专利名称：2′,5′－寡聚腺苷酸的双重作用抗病毒衍生物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一些治疗用2′，5′-寡聚腺苷类似物，药用共聚物和这些类似物的组合物，以及它们的应用。
本发明中的主题物质的全名包含有特别长的专业术语。通常专业人员都将这些术语用常用的缩写代替。下面首先给出在本文中可能用到的这些专业术语的常用缩写。缩写RT，逆转录酶A，腺嘌呤核苷(腺苷)或腺苷酸或腺苷酰(基)，虫草品或C或3′-dA，3′-脱氧腺苷或3′-脱氧腺苷酸，A-3′-氨基，3′-氨基-3′-脱氧腺苷杀结核菌素，4-氨基-7-(β-D-呋喃核糖基)-吡咯并-〔2，3-d〕吡啶3′-dATP，3′-脱氧腺苷三磷酸ATP，腺苷三磷酸I，肌苷或肌苷酸或肌苷酰基木-A(Xylo-A)或木糖腺苷，9-β-D-呋喃木糖基-腺苷
dCF或2′-脱氧助间型霉素，(R)-3-(2-脱氧-β-D-呋喃苏糖基)-3，6，7，8-四氢咪唑并〔4，5-d〕二氮杂-8-醇2-5A或2′，5′-寡(A)或2′，5′-寡腺苷酸，由2′，5′-磷酸二酯键连接的腺苷酸寡聚体及其5′末端三磷酸衍生物C，虫草品2′，5′-虫草品类似物或2′，5′-寡聚虫草品，由2′，5′-磷酸二酯键连接的寡聚3′-脱氧腺苷酸及其5′末端三磷酸衍生物2′，5′-An或核心寡聚体，2′，5′-磷酸二酯键连接的腺苷酸寡聚体2′，5′-A3或2′，5′-腺苷酸三聚体核，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)腺苷2′，5′-A4或2′，5′-腺苷四聚体核，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)腺苷2′，5′-3′dA3或2′，5′-C-C-C或(2′，5′)虫草品三聚体核，3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷酰-(2′，5′)3′脱氧腺苷2′，5′-C-C-C-C或2′，5′虫草品四聚体核，3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷3′，5′A3，腺苷酰(3′，5′)腺苷酰(3′，5′)腺苷2′，5′-I3或2′，5′-肌苷三聚体核，肌苷酰(2′，5′)肌苷酰(2′，5′)肌苷
dd benz，苯并咪唑酰(2′，5′)5，6-三氯苯并咪唑核糖EBV，EB病毒(爱博斯坦-巴氏病毒，爱-巴病毒)EBNA，与早期核抗原联合的爱-巴病毒HBV，乙肝病毒HIV，人免疫缺损性病毒，包括HIV-1，HIV-2以及其它所有亚型的HIV病毒HBLV，人嗜淋巴B细胞病毒HTLV，人嗜淋巴T细胞病毒，包括HTLV-I，HTLV-II和HTLV-III，以及其它所有的HTLV亚型IFNαα-干扰素rIFN-αA重组α-干扰素dsRNA双链核苷酸2′，5′-A-A-Tu，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)杀结核菌素2′，5′-Tu-Tu-Tu，(2′，5′)杀结核菌素酰(2′，5′)杀结核菌素酰(2′，5′)杀结核菌素2′，5′-A-A-ara-A，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)阿糖腺苷2′，5′-C-C-A，3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)腺苷2′，5′-A-C-C，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷2′，5′-C-A-C，3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷2′，5′-C-C-A，3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)腺苷2′，5′-A-C-A，腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)腺苷2′，5′-木-A3，木糖腺苷酰(2′，5′)木糖腺苷酰(2′，5′)木糖腺苷2′，5′-木-A4，木糖腺苷酰(2′，5′)木糖腺苷酰(2′，5′)木糖腺苷酰(2′，5′)木糖腺苷Ac，乙酰基Bz，苄基MMTr，5′-O-对-甲氧基三苯甲基2′，5′-三苯甲基-C3，5′-O-对-甲氧基三苯甲基-3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷2′，5′-三苯甲基-A3，5′-O-对-甲氧基三苯甲基腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)腺苷2′，5′-C-C-dCF，3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)2′-脱氧助间型霉素2′，5′-A-A-A-3′-氨基，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)3′-氨基-3′-脱氧腺苷SiTBD，叔丁基二甲基硅烷基或-Si(CH3)2C(CH3)32′，5′-A(si)-A(Si)-A，3′-O-叔丁基二甲基硅烷基-腺苷酰(2′，5′)3′-O-叔丁基二甲基硅烷基(2′，5′)-腺苷2′，5′-A-A-A-3′-O-甲基，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)3′-O-甲基腺苷2′，5′-A-A-A-3′-O-戊基，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)3′-O-戊基腺苷2′，5′-A-A-A-3′-O-己基，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)3′-O-己基腺苷2′，5′-A-A-A-3′-O-庚基，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)3′-O-庚基腺苷2′，5′-EHNA-A-A，赤-9-(2-羟基-3-壬基)-腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)腺苷缩写“四聚体”化合物代表下面列出的腺苷酰(A)和3′-脱氧腺苷酰(C)单位2′，5′-A-A-C-C，腺苷酰(2′，5′)腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷酰(2′，5′)3′-脱氧腺苷以上化合物缩写时也可省去2′，5′前缀，连字号和3′后缀；因此2′，5′-C-C-C-3′也被缩写成CCC。
作为干扰素介导的抗病毒领域知识的扩展，2′，5′-寡聚腺苷的化学合成和酶合成及其作为抗病毒反应调节剂的应用，已成为人们注意的焦点。在植物和动物中，2′，5′-寡聚(A)是天然广谱抗病毒防御机理的一部分。人们普遍认为，2-5A路径(也就是熟知的2-5A/L-RNA酶路径或抗病毒体系)存在于干扰素的抗病毒机理中，其也参与细胞生长和分化的调节。
该路径包括2-5A激活潜化的内源性核糖核酸酶(RNA酶L，EC3.1.27)。2-5A由2′，5′-寡聚腺苷酶合成酶(在下文中指“2-5A合成酶”)从ATP合成得到〔ATP(2′，5′)寡聚(A)-腺苷转移酶(EC2.7.7.19)〕。当被双链RNA激活后，2-5A合成酶将ATP转变成2-5A，即，2′，5′-连接的寡聚腺苷酸链(并在5′末端连有一个三磷酸)。2-5A合成酶以不同的异构酶形式存在，被干扰素诱导产生，但是在没有干扰素存在的情况下也能检测出低水平的2-5A合成酶。2-5A通过结合并激活它唯一的已知靶酶〔只依赖2-5A的核糖核酶内切酶(RNA酶L)〕。后者裂解病毒成细胞的mRNA或rRNA，因此抑制蛋白质的合成〔Hovanessian等，Eur.J.Biochem.93515-526(1979)；Kerr等Proe.Natl.Acad.Sci.USA 75256-260(1978)〕。真正的2-5A分子在生物体系中的半衰期较短，这在用于控制病毒复制方面是一缺点。另外，生物活性的2-5A被三种酶灭活相对非专属性2′-磷酸二酯酶，5′-磷酸酶以及相对非专属性2′，3′-外切核酸酶。一些细胞因子(如白细胞介素-6，IL-6)激活2-5A合成酶并使该酶或该酶的具体形式产生有生物活性的2-5A(Biokel，M，Dveksler，G，Dieffenbach，C.，W-，Ruhl，S.，Midura，S.，B.and Pluynik，D.H.，Cytokine2238-246(1990)and Cohen，B.，Gothelf，Y.，Vaiman，D.，Revel，M.，and Chebath，J.，Cytokine383-91(1991))。
2-5A合成酶/RNA酶L路径可以被很多病毒激活(当病毒感染后)，包括HIV-1(Schrder，H.C.，Wenger，R.，Kuchino，Y.，and Muller，W.E.G.，J.Biol.Chem.264，5669(1989)；Schroder，H.C.，Wenger，R.，Rottman，M.，and Muller，W.E.G.，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369，985(1988))。本路径的激活延迟HIV感染过程。为了激活RNA酶L，自然产生的2-5A需要一个5′-三磷酸，这一分子是不稳定的。带有5′-单磷酸的2-5A分子或5′端不含磷酸的2-5A核在生理条件下不能活化RNA酶L。
“人B-嗜淋巴病毒”(也就是知名的嗜淋巴B细胞病毒)，现在称作HHV-6，具有一个大分子量的双链DNA基因组，这一点在形态学上与疱疹病毒类病毒相似，但是又在宿主范围，体外生物效应，抗原特点和基因型等方面区别于人和非人类灵长动物疱疹病毒。Salahuddin等，在Science 234596-601(1986)；Josephs等，Science 234 601-602(1986)，已经发现该病毒可以感染新分离的B-细胞，使之转化为具有核和细胞质内含体的单-或双具核的大折射细胞。推测HBLV就是引起慢性单核细胞增殖样综合症的原因，该病的疲劳症可持续一年多。
人免疫缺损病毒(“HIV”)，也就是知名的人T-细胞白血病病毒III(HTLV-III)，是一种D逆转录型病毒，它是获得性免疫缺损综合症的致病剂。象所有的逆转录病毒一样，HIV复制时必须将正链RNA基因组转录至DNA，此过程必须有RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)参加。逆转录酶的这一特点使得逆转录病毒和病毒都需要一个短的逆转录步骤，这就使逆转录酶成为抗病毒(特别是抗逆转录病毒)治疗的一个主要靶点。
2-5A合成酶/RNA酶L体系作为抗病毒细胞防御机制已显示是一个很有希望的抗病毒化学治疗靶点，特别应归于它们与病毒基因组或转录(如HIV-1 RNA基因组)中的双链部分的相互作用(Lengyel，P.，Annu.Rev.Biochem.51，251(1982)；Pestka，S.，编著，Methods Enzymol.118，119(1986)；Lengyel，R.，J.IntestesonRes.7，511(1987)；Sen，G.C.，Prog.Nucleic Acid Res.Molec.Biol.27，105(1982))。但是，实际需要的是能抵抗酶(可降解正常的2-5A)降解的2-5A的衍生物。需要一个用具有广谱并有双重作用(即该化合物即能激活2-5A路径又能抑制病毒DNA聚合酶的活性)的化合物治疗病毒感染的方法。
根据一个实例，本发明涉及结构式I所代表的新型化合物或其药用盐的应用
其中n是1-8的整数，m是0，1，2，或3，R是独立的氢或羟基，X是C1-C6烷基或C1-C6烷氧基，n最好是1-3，特别是1或2，X最好是从C1-C3烷基和C1-C3烷氧基中选择。
根据另外一个实例，本发明涉及一种治疗病毒的方法，包括给哺乳动物服用有效剂量的结构式I或结构式II所代表的一种或多种化合物或其药用盐，但不包括正常的2′，5′-寡聚腺苷酸和其盐，在这里结构式I中的n，m，R和X与上面定义的相同，在结构式II中
<p>m是零，1，2或3；n是1-8的正整数；每一个R1都可独立地从下组基团中选择氧，硫，硫酸酯，硒，C1-C8烷基和C1-C8烷氧基；每一个R2都可独立地从下组基团中选择氧，硫，硫酸酯，硒，C1-C8烷基和C1-C8烷氧基；每一个R3都可独立选择氧，羟基，氨基和-OSi(CH3)2-C(CH3)3中的任何一个基团；R4和R5可以独立地从下组基团中选择氧；羟基；氨基；C1-C8烷基；C1-C8烷氧基；C1-C8烷基氨基，烷基羰基，烷基羧基和烷基卤化物；和C1-C8烷氧基氨基，烷氧基羰基，烷氧基羧基及烷氧基卤化物；从而同时引起所说哺乳动物的2-5A合成酶/RNA酶L抗病毒路径的激活和病毒DNA聚合酶的抑制。
优先选择，n是1-3，最好是1或2。另外优先选取的烷基，烷氧基，取代烷基或取代烷氧基(这些基团都可包含有1-8个碳原子)等取代基是含1-4个碳原子，最好是1-3个碳原子。对卤素取代的烷基和烷氧基来说，卤素原子最好是氯，溴或氟，尤其是氯最好。
就本发明的一个比较好的亚类来说，基团A是
其中m与上面定义的一样；而且最好至少有一个R1是硫，其余的R1均是氧。另外一个较好的实例表明，最好至少有一个R3或R4是氢，其余的是羟基。
根据另外一个实例，本发明涉及一个共聚化合物，该共聚物由结构式II所示的化合物与一个内收物共价连接而成，其中的内收物可增加共聚物穿透完整细胞的能力。
内收物最好通过2′-末端核苷酸的2′或3′位的羟基与寡聚体偶联，而且优先选择2′位。
在一个实例中，内收物可以是维生素，该维生素的选择应能保证哺乳动物靶细胞中含有相应的细胞受体，以使维生素通过受体介导的胞饮作用而被细胞吸收。在本发明中，类似这种有用的维生素有维生素B12，生物素，核黄素和叶酸等。
另外，内收物可以是亲脂性的分子或基团，象具有下面结构式的酰基，
其中X是从1-20的整数，最好是从2-14。另外一个较好的脂溶性基团是胆甾醇基。
作为共聚物类化合物中的一个较好的亚类，与内收物共价偶联的化合物或其药用盐具有结构式II的结构其中A 是
m是零，1，2或3，n是1-8的整数，最好是1，2或3，
每个R3和R4可以独立选取氢和羟基，每个R2可以独立选取硫和氧，R5是羟基，该化合物通过2′-末端核苷酸的2′-位与内收物共价连接起来。
图1是描述2-5A合成酶/RNA酶L细胞内酶路径的示意图。
图2A是H9细胞与荧光素-牛血清白蛋白(BSA)偶联的叶酸盐(25ug/ml)在贫含叶酸盐的介质中保温5小时后的相衬显微镜显微照相。
图2B是与图2A中所示一样的细胞的荧光显微照相。
图2C是H9细胞与没有叶酸盐偶联的荧光素-BSA保温5小时后的相衬显微镜显微照相。
图2D是与图2C中所示一样的细胞的荧光显微照相。
本专利选用即能激活2-5A合成酶/RNA酶L抗病毒防御路径，又能抑制病毒产生的DNA聚合酶活性的治疗剂进行病毒性疾病的治疗。所谓“治疗”也意味着包含防御。这种双重功效的治疗剂是病毒DNA聚合酶(在病毒感染期产生的)的选择性广谱抑制剂。聚合酶是病毒复制的关键因素。本发明实践中所应用的化合物可以是正常2-5A的5′末端磷酸基，核糖基和/或核苷间连接键修饰后的衍生物。这些衍生物具有代谢稳定、无毒等特点，并有双重抗病毒功效，即，它们即能激活2-5A合成酶/RNA酶L抗病毒路径，又能抑制由病毒引起产生的DNA聚合酶。因此，我们从激活哺乳动物所固有的抗病毒机制和抑制病毒信息转移过程中的关键酶这两个方面探讨了抗病毒治疗。
在本发明的实践中的一类比较有用的化合物中，2′，5′-虫草品的一个或多个3′-羟基被氢原子取代形成2′，5′-虫草品衍生物。这种修饰增加了衍生物抵抗磷酸二酯酶降解的能力。这类化合物的制备已有专利报道美国专利4,464,359(2′，5′-寡聚虫草品)和美国专利4,859,768〔2′，5′-寡聚虫草品和混和的2′，5′-寡聚(虫草品/腺苷)〕。核心2′，5′-虫草品衍生物是没有毒性的，并且在感染细胞中有广谱的抗逆转录病毒活性(Montefioni，D.C.Sobol，R.W.，Reichenfacn，N.L.，Suhadolnik，R.J.，Charabala，R.，Pfleiderer，W.，Modlizewski，A.，Rolinson，W.E.，Jr.，andMitchell，W.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，7191(1989)；Suhadolink，R.J.，Lebleu，B.，Pfleideser，W.，Charubala，R.，Montefiori，D.C.，Mitchell，W.M.，Sobol，R.W.，Li，S.W.，kariko，K.，and Reichenbach，N.L.，Nucleosides & Nucleotides8，987(1989)；Muller，W.E.G.，Weiler，B.E.，Charubala，R.，Pfleideser，W.，Leserman，L.，Sobol，R.W.，Suhadolnik，R.J.，and Schroder，H.C.，Biochemistsy 30，2027(1991))。其它的3′-羟基被修饰的2-5A虫草品衍生物也已经被合成出来，如专利4,859,768中所述的氨基和OSi(CH3)2-C(CH3)3取代。除了将一个或多个核苷的3′-羟基修饰之外，其它的2-5A衍生物还包含有5′-末端磷酸基的修饰。这些2-5A衍生物保留了抑制病毒DNA聚合酶的能力，并且保持了代谢稳定性，但是，他们能激活RNA酶L。除此之外，已经合成了许多不同的2-5A寡聚腺苷酸衍生物，且显示高效的抗病毒活性。
在本发明的另外一个实例中，修饰了核苷间的磷酸二酯键。在一个较好的实例中，硫取代了正常磷酸二酯键上的一个氧原子，形成了2′，5′-硫代磷酸寡聚腺苷酸。在美国专利4,924,624中描述了这类化合物的制备(包括光学异构体)。2′，5′-磷酸二酯键骨架中的氧原子被硫取代后，使分子中引入了手性中心，因此也就引入了骨架的新的化学问题。与正常的2-5A核相比，核心2′，5′-硫代磷酸衍生物增加了对磷酸二酯酶和磷酸酶的抵抗作用，并且增加了新的生物活性。这些立体化学修饰的分子是第一类能激活RNA酶L的2′，5′-连接的核心分子。2′，5′-硫代磷酸衍生物通过激活2-5A合成酶/RNA酶L抗病毒体系和抑制病毒DNA聚合酶而起作用。2′，5′-硫代磷酸三聚体能在微摩尔浓度水平激活RNA酶L，这与自然产生的P3A3相似。在本文的核苷间磷酸二酯键的修饰中，其它的用来取代氧原子的基团还有硫酸酯，硒，C1-C8烷基，C1-C8烷氧基等。
在本发明的另外一个实例中，制备了能增加对完整细胞穿透能力的具有双重功能的抗病毒2-5A衍生物，该衍生物通过寡聚体与内收物偶联而得到。一组比较好的内收物是水溶性的维生素(包括但不仅限于生物素，叶酸，维生素B2，或核黄素)。另外一些较好的内收物包括亲脂性的分子和化学基团，如酰基或胆甾醇基等例子。这种共聚体被完整的细胞通过受体介导的胞饮作用而内吞。
服用外活性的，代谢稳定的，并具有双重功能的2-5A类似物，将增加肌体对由于2-5A缺损引起的病症的防御能力，特别是人和动物防御病毒的感染。此处所说的“2-5A缺损”是指所有的能阻断正常2-5A生成和/或2-5A-依赖性RNA酶L活化的生理条件发生变化的现象、条件，或2-5A路径阻断。由2-5A缺损引起的病症包括病毒感染，特别是HTLV感染，尤其是HIV感染；慢性疲劳和其它的HHV-6相关的病症；乙肝和其它的肝炎病毒感染；皮T-细胞淋巴瘤和其它的HTLV-相关的病症等。其它的相关疾病包括慢性骨髓性白血病；急性白血病；T-细胞白血病；阿耳茨海默氏病(早老性痴呆)；帕金森氏病(震颤麻痹)；多重硬化；自体免疫病；以及外科和其它创伤引起的免疫机能障碍。2-5A路径缺损尤其是表现在慢性病毒感染和免疫细胞缺损类疾病中。
在2-5A分子的3′-羟基和别的部位进行结构修饰后，明显地增加了分子对磷酸二酯酶和细胞核酸酶(Cellular nucleases)的代谢稳定性，并且保留了激活RNA酶L和抑制逆转录病毒逆转录的能力。同样，母体2-5A的3′-末端核酸被取代修饰后，产生一个更稳定的分子。代谢稳定的2-5A类似物的持续高细胞内浓度就是它们分子稳定性增加的结果。另外，5′-末端的修饰将增强2-5A分子激活RNA酶L的能力。
2-5A类似物的长时间持续的药物活性提供了一个更有利的治疗指数。这样可以降低给药频率(与代谢不稳定的2-5A相比)。降低给药频率对很多由2-5A路径缺损引起的慢性疾病来说是非常重要的。另外，对2-5A衍生物进行适当的有利于穿透细胞的修饰，也将增加治疗指数，它将降低达到治疗效果时所必需的给药量。
2-5A衍生物在治疗由病毒引起的感染时特别有用。与病毒感染有关的2-5A路径缺损包括病毒干扰由双链RNA介导的2-5A合成酶的活化，从而引起路径的灭活。在没有2-5A合成酶活化的条件下，2-5A的产生，以及RNA酶L的活化，都将降低。根据本发明，在给药后，外源性的并且代谢稳定的2-5A类似物能抵消这种由病毒引起的2-5A路径缺损。象正常的2-5A一样，2-5A类似物能激活RNA酶L(该酶裂解病毒RNA)。
2-5A类似物在御防各种人T-细胞白血病病毒(总称为“HTLV”)感染方面特别有效，这些病毒有引起皮T-细胞淋巴瘤的HTLV-I；引起Sezany淋巴瘤的HTLV-II；HTLV-III；和HTLV-IV，该病毒同前认为是多发性硬化的致病剂。每种HTLV病毒都是逆转录病毒。HTLV-III(也就是知名的“HIV-I”)引发获得性免疫缺损综合症(“AIDS”，“爱滋病”)。该化合物也确信能治疗HIV-2(第二个从血清学上区分的亚型)。在下文中HIV将代表HIV-1或HIV-2，以及其它的现在或下文中所知的HIV亚型。
2-5A类似物也能特别有效地防御引起病毒性肝炎的各种肝炎病毒，它被认为是一种逆转录病毒的混合型，并且依靠DNA依赖性DNA聚合酶进行DNA基因型的复制。2-5A类似物也能特别有效在御防由DNA基因型病毒引起的感染，如疱疹病毒。
在HTLV-感染(特别是HIV-1感染的病人)的血液单细胞中，已经证实有非常低水平的2-5A/或RNA酶L活性。与之对照，健康人的血液单核细胞中显示出较高的2-5A水平(平均)，并能容易地检测出RNA酶L活性。同样，慢性疲劳症患者的血液单核细胞显示出低水平的2-5A，和新的RNA断裂碎片，这些断裂新产物区别于从正常个体的血液单核细胞中观察到的专一性裂解产物。
本文描述了本发明用于治疗HIV-1(通常作为逆转录病毒的典型)感染和乙肝病毒(该病毒同时具有逆转录病毒和DNA基因型病毒的性质)感染的实践过程，并且本发明的方法能用于治疗任何由病毒组成的致病剂引起的疾病。
另外，慢性病毒感染通常伴随着细胞因子失衡，从而导致附加的致病效应，包括非生物活性的2-5A的积聚。本发明将通过提供有生物活性的2-5A来校正这种非平衡效应。
在本发明的应用过程中用到的一般化合物的制备方法已在有关专利文献中报道美国专利4,859,768和4,924,624。在本发明的具体实践中用到的其它化合物可以用下面给出的一般合成技术(象那些专利中报道的一样)进行制备。
用于本发明的实例化合物包括下面给出的核心化合物，以及它们对应的5′-单、双和三磷酸，和它们的可以药用的盐混和的虫草品/腺苷寡聚体2′，5′-C-C-C2′，5′-A-A-C2′，5′-A-C-C2′，5′-C-C-A2′，5′-C-A-C2′，5′-C-C-A和2′，5′-A-C-A，除了有A和C组合的各种“四聚体”外，还包括(但不局限于)，2′，5′-C-C-C-C2′，5′-A-A-A-C2′，5′-A-A-C-C2′，5′-A-A-C-A及其类似物烷氧基化合物2′，5′-A-A-A-3′-O-甲基
2′，5′-A-A-A-3′-O-戊基2′，5′-A-A-A-3′-O-己基2′，5′-A-A-A-3′-O-庚基氨基化合物2′，5′-A-A-A-3′-氨基各种各样的化合物2′，5′-A(si)A(si)A，2′，5′-A-A-阿糖-A，2′，5′-A-A-Tu，2′，5′-Tu-Tu-Tu，2′，5′-I3，2′，5′-木糖-A3，2′，5′-木糖-A4，2′，5′-C-C-dCF，2′，5′-EHNA-A-A，和5，6-二氯苯并咪唑酰(2′，5′)5，6-二氯苯并咪唑酰(2′，5′)5，6-二氯苯并咪唑核糖核苷，3′-脱氧腺苷酰-(2′，5′)-3′-脱氧腺苷酰-(2′-4′)-9-(4′羟基丁基)腺苷，和3′-脱氧腺苷酰-(2′，5′)-3′-脱氧腺苷酰-(2′-4′)-9-(4′羟基乙氧基)腺苷，
以上提到的最后两个化合物是统称为“C-C-醚-A”的一组化合物中选出的两个代表性化合物。它们的特点是在虫草品核苷和腺苷之间通过一个醚键连接。相应地，当虫草品残基被腺苷取代，这类化合物统称为“A-A-醚-A”。
2-5A衍生物对乙肝病毒复制的抑制通过抗乙肝病毒试验检验了几种2-5A衍生物的抗病毒活性。将不断产生乙肝病毒的肝细胞(Acs等，Proceedings of theNational Academy of Sciences，USA 844641-4645(1987))接种在24孔组织培养板中，当生长至融合后，在连续十天内，每天加入20um的2-5A衍生物。培养基质每天更换一次。过0，3，6和十天后分别分析用过的培养基质中的细胞外乙肝病毒DNA。将处理十天后的细胞溶化24小时，并分析细胞内的基因DNA形式。Korda和Milman已经报导了该方法的简单过程(Antiviral Research 217217(1991))。下面将给出更详细的试验参数。
细胞内和细胞外的乙肝病毒DNA都通过常规的技术过程进行了分析，目的是(1)考证化合物功效，和(2)从检查病毒复制形式的典型实例中，尽可能提供化合物在乙肝病毒复制路径中的作用靶点的有关数据。在处理期间，培养基质每天都进行更换的目的是(1)防止从试验化合物中代谢生成的强毒性化合物集结，(2)提供一个机会来分析在独立的24小时间隔时间内乙肝病毒的产物，并能定量比较病毒粒子所产生的任何效应。
在实验过程中，选用印迹杂交技术(Southern印迹和斑点印迹)和〔32P〕-标记的乙肝病毒探针进行乙肝病毒DNA的分析。乙肝病毒DNA的水平可以通过比较每个硝酸纤维膜上(凝胶和斑点印迹)的已知量乙肝病毒DNA水平来测得。利用AMBISβ计数器可以直接定量测出杂交探针的放射性衰减。利用多点分析所得到的标准曲线来校正由β计数器测得的靶DNA的cpm(每分钟衰变次数)的相对水平。释放到培养基质中的乙肝病毒DNA水平可以用斑点印迹杂交测得。然后将所测得的乙肝病毒DNA水平与在0天的水平相对照来确定药物处理的影响。
乙肝病毒复制的相对水平可以由复制中间体和游离基因单体的水平来显示。在每个斑带中，DNA的相对量都用完整的乙肝病毒DNA作为标准，因为在每个细胞基质中这类乙肝病毒DNA的水平是衡定的。如果复制中间体损失，并且整体乙肝病毒DNA的水平不变，则表明乙肝病毒DNA的复制受到抑制。在本试验中，下列2-5A衍生物显示出抗乙肝病毒活性木-A3，A-A-醚-A，EHNA-AA，CAC，ACCA和ddbenz。
对这些抑制剂进一步进行研究，将这些2-5A衍生物中的5个化合物稀释，除20μM外，分别在2μM和6μM进行试验。在20μM浓度时，这5个2-5A衍生物都显示出明显的抗乙肝病毒活性，而且在2μM浓度时，其中的3个衍生物(A-A-醚-A，ddbenz，和CAC)也有很高的活性。这些结果表明，许多2-5A衍生物具有抗乙肝病毒活性。根据本发明可以推知，如果在这些和其它的一些2-5A衍生物的5′末端加以修饰，以增加2-5A衍生物活化RNA酶L的能力，将增加它们的抗乙肝病毒活性。同样，根据本发明也可以推知，如果在这些5′修饰和5′末端修饰的2-5A衍生物上共价偶联上亲脂性的内收物(如，胆甾醇，棕榈酸，叶酸，等等)，它们的抗乙肝病毒活性将进一步增加。
为了确定这5个具有抗乙肝病毒活性的2-5A衍生物的治疗指数，用常规的中性红试验测试了它们的毒性。在培养器中确定这些化合物毒性的过程是一个非常常规的技术，可概括如下2.2.15细胞在96孔平底组织培养板中长至融合，每孔中含0.2ml培养基质，并用化合物药物处理。每个化合物都在四个不同的浓度下进行试验，并且每个都进行三份培养试验。在每块96孔培养板中都保留未经药物处理的对照培养基，并在每块板中保留不含细胞的孔用来校正光扫描计数结果。化合物的毒性可以通过细胞对中性红染料的吸收抑制来确定，这可以通过测定细胞(经十天药物处理后，再过24小时)在510nm波长下的吸收并与未处理的对照细胞相比较而得到(Finter等，J.Med.Chem.5419(1969))。
上述的所有2-5A衍生物在最高试验浓度(抗病毒试验浓度，20μM)时均未发现毒性现象。在试验的5个2-5A衍生物中，有四个在9倍于有效抗病毒量(180μM)时仍没有毒性。第五个化合物(dd benz)在180μM时表现出低毒性。
为进一步研究上述2-5A衍生物抑制乙肝病毒的专一性，也对它们的裂解产物进行了可能的抗病毒活性检测。发现苯并咪唑，二苯并咪唑，腺苷，虫草品或9一β-D-木糖腺苷等均没有抗乙肝病毒活性。这些结果表明，在适当的浓度下，2-5A衍生物可以专一性地抑制乙肝病毒的复制而对未感染的细胞没有毒性，并且这种抑制归因于2-5A衍生物本身而不是它们的代谢物。
硫代磷酸酯对病毒的抑制RNA酶L是2-5A合成酶/RNA酶L抗病毒防御路径中的一个重要的功能性酶。2-5A衍生物激活这种严格依赖2-5A的核糖核酸内切酶和由此引起的RNA的水解在抑制病毒复制和调节细胞生长方面都是关键的。干扰素的一些抗逆转录病毒活性都是通过激活2-5A合成酶/RNA酶L路径介导的。在建立抗逆转录病毒状态时，直接由2-5A衍生物激活RNA酶L避免了对干扰素的需求。在2-5A分子的3′羟基和核苷间2′，5′磷酸二酯键部位进行结构修饰，所得到的2-5A衍生物代谢稳定(因此抵抗磷酸二酯和磷酸酶的水解)并且有生物活性(能激活RNA酶L)。控制合成过程能够使设计和合成的2-5A衍生物(i)增加代谢稳定性，避免核酸降解，(ii)抵抗磷酸酶，(iii)活化RNA酶L时不需5′磷酸化，(iv)能转运进入完整细胞。在2-5A分子的磷酸二酯键上引入手性中心，可以作为一种方法在分子水平区别RNA酶L的激活和抑制。首先用酶法合成得到了纯的非对映异构的硫代磷酸2-5A衍生物的二聚体和三聚体。最近又用化学方法(通过磷酸三酯法和亚磷酸三酯法)合成、纯化并鉴定发两个二聚体，四个三聚体，和八个四聚体等非对映异构体。这些手性分子呈现出突出的生物活性，它们打破了活化RNA酶L必须有三腺苷酸残基和5′末端磷酸这一传统的理论。正常的2-5A核心分子不能活化RNA酶L，与之相对照，象2′，5′-硫代磷酸5′-单磷酸(pRpRp，SpRp和RpSp)(在10-8M)一样，2′，5′-硫代磷酸三聚体核心分子的四个立体异构体中有三个(RpRp，SpSp和RpSp)能结合并激活RNA酶L(在10-5M)。
为了确定这些体外的研究结果是否能扩展到体内模型(用病毒感染的细胞)，将2′，5′-硫代磷酸四聚体5′-单磷酸显微注射入HeLa细胞的细胞质中，然后用VSV(水泡性口炎病毒)转染。2′，5′-硫代磷酸四聚体5′-单磷酸(pRpRpRp，pSpRpRp和pRpSpSp)都能激活RNA酶L。但是pSpSpSp异构体(在浓度高达10-6M)不能激活RNA酶L。同时显微注射入pSpSpSp抑制剂和2-5A，则失去了防御病毒(VSV)复制的能力。在培养皿中，Rp-和Sp-2′，5′-硫代磷酸酯能抑制HIV-1在完整细胞中的复制。2′，5′-硫代磷酸酯通过HIV-1逆转录酶的抑制来御防HIV-1对靶细胞的感染〔在曲拉通破坏HIV-1病毒粒子(取自H9/HTLV-IIIB培养上清液)的溶解液中测得〕。0.25-256μM浓度的A3或p3A3不能抑制HIV-1逆转录酶。与2-5A相对照，2′，5′-硫代磷酸四聚体5-单磷酸衍生物是很有效的HIV-1逆转录酶活性抑制剂。最有效的HIV-1逆转录酶抑制剂是p3A3aS，在HIV-1-感染的细胞溶解液中，0.5μM的p3A3aS对HIV-1逆转录酶的抑制率是50％。AMPS的浓度高达200μM时也不能抑制HIV-1逆转录酶，这说明降解产物与2′，5′-硫代磷酸酯的抑制活性无关。
紫外分析进行的交联研究表明，d(T)16和tRNALys3与均匀纯的重组体p66HIV-1逆转录酶上动力学非常重要的引物结合点专一性地结合。寡聚d(T)n与p66逆转录酶的结合不受dNTPs(指四种脱氧核糖三磷酸)的影响；在竞争性试验中，引物类似物〔Sd(c)和d(c)〕、天然引物tRNALys3和p3A3aS以一级指数方式抑制d(T)n-p66/逆转录酶复合物的形成。2-5A和2-5A衍生物对HIV-1逆转录酶的抑制发生在引物结合点。在平衡的结合条件下，2′，5′-P3A4呈现一级结合动力学并且1/2竞争浓度是55uM(KD＝31×10-6M)。2′，5′-P3A4aS呈现一级动力学结合，其1/2竞争浓度是5.1×10-6M(KD＝2-0.9×10-6M)。2′，5′-A3核，2′，5′-pA3，3′，5′-A3核，3′，5′-PA33′，5′-P3A3和ATP不能抑制HIV-1 RT与d(T)16的结合。
2′，5′-虫草品三聚体核和5′-单磷酸(1μM)〔当与抗体靶向脂质体(靶向于T细胞受体分子CD3)结合时〕可以90％抑制HIV-1复制。参见文献中的表1Muller，W.E.G.，Weiler，B.E.，Charubala，R.，Pfleiderer，W.，Leserman，L.，Sobol，R.W.，Suhadolnik，R.J.，和Schroder，H.C.，Biochemlstry 30，2027(1991)。斑点印迹和凝胶阻滞试验表明，2′，5′-虫草品三聚体核和5′-单磷酸干扰tRNALys3与HIV-1逆转录酶的结合，参见Muller等的图3。上面提到的文献与本文有关，可作参考。pC3不能激活RNA酶L，并且对细胞RNA或蛋白质的量没有影响。在浓度为10μM时，细胞DNA聚合酶α，β和γ几乎不受C3或pC3〔C＝虫草品〕的影响。
我们首次得到有效的抗逆转病毒活性的化合物(2-5A衍生物)。这些化合物作用于受HIV-1-感染的细胞时有双重作用(i)它们激活2-5A合成酶/RNA酶L抗逆转录病毒体系，并且(ii)抑制H IV-1逆转录酶。就2′，5′-硫代磷酸核和它们的5′-单磷酸而言，它们能阻止急性感染(通过HIV-1逆转录酶的抑制)，并且同时也能降解HIV-1 mRNA(通过激活RNA酶L)。
能增加细胞吸收能力的2′，5′-寡聚腺苷衍生物共聚体为了增加2-5A衍生物进入完整细胞的内吞作用，可将生物活性的2-5A衍生物与水溶性的维生素(叶酸、生物素、核黄素、或维生素B12)或亲脂性的化学基团偶联形成共聚物。
这一过程包括(i)化学合成有生物活性并且代谢稳定的衍生物，例如，2′，5′-Cn，2′，5′-硫代磷酸酯(根据美国专利4,924,624制备)，和其它的代谢稳定的衍生物(如美国专利4,859,768中报导的那些化合物)。根据上述文献报导的方法，设计并合成了一些2-5A衍生物，并且从RNA酶L的水平和逆转录酶的抑制两个方面检验了它们的抗逆转录病毒效能。在多步化学合成(通过磷酸三酯法和亚磷酰胺法)中，可以分别用酶促方法得到毫克量和克量的2′，5′-寡聚核苷酸。正确选择合适的糖、碱基和磷酸保护基，直接影响到反应的收率及产物的纯化和色谱分析。
成功地促进2-5A衍生物(有生物活性并且代谢稳定)的转运对于持续研究HIV-1复制的抑制和有效药物的运输是非常重要的。有几种帮助2-5A衍生物转运入细胞的方法可供选用。
2′，5′-寡聚腺苷酸亲脂性共聚体第一种帮助转运的方法是在分子的2′，3′-末端共价偶联上一个亲脂性基团(如酰基或胆甾醇基)。例如，可以合成并分离纯化得到2′-末端羟基通过酯键与棕榈酰基(结构式III)或胆甾醇甲酰基(结构式IV)相连的2′，5′-虫草品核衍生物。
实验发现，这些酯化后的化合物能够抑制HIV-1感染的H9细胞(在培养皿中)中的HIV-1复制。2-5A类似物与胆甾醇所形成的共聚物可以通过化合物V
其中m是0，1，2或3，n是1-8的整数，R可以独立地选取氢或羟基，R1是-COOH或-NH2，R2可以独立地选取硫或氧，R3可以独立地选取硫或氧，X是1-17的整数，与胆甾醇氯甲酸酯的偶联反应而合成得到，该反应在二氯甲烷溶液中进行，并且加入二甲基氨基吡啶(DMAP)催化。反应产物用柱层析分离纯化。
而且，最好R取代基不全是羟基，也就是说，至少有一个R是氢。最好n是1-3，尤其是1或者2。5′末端磷酸基上的R2最好是硫。最后，X的值最好是1-8，尤其是1-4。结构式V所代表的2′，5′A衍生物共聚物也可以通过功能化适当的5′磷酸化的2′，5′-寡聚腺苷酸，2′，5′-寡聚虫草品或混和的2′，5′-寡聚(腺苷/虫草品)等寡聚体来制备，这些制备方法可以参考美国专利4,464,359或4,859,768。进行寡聚体功能化时，可以将它们的2′末端核酸偶联一个烷基连接-(CH2)xR1，其中的X和R1与上面定义的一样。
值得提出的是，除了包含有磷酸二酯键连接的寡聚体以外，结构式V所代表的2-5A衍生物共聚物能够通过烷基连接臂与2′，5′-硫代磷酸酯的2′-末端核苷的连接而制备。2′，5′-硫代磷酸酯的制备(包括它们的对映体的拆分)方法已在美国专利4,924,624中报道。如果再改进-步，将专利4,924,624和4,859,768中的合成技术组合起来，就可以制备得到混和的2′，5′-(磷酸二酯键/硫代磷酸酯键)-寡聚腺苷酸。
在分子中所有的核苷间连接键中的R2都是氧(如连接键是磷酸二酯键)的情况下，可以通过相应的末磷酸化的核心化合物与POCl3反应而得到它们的5′-单磷酸衍生物。如果核苷间连接键中至少有一个是硫代磷酸酯键(即，R2是硫)，这种处理将导至硫原子从硫代磷酸酯键中消除，从而得到2′，5′-寡聚腺苷酸。所以，含有硫代磷酸酯键的核心寡聚体的5′单磷酸化衍生物必须从对应的全保护核心寡聚体(其中5′末端核苷的单甲氧基三苯甲基保护基已被脱除)制备。具体过程在美国专利4,924,624栏26-31中有详细叙述。
2-5-衍生物/酰基共聚物可以用标准的实验技术使待偶联化合物与酰氯反应而得到。或者，也可以直接用2′-羟基已经被酰基或胆甾醇甲酰基酯化的末端核苷进行2′，5′-寡聚体的合成。合成方案1以胆甾醇偶联的和酰化的虫草品三聚体化合物(包括化合物12和13)的制备为例(但不仅限于此例)阐明了其中的一种制备方法方案1
方案1(续)
方案1(续)
方案1(续)
在方案1中，多步化学合成从5′-O-二甲氧基三苯甲基-N6-对硝基-苯基乙氧羰基-虫草品(1)和相应的2′-O-琥珀酸酯(2)开始。化合物1与胆甾醇氯甲酸酯反应得到化合物3，化合物3脱除三苯甲基得到化合物4，化合物4在合成中用做2′-末端构建单元。琥珀酸酯2与胆甾醇缩合得到酯5，脱除三苯甲基得到化合物6。
合成方案2举例阐明了三聚体共聚物的合成路线，该实例从化合物6开始。这一虫草品衍生物首先与全保护的磷酸亚胺7反应，得到二聚体8(收率很高)。脱除5′末端三苯甲基得到化合物9，随后与第二分子化合物7得到全保护的三聚体10。然后，分别用酸脱除二甲氧基三苯甲基，用DBU脱除对硝基苯基乙氧羰基，得到完全游离的虫草品三聚体共聚物11。从这个实例中我们可以看出，本方法的优点是胆甾醇和琥珀酸连接臂间的酯键在整个化学操作过程中不受影响。
用完全类似的方法，以胆甾醇碳酸酯4开始经过同样的步骤，可制备得到虫草品三聚体共聚物12。
也可以用完全类似的方法，制备得到2′-末端带有酰基的寡核苷酸-虫草品三聚体共聚物13。
本发明中的亲脂性共聚体有潜在的能力通过扩散作用(利用它们的亲脂性)进入细胞。它们能够进入完整的细胞，并产生与正常2-5A一样的生物活性。一旦进入细胞，共聚体就被水解而释放出2-5A衍生物。
2′，5′-寡聚腺苷酸维生素共聚物第二种帮助寡核苷酸转运的方法是在2-5A衍生物分子中共价偶联上水溶性的维生素(如生物素、叶酸、核黄素或维生素B12等)。2-5A衍生物与水溶性维生素共价偶联后，可以通过受体介导的胞饮作用将活性分子协同运入完整细胞，并完全保留了它们的生物活性。
作为描述本理论的一个模型试验，我们在培养的H9细胞中做了荧光素-牛血清白蛋白(BSA)共价偶联的叶酸的内吞试验(图2A和2B)。在对照试验中，H9细胞与没有叶酸偶联的荧光素-BSA保温5小时，没有被吸收(图2C和2D)。这些结果表明在H9细胞上存在着叶酸受体，这一受体可用来靶向运输2-5A衍生物。叶酸受体能够与叶酸偶联的分子结合，并在5小时内80％被细胞吸收。
2-5A衍生物能够与水溶性的维生素共价偶联起来，以而有利于极性的2-5A分子进入完成的细胞，并且不损害细胞膜。水溶性的维生素共价偶联在2-5A分子的2′，3′-末端，利用受体介导的胞饮作用被完整细胞吸收。实验已经证明，与生物素、叶酸、核黄素和维生素B12等共价偶联的极性2-5A分子可以非损伤性地转运入细胞浆，并且随后通过受体介导的胞饮作用有效地被吸收。在这种方法中，利用天然维生素的胞饮作用来完成细胞吸收，这就避免了其它已有方法(如显微注射，电打孔，声处理，清洁剂渗透)产生的膜损伤。在所有的分化细胞中，维生素吸收都以比较合理的速率进行。根据这种维生素共聚物的有效的吸收，可以相信，完全能够使2-5A/叶酸共聚物的细胞内浓度达到大约10-6M；这些浓度足以活化RNA酶L和抑制HIV-1逆转录酶。因为细胞有相似数目的叶酸，生物素和维生素B12受体，所以推测2-5A/生物素和2-5A/维生素B12也能达到相似的细胞内浓度。
2-5A维生素B12共聚物在进行2-5A或生物活性的2-5A衍生物与维生素B12的共价偶联时，可以首先用弱酸(0.4MHCl，室温72小时)将维生素B12转化为它的单酸衍生物。然后用适当的缩合剂〔如，1-乙基-3-(二甲基-氨基-丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)〕使待偶联2-5A化合物〔如结构式V所示化合物(R1＝NH2)〕与维生素B12的羧基反应。反应得到的2-5A/维生素B12共聚物可以用SephadexG-25或反相HPLC层析分离纯化。并根据已报道的2-5A和维生素B12的消失系数进行鉴定。
2-5A/叶酸共聚物2-5A叶酸共聚物可以通过待偶联化合物〔如结构式V(R1＝NH2)所示化合物〕在适当的缩合剂(如EDAC)存在下反应得到，所得产物可用柱层析，薄层层析或HPLC纯化。
2-5A/生物素共聚物生物素化的2-5A共聚物可以通过商业化的N-羟基琥珀酰亚胺生物素与化合物V(R＝NH2)反应得到，所得产物可用类似于2-5A/叶酸共聚物的方法纯化。
包含有3′-末端非环核苷的2′，5′-虫草品类似物的制备结构式I所代表的三聚体“核心”虫草品类似物(即，结构式I所代表化合物，其中m是0，n是1)可用方案2所示路线制备，其中，“bz”是苯甲酰基，“MeOTr”是单甲氧基三苯甲基，“npe”是2-(4-硝基苯基)乙基，“npeoc”是〔2-(4-硝基苯基)-乙氧基〕羰基。为了描述方便，化合物均以铵盐形式制备，可以理解，本发明不仅局限于此。本合成方案例举了四个化合物(18，19，20和21)的制备过程。方案2
RR1R2R3Xbz＝苯甲酰基 14 bz MeOTr npe npeoc CH215 bz MeOTr npe npeoc CH2CH2MeOTr＝单甲氧基三苯甲基16 bz MeOTr npe npeoc CH2CH2CH217 bz MeOTr npe npeoc CH2CH2Onpe＝2-(4-硝基苯基)乙基18 H H NH4H CH219 H H NH4H CH2CH220 H H NH4H CH2CH2CH2npeoc＝〔2-(4-硝基苯基)乙氧基〕羰基21 H H NH4H CH2CH2O
根据Charubala等人的方法〔Helv.Chim.Acta 70，2028(1987)〕，二核苷酸单磷酸酯9可以从3′-脱氧-5′-O-(单甲氧基三苯甲基)N6-〔2-(4-硝基苯基)乙氧基碳基〕腺苷(4)制备得到。根据Charubala等人的方法可以制备得到化合物4，并进一步转化成2′-三磷酸酯衍生物5，其中化合物5的磷酸功能基上含有2，5-二氯苯基和2-(4-硝基)苯基乙基(方案1)。用4-硝基苯甲醛肟从化合物5中脱去2，5-二氯苯基得到二酯6。另一方面，用酸脱除5′-O-单甲氧基三苯甲基得到5′-羟基三酯7。这两个合成单元6和7在催化剂2，4，6-三异丙基苯基磺酰氯和1-甲基-1H-咪唑存在下缩合，经分离纯化并干燥，得到二聚的磷酸三酯8，收率为88％。再用肟脱除这一二聚单元中的2，5-二氯苯基得到对应的二核苷酸单磷酸二酯9。
为了合成三聚体14-17，上述二聚磷酸二酯与适当的保护无环核苷10-13在2，4，6-三异丙基苯基磺酰氯和1-甲基-1H-咪唑存在下缩合，可以得到70-75％的目的产物。非环核苷10-13可以按照Tychinskaya等Bioorg.Khim(USSP)5，1059(1979)和Mikhailov等，Izv.Akad.Nauk.Ser.Khim.2582(1974)的方法制备。三聚体酯9(1mmol)和适当的非环核苷类似物与无水吡啶共蒸发(5×10ml)而干燥，并且最后溶解在10ml无水吡啶中。然后，依次加入0.46ml(6mmol)1-甲基-1H-咪唑和0.606g(2mmol)2，4，6-三异丙基苯磺酰氯，反应混合物室温搅拌20小时后，用100ml氯仿稀释，并用2×50ml水洗。有机层干燥并浓缩，所得残渣最后用甲苯(3×20ml)共蒸发后，用柱层析纯化(硅胶，10×2.5cm，氯仿/甲醇＝100∶1)，得到无色泡状化合物14-17，收率是85-90％。相应地，向保护的三聚体15-18(0.028g；15μmol)溶液中加入5ml0.5MDBU的吡啶溶液，室温搅拌20小时，用1M的醋酸/吡啶溶液中和(2.5ml)，蒸干。残渣中加入15ml浓氨水，室温搅拌48小时后减压蒸除溶剂，所得残余物用80％醋酸/水(4ml)室温处理24小时脱除三苯甲基。蒸除溶剂后，残余物用水共蒸发几次，溶于水后直接上DEAE A-25 Sephadex柱(60×1cm)，用0.001-0.3M碳酸氢三乙胺缓冲液(pH＝7.5)梯度洗脱(线性梯度)。产物组分浓缩并用水共蒸发几次，再进一步用纸层析纯化(异丙醇/浓氨/水＝6∶1∶3)。剪下产物带并用水洗脱，冷冻干燥后，分别得到3′-脱氧腺苷酰-(2′，5′)-3′-脱氧腺苷酰-(2′-2′)-9-(2′-羟基乙基)腺苷(二铵盐，18)，3′-脱氧腺苷酰-(2′-5′)-脱氧腺苷酰-(2′-3′)-9-(3′-羟基丙基)腺苷(二铵盐，19)，3′-脱氧腺苷酰-(2′-5′)-3′-脱氧腺苷酰-(2′-4′)-9-(4′-羟基丁基)腺苷(二铵盐，20)，和3′-脱氧腺苷酰-(2′-5′)-3-脱氧腺苷酰-(2′-2″)-9-〔(2″-羟基乙氧基)甲基〕腺苷二铵盐(21)等无色粉末，收率为75-85％。所有化合物的纯度均经TLC，UV，和1H-NMR谱检验。
所有三聚体被依次脱除保护基，0.5M DBU(1，8-二氮双环〔5.4.0〕壬-7-烯)的无水吡啶溶液室温20小时脱除2-(4-硝基苯基)乙基，氨的二氧六环溶液脱除苯甲酰基，最后酸处理脱除5′-O-单甲氧基三苯甲基，得到相应的全脱保护三聚体18-21，这些产物都经DEAE Sephadex柱层析和纸层析纯化分离，并经过TLC，UV，HPLC和1H-NMR谱鉴定(未给出有关数据)。
四聚体(C-C-C-醚-A)可以按照上述同样的方法制备合成，即，用相应的保护三核苷酸9a代替方案2中的二核苷酸单磷酸酯9与适当的保护非环核苷缩合。同样，选用适当的更高级的寡核苷酸与非环核苷缩合，可以得到更高级的这种3′-非环虫草品寡聚体。
在制备非磷酸化的核心分子单磷酸化衍生物时，可以从全保护的三聚体(如，14-17)开始，先用酸脱除三苯甲基，再与二-对-硝基苯基乙基磷酰氯反应，再经脱保护和层析纯化分离即得到5′-单磷酸化的寡聚体。这种5′-单磷酸化的过程可以参考美国专利4,859,768中的实例6的方法进行。
核心分子的5′-二磷酸和5′-三磷酸衍生物可以按照上述专利中的方法制备。简单地说，在1ml二甲基甲酰胺中溶解0.1mM单磷酸化的核心化合物(无水三丁基胺盐)和0.5mM1，1′-羰基二咪唑，然后加入0.5mM焦磷酸三丁基胺(溶解在5ml二甲基甲酰胺中)，室温搅拌20小时，反应物用5ml甲醇处理，蒸干并用2×20cmDEAE纤维素柱层析分离，用碳酸氢三乙胺进行线性梯度洗脱(0-0.4M，pH＝7.5，3升)即可分离得到5′-二-和5′-三-磷酸产物(参照Hoard等J.Amer.Chem.Soc.87，1785-1788(1965)所报导的方法)。然后，5′-二磷酸产物和5′-三磷酸产物可以用DEAE-SephadexA25和Sephadex进行纯化。
2-5A类似物和共聚物可以按照美国专利4,924,624，4,859,768，国际专利申请号PCT/US85/03634(国际公布号WO89/03683)或中国专利申请号89106235.1所报道的剂量给药。因此，药用时，可以将2′，5′-寡聚腺苷类似物掺入适于药用的载体中。这些用作药物组合物的载体可以是有机的或无机的，固态的或液态的。适用的液相载体包括水和醇(如乙醇，苯甲醇和聚乙二醇)。比较好的注射用液相载体包括水，0.6％食盐水，葡萄糖溶液和二醇溶液(如，丙二醇水溶液或聚乙二醇水溶液)，组合物的性质可以通过加入一种或多种具有特殊性质的辅剂(如，增粘剂，表面活性剂，pH调节剂，防腐剂，甜味剂，稳定剂，色素，悬浮剂，粒剂，色剂，崩解剂，促效剂，乳化剂和hymectants)加以改善。所得到的组合物可以是溶液，悬浮液，片剂，胶囊，软膏，酏剂，针剂等药用剂型。
给药剂量依赖于感染或病症的严重程度和客体的大小和重量。根据客体的大小和重量及病症的性质，剂量可以在很大范围内改变。就一个具体例子来说，化合物可以做成0.1-100mg/ml的水溶液，磷酸盐缓冲液或其它合适的液体溶液，或者做成每片含有0.01-1克活性化合物的片剂。
化合物可以以水溶性盐的形式给药。可以药用的水溶性盐包括例如，活性化合物的钠、钾和铵盐。它们很容易地溶解在水或盐水中。这种配方可以包含有附加的试剂(如，糖，或蛋白质)以保持渗透平衡。
患有，或怀疑患有，或有危险患有由于2-5A路径损伤引起的任何症状的动物或人，可以报用0.1毫克-1克剂量的2′，5′-寡聚腺苷酸类似物。每天的给药总量可以不同，例如，从0.001克到约1克，但是给药量可以较高或较低。化合物的给药途径可以是以下几种(但不仅限于此)中的任何一种，包括静脉注射，腹腔或肌内注射，和口服。实现这些给药方式的技术都是已知的常规医务技术。给药频率可以快到一天几次，或慢至几个星斯一次。对于静脉注射，特别是用于治疗HIV(爱滋病毒)，每毫升药液中最好含有约0.1到约1克的活性组分。
2′，5′-寡聚腺苷类似物还可以局部给药来治疗与2-5A路径缺损引起的疾病有关的皮肤损伤。可以用足够量的药物组合物(含有一种或多种2′，5′-寡聚腺苷类似物)涂抹在损伤或影响部位。
对于共聚物来说，如果2-5A类似物与增强细胞吸收能力的内收物偶联，那么给药剂量依赖于2-5A类似物部分的重量。除了与常用的载体一起给药以外，2-5A类似物可以通过很多特殊的寡核苷酸或核酸转运技术(如，被单层脂质体或重组仙台病毒被膜包裹，或与载体分子如，多聚(L-赖氨酸)〕共价偶联)给药。这些方法已在国际专利申请号PCT/US85/03634中报道，其中的所有发现和发明都可作为本文的参考。
另外，2-5A衍生物和共聚物可以通过微小的微米大小的聚苯乙烯载体给药，通过它溶解在血流中并释放出活性药物组分。其它适用的载体在以上提到的专利文献中都已讨论，文献中的所有发现和发明都可作为本文的参考。
所有有关合成，制备和分析方法的参考文献都可作为本文的参考。
本发明可以在保持原文精神或必要特征的条件下有其它特殊的体现形式，因此，本发明所指的范围应当参照附加的权利要求书，而不是前文中的特殊情况。
权利要求
1.下面结构式所代表化合物或其药用盐与能增加进入完整细胞的穿透能力的内收物共价连接所形成的共价物，但该式化合物不包括正常的2′，5′-寡聚腺苷酸及其盐，
其中A是
或
X是NH2或CH2；m是零，1，2，或3；n是1-8的整数；每个R1可以独立地从下组基团中选择氧，硫，硫酸酯，硒，C1-C8烷基和C1-C8烷氧基；每个R2可以独立从下组基团中选择氧，硫，硫酸酯，硒，C1-C8烷基，C1-C8烷氧基；每个R3可以独立地选自氢，羟基，氨基，和叔丁基二甲基硅烷氧基(-OSi(CH3)2-C(CH3)3)，R4和R5可以独立地选自氢；羟基；氨基；C1-C8烷基；C1-C8烷氧基；C1-C8烷基氨基，烷基羰基，烷基羧基和烷基卤化物，和C1-C8烷氧基氨基，烷氧基羰基，烷氧基羧基和烷氧基卤化物。
2.权利要求1中所述共聚物，其中内收物是一种维生素，该维生素有对应的细胞表面受体，从而可进行该受体介导的胞饮作用。
3.权利要求2中所述共聚物，其中内收物是维生素B12。
4.权利要求2中所述共聚物，其中内收物是生物素。
5.权利要求2中所述共聚物，其中内收物是叶酸。
6.权利要求2中所述共聚物，其中内收物是亲脂性基团。
7.权利要求6中所述共聚物，其中内收物是下面结构式所代表的酰基
其中X是1-20的整数。
8.权利要求6中所述共聚物，其中内收物由胆甾醇基组成。
9.权利要求1中所述的共聚物，其中A是
是0，1，2，或3，n是1-8的整数，每个R3和R4独立地选取氢或羟基，每个R2可独立地选取硫或氧，R5是羟基，或者它们的可以药用的盐，该化合物通过它们2′末端核苷的2′-位与所说的内收物共价相连。
10.权利要求9中所述共聚物，其中内收物是一种维生素。
11.权利要求10中所述共聚物，其中的维生素可选择维生素B12，叶酸，或生物素。
12.权利要求9中所述共聚物，其中内收物是亲脂性基团。
13.权利要求9中所述共聚物，其中内收物是胆甾醇。
全文摘要
通过将代谢稳定,无毒且具有双重治疗作用的2′,5′－寡聚腺苷酸(2—5A)衍生物给药于哺乳动物以抑制病毒感染,该化合物能激活对细胞内潜在2—5A依赖的内源性核糖核酸酶(RNA酶L)且还能抑制病毒DNA聚合酶。本发明还记载了用于治疗转运的2—5A衍生物的共聚物。
文档编号C07J43/00GK1191753SQ9712268
公开日1998年9月2日 申请日期1997年11月14日 优先权日1992年3月12日
发明者R·J·苏哈多尼克, W·弗莱德勒 申请人:坦普尔大学