumination configuration)倒相显微镜(Zeiss)，直接观察到细胞表面上有小红斑点，即为T11+细胞上的金粒。
另外，还成功地制备了若干抗体共轭的、涂覆了交联氨基葡聚糖的金粒，其中使用了1、带有2X氨基的氨基葡聚糖T-40;
2、带有1X氨基的氨基葡聚糖T-40;
3、带有1X氨基的氨基葡聚糖T-2M;和4、带有1X氨基的氨基葡聚糖T-10。
制备这些涂有交联氨基葡聚糖的金粒的每一种时都使用了三种不同的T11单克隆抗体共轭条件。它们是1、用磺基-SMCC活化1X，用0.833mg/ml T11/IT共轭，不用L-半胱氨酸阻滞;
2、用磺基-SMCC 1X，用0.653mg/ml T11/IT共轭，用0.0120x体积数的5mg/ml L-半胱氨酸阻滞;和3、用磺基-SMCC活化(1/3)X0.628mg/ml T11/IT和0.0120x体积数的5mg/ml L-半胱氨酸。
实施例11 在细胞群分析中的抗体-氨基葡聚糖-胶态金属复合体。
用胶态金共轭抗体和两种荧光染料共轭抗体(荧光纱和若丹明或藻红素+抗体)完成了单个细胞的三重抗体染色，以用于偏振光外照明光显微镜检测(J.J.M.Van.Dongen等人，J.Immunol、Methods，801-6，1985)和流动血细胞计数(R.Festin等人，J.Immunol、Methods，10123-28，1987)。在金(直角光散射)和荧光标记物之间来看到相互干扰。因此，可以在用流动血细胞计数或其它方法例如T、Russell，M.C.Hajek，C.M.Rodriquez，和W.H. Coulter的WO90/13013所述的方法进行的各种细胞群分析中，可以单独或与荧光染料共轭抗体一起使用抗体-氨基葡聚糖-胶态金复合体。小颗粒的其它金属例如铂、钯、铱或铑(它们的最大吸收光在紫外区而不是可见光区域(金胶体在约520nm;银胶体在约400nm))证实可更好地用作抗体-氨基葡聚糖-胶态金属类型的细胞标记，因为它们的吸收光带与一般荧光染料的散射光带不重迭。
为了分析T细胞分组(T4，T8)，使一种T4或T8单克隆抗体-氨基葡聚糖-金胶体复合体首先与一例全血液样品(1x106总淋巴细胞最大值)混合6分钟。然后加入T4-RD1(藻红素)和T8-FITC(Coulter免疫学，Hialeah，FL)荧光标记物并混合10分钟。此后通过Q-PREP(Coulter免疫学)溶解(甲酸)和RBCs的骤冷(碳酸钠等和仲甲醛)处理形成的混合物。随后分析样品，通过流动血细胞计数分析在淋巴细胞前移(胶态金属标记)对侧散射区域中的T4和T8细胞群以及T细胞特异性。为了分析在全血液淋巴细胞中的T4和T8细胞群，用T4和T8-聚苯乙烯微珠共轭体(约2μm直径)成功地进行了类似的分析。重要的是，微珠或金属粒-抗体共轭体在加荧光标记物之前要先与全血液混合，以避免T细胞上的抗原位点被更小且流动性更强的分子染料-抗体共轭体所饱和。
金属胶体标记的淋巴细胞的前移与侧散射关系图在程度和方向上是不同的，这取决于金属粒的大小、形状和折光系数。因此，可以相信，两种或多种不同胶态金属的颗粒可与不同的单克隆抗体作共轭，用其与多重荧光标记物通过流动血细胞计数分析散射点不重迭区域中的细胞小群。这可以用于调查以细胞小群例如约106细胞表达的抗原位点之间的差异。
权利要求
1.一种由金属盐溶液制备胶态金属(O)颗粒并用同时亦为所述金属盐还原剂的高分子有机化合物涂覆所述颗粒的方法，所述方法包括(a)加热一种含有一种胺衍生的、含可氧化糖的多糖和一种能被所述含可氧化糖的多糖还原的金属盐的溶液一段时间，加热温度足以将所述金属盐还原成胶态金属颗粒，同时，所述多糖涂覆在所述颗粒上；和(b)用一种双官能交联剂、一种二胺和一种还原剂稳定涂在所述颗粒上的胺衍生的多糖。
2.按照权利要求1所述的方法，其中所述胺衍生的多糖是氨基葡聚糖。
3.按照权利要求1所述的方法，其中所述金属盐的还原电势为+0.7伏或更高。
4.按照权利要求1所述的方法，其中所述金属盐选自能被所述多糖还原的金、银、铂、钯、铑和铱盐。
5.按照权利要求4所述的方法，其中所述金属盐是金盐或银盐。
6.一种制备涂有一种胺衍生的、含可氧化糖的多糖的胶态金属(O)颗粒的方法，该方法包括(a)加热一种可用糖还原的金属盐的水溶液，并向所述溶液中加入一种至少具有一种还原糖组分的胺衍生的多糖的水溶液;(b)在90-100℃温度范围内将步骤(a)所得溶液加热并混合10-30分钟，以便将所述金属盐还原成悬浮在所述多糖溶液中的胶态金属颗粒;(c)将步骤(b)所得溶液冷却到室温，向该冷却的溶液中先加入一种能与所述胺衍生多糖上的氨基反应的含水双官能试剂;(d)向步骤(c)的产物加入一种有机二胺;(e)还原步骤(d)形成的可还原基团;(f)用水渗析步骤(e)的溶液;(g)离心分离步骤(f)的产物，得到能够作为胶体分散的、涂有胺衍生多糖的颗粒。
7.按照权利要求6所述的方法，其中所述的衍生的多糖是氨基葡聚糖。
8.按照权利要求6所述的方法，其中所述金属盐的还原电势为+0.7伏或更高。
9.按照权利要求6所述的方法，其中所述金属盐选自能用所述多糖还原的金、银、铂、钯、铑和铱盐。
10.按照权利要求9所述的方法，其中所述金属盐选自金盐或银盐。
11.按照权利要求6所述的方法，其中所述首先加入的双官能试剂是戊二醛。
12.按照权利要求6所述的方法，其中所述二胺选自H2NCH2-(CH2)x-CHy(CH3)z和C6H4+a(NH2)2，这里x＝0-3，y＝1或2，且y＝1时z＝1或y＝2时z＝0;a＝0或6。
13.一种制备涂有一种含可氧化糖的胺衍生多糖且其上连接有一种蛋白质的胶态金属(O)颗粒的方法，所述方法包括(a)按照权利要求1制备由氨基葡聚糖涂覆的胶态金属颗粒;和(b)使步骤(a)的颗粒与一种能与所述颗粒上存在的胺基形成一种共价键的蛋白质反应。
14.按照权利要求13所述的方法，其中所述蛋白质是一种单克隆抗体。
15.按照权利要求13所述的方法，其中所述胶态金属颗粒选自胶态金、银、铂、钯、铑和铱胶态颗粒。
16.按照权利要求15所述的方法，其中所述胶态颗粒是胶态金或银颗粒。
17.一种制备涂有含还原糖的胺衍生多糖且其上连有蛋白质的胶态金属(O)颗粒的方法，该方法包括(a)按权利要求1制备胶态金属颗粒;(b)将所述颗粒上存在的氨基转化成选自巯基和马来酰亚胺基的一个基团;和(c)使步骤(b)的产物与下述物质反应(1)一种带有可与所述巯基和马来酰亚胺基反应的官能团的蛋白质，或者(2)一种具有选自巯基和马来酰亚胺基中的至少一个官能团的衍生蛋白质，使得当所述颗粒含有巯基时，蛋白质含有马来酰亚胺基，所述颗粒含有马来酰亚胺基时，所述蛋白质含有巯基。
18.按照权利要求17所述的方法，其中所述蛋白质是一种带或不带可检测标记的单克隆抗体，该标记例如可为酶、染料、电子密集元素、含放射性元素的化合物等等。
19.按照权利要求17所述的方法，其中所述胶态金属颗粒选自胶态金、银、铂、钯、铑和铱胶态颗粒。
20.按照权利要求17所述的方法，其中所述胶态颗粒是金或银胶态颗粒。
21.具有高分子有机涂层的胶态金属(O)颗粒，所述涂层包括一种稳定化的胺衍生的多糖，所述涂层是借助于一种双官能交联剂、一种二胺和一种还原剂稳定的。
22.按照权利要求21所述的颗粒，其中所述胺衍生的多糖是氨基葡聚糖。
23.按照权利要求21所述的颗粒，其中所述双官能交联剂是戊二醛。
24.按照权利要求21所述的颗粒，其中所述金属(O)选自金、银、铂、钯、铑和铱。
25.按照权利要求24所述的颗粒，其中所述金属(O)是银或金。
26.具有稳定的胺衍生的多糖涂层的胶态金属(O)颗粒，所述颗粒由下述方法制备(a)加热一种含有包括可氧化糖的胺衍生多糖和一种能被所述多糖还原的金属盐的水溶液一段时间，其温度足以还原所述金属盐成为胶态金属颗粒，同时使所述多糖涂覆所述颗粒上;(b)用一种双官能交联剂稳定所述颗粒上的胺衍生的多糖涂层;(c)使步骤(b)的产物与一种有机二胺反应;并用一种还原剂还原得到的产物;和(d)将步骤(c)的产物与杂质分离开，得到一种涂有稳定的胺衍生的多糖涂层的金属颗粒。
27.按照权利要求26所述的颗粒，其中所述胺衍生的多糖是一种氨基葡聚糖。
28.按照权利要求26所述的颗粒，其中所述双官能交联剂是戊二醛。
29.按照权利要求26所述的颗粒，其中所述金属(O)选自金、银、铂、钯、铑和铱。
30.按照权利要求29所述的颗粒，其中所述金属(O)是金或银。
31.具有一层稳定的胺衍生多糖涂层且有一种蛋白质共价键合在所述涂层上的胶体金属(O)颗粒，所述颗粒包括(a)按权利要求6制备的颗粒和一种共价键合在所述颗粒的多糖涂层上的蛋白质;或者(b)按权利要求6制备的颗粒，使之进一步反应，生成有反应性硫氨基或马来酰亚胺基团连在多糖涂层上和蛋白质共价地键合在所述涂层上的巯基或马来酰亚胺基团上的颗粒。
32.按照权利要求31所述的颗粒，其中所述蛋白质选自多克隆和单克隆抗体、酶、植物凝血素等等。
33.按照权利要求31所述的颗粒，其中所述蛋白质是一种单克隆或多克隆抗体。
34.按照权利要求31所述的颗粒，其中所述蛋白质具有一种与其相连接的、可检测的酶或含有放射性元素的物质或染料。
全文摘要
本发明涉及胶态金属(O)颗粒及其制备方法，该颗粒有一层带不稳定的氨基团的交联氨基葡聚糖涂层。该氨基葡聚糖作为一种还原剂用来把金属离子还原成金属(O)颗粒，并作为保护剂涂在形成的金属(O)颗粒上，用交联剂稳定氨基葡聚糖涂层后，涂覆的颗粒可用来共价键合蛋白质。得到的含蛋白质的胶态颗粒可以用来作为光学或电子显微镜检测、免疫学和生物学测定中的标记物，并可能作为治疗药剂。
文档编号C07K16/00GK1074844SQ9310052
公开日1993年8月4日 申请日期1993年1月29日 优先权日1992年1月29日
发明者奥拉威·希曼, 亚历山大·伯士蒂恩 申请人:库尔特有限公司