新的Aβ构象异构体选择性抗Aβ球聚体的单克隆抗体的制作方法

专利名称：新的Aβ构象异构体选择性抗Aβ球聚体的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于治疗和诊断阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease) 的单克隆抗体。具体地讲，本发明涉及称为10F4和3C5的单克隆抗 体以及具有类似性质的其它单克隆抗体(例如鼠、人或人源化单克隆抗 体)。
背景信息
1907年，内科医生爱罗斯*阿尔茨海默(Alois Alzheimer)最早描述 了痴呆形式的神经病理学特征，后来为了纪念他，便将该病命名为阿 尔茨海默病(AD)。具体地讲，AD是年长者痴呆中最常见的起因，65 岁以上人群的发病率约为10%。随着年龄增大，发病率也上升。全球 大约有1500万人罹患此病，预期随平均寿命进一步延长，再过几十 年患病人数将增加约三倍。
从分子观点来看，阿尔茨海默病(AD)的特征是聚集异常的蛋白质 的沉积。在胞外淀粉状蛋白斑的情况下，这些沉积主要由淀粉状蛋白 P肽丝组成，在胞内神经原纤维缠结(NFT)的情况下，主要由T蛋白组 成。淀粉状蛋白P(AP)肽由P-淀粉状蛋白前体蛋白被蛋白酶切割而产 生。这种切割通过名为a-分泌酶、(3-分泌酶和？分泌酶的几种蛋白酶 的协同活性实现。切割产生多个长度不同的特定片段。淀粉状蛋白斑 主要由长度为40个或42个氨基酸(AP40、 A^42)的肽组成。主要的切 割产物为A(340;然而，A(342具有强得多的毒性作用。与在阿尔茨海默病中观察到的非常类似的大脑淀粉状蛋白沉积物和认知缺损也是
唐氏综合征(Down's syndrome)(三体性21)的标志，该病在出生时的发 生率为1/800。
Hardy和Higgins的淀粉状蛋白级联假说假定Ap(l-42)产生的增 加可导致初原纤维和原纤维(即Ap斑块的主要组分)的形成，这些原纤 维是造成阿尔茨海默病症状的原因。尽管痴呆的严重程度与沉积的A卩 斑块负载之间关联性低下，但是这个假说至今仍受到支持。AD肺内 可溶性A(3形式(其比起斑块负载与AD症状更为相关)的发现，导致了 对淀粉状蛋白级联假说被修正。
用Ap肽主动免疫导致斑块形成减少，并且导致已有斑块部分溶 解。同时，在APP转基因小鼠模型中导致认知缺陷减轻。对于用针对 A卩肽的抗体的被动免疫，也发现了 A卩斑块负载减少。用AN-1792 (聚 集的原纤维状态下的A卩(l-42)肽)主动免疫的IIa期试验结果(ELAN Corporation Pic， South San Francisco, CA， USA和Dublin, UK)表明， 针对AP肽的免疫疗法是成功的。在30名患者的分组中，通过MMSE 和DAD指数测定，具有阳性抗AP抗体效价的患者中，疾病进程显著 减緩。
然而，该研究因为脑膜脑炎形式的严重副作用被中止(Bennett和 Holtzman， 2005， Neurology, 64， 10-12)。具体地讲，脑膜脑炎的特 征是神经炎症和T细胞浸润至脑部。据推测，这是由于注射作为抗原 的A卩(1-42)引起T细胞免疫应答所致。在被动免疫之后，预期不会出 现这类免疫应答。迄今为止，没有可供参考的临床数据。然而，关于 这种被动的免疫方法，由于在非常年老的APP23小鼠的临床前研究， 引起对有关副作用状况的顾虑，该小鼠5个月内一周一次接受针对 A卩(1-42)N端表位的抗体。具体地讲，与盐水治疗的对照动物相比， 这些小鼠表现出微出血数和严重程度增加(Pfeifer等，2002, Science, 298, 1379)。在非常年老(> 24个月)的Tg2576和PDAPP小鼠中也披 露了类似的微出血增加(Racke等，2005， J Neurosci, 25， 629-636;Wilcock等，2004, J. Neuroinflammation， 1(1):24; DeMattos等，2004, Neurobiol. Aging 25(S2):577)。在两个小鼠品系中，抗体注射导致微出 血显著增加。相比之下，针对Ap(l-42)肽中部区域的抗体不会引起微 出血(de Mattos等，出处同上)。未引起微出血与用不结合CAA形式 聚集的A卩肽的抗体治疗有关(Racke等，J Ne画ci， 25， 629-636)。 然而，尚不清楚导致APP转基因小鼠微出血的确切机制。据推测，脑 淀粉样蛋白血管病(CAA) 1起或至少加重大脑出血。CAA存在于几乎 所有阿尔茨海默病脑部，约20。/o的病例被视作"严重CAA"。因此，被 动免疫应当以通过选出识别Ap肽中部区域或羧基端区域的抗体从而 避免微出血为目的。
国际专利申请公布号WO2004/067561披露了稳定的A(3(l-42)寡 聚体(A(3(l-42)球聚体(globulomer))和针对该球聚体的特异性抗体。用 非特异性蛋白酶消化显示，Ap球聚体可以从球状核心结构突出来的 亲水N端开始消化(Barghorn等，2005, JNeurochem, 95， 834-847)。 这类N端截短的A卩球聚体(Ap(12-42)和Ap(20-42)球聚体)代表该寡聚 体AP的基本结构单元，并且是主动免疫兔和小鼠导致高抗体效价的 十分有效的抗原(W02004/067561)。若干有关AD脑部中存在N端截 短的A(3形式的最新报道提出了其体内病理作用的假说(Sergeant等， 2003， JNeurochem, 85, 1581-1591; Thal等，1999, JNeuropathol. Exp Neurol， 58， 210-216)。在体内消化期间，可能涉及脑内存在的某些蛋 白酶，例如中性溶酶(NEP24.11)或胰岛素降解酶(IDE)(Selkoe, 2001， N函n， 32， 177-180)。
由此看来，十分急迫地需要即便有副作用(例如微出血)但副作用 也很小的阿尔茨海默病的疗法。出于此类治疗，相关患者能够维持具 有功能和活动的生活方式达多年，在这以后可能无需这类治疗。因此， 对于这类治疗不仅意味着经费问题，而且还意味着"生活质量"问题， 这不仅仅对于患者，而且还对于他们的护理人员而言。
10附图简述


图1 (a)显示不同抗A卩抗体(6E10、 3C5、 10F4)特异性的斑点印 迹分析。通过用Ap(12-42)球聚体(按照实施例I中所述方法制备)使小 鼠主动免疫后，筛选融合的杂交瘤细胞来获得本文受试单克隆抗体(市 售6E10除外，Signet,目录号9320)。对各A|3形式进行连续稀释， 并与相应的单克隆抗体一起温育以进行免疫反应
1. AJ3(l-42)单体，0.1%NH4OH
2. A卩(l-40)单体，0.1%NH4OH
3. AJ3(1画42)单体，0.1%NaOH
4. A卩(l-40)单体，0.1%NaOH
5. A卩(l-42)球聚体
6. A(3(12-42)球聚体
7. A卩(20-42)球聚体
8. A卩(l-42)原纤维制备物
9. sAPPa (Sigma)(第 一斑点1 pmol)
图1 (b)说明应用强度光密度分析所做的定量评价。对于每种A卩 形式，仅评价对应于最低抗原浓度的斑点，前提是其相对密度大于最 后清晰地目视辩别得出的Ap(l-42)球聚体斑点相对密度的20% (阈 值)。单独地测定了每个斑点印迹的这个阈值。对于给定抗体，该值表 示A(3(l-42)球聚体的识别与各个A卩形式之间的关系。
图2
图2说明从阿尔茨海默病脑组织中免疫沉淀的A卩肽的结果。 图2 (a)表示用于分析的患者材料详述。
图2 (b)i兌明A(3(l-40)-肽和Ap(l-42)肽的免疫沉淀量，用抗体 6E10、 3C5、 10F4和对照抗体IgG2b对不同患者脑样品和对照脑样品 进行SELDI-MS分析定量测出。
ii图2(c)i兌明A(3(l-40)肽和Ap(l-42)肽的相对免疫沉淀量，用抗体 3C5、 10F4和对照抗体IgG2b与全A卩抗体6E10比较，以百分比为单 位，对不同患者脑样品和对照脑样品进行SELDI-MS分析定量测出。 将抗体6E10的A(3肽免疫沉淀的总量设为100%。
图2(d)说明A卩肽的免疫沉淀量，通过用抗体6E10、 3C5、 10F4 和对照抗体IgG2b对不同患者脑样品和对照脑样品进行蛋白质印迹分 析定量测出。
图2 (e)说明A(3肽的相对免疫沉淀量，用抗体3C5、 10F4和对照 抗体IgG2b与全A卩抗体6E10比较，以百分比为单位，对不同患者脑 样品和对照脑样品进行蛋白质印迹分析定量测出。抗体6E10免疫沉 淀的A卩肽的总量设为100%。
图3 (a)表示以下成分考马斯染色的SDSPAGE:
1) 标准蛋白(分子标记蛋白)
2) A卩(l-42)原纤维制备物；对照
3) A卩(l-42)原纤维制备物十mAb6E10, 20小时，37°C
4) A(3(l-42)原纤维制备物+mAb6E10， 20小时，37°C
5) A卩(l-42)原纤维制备物+mAb3C5， 20小时，37°C，
6) A卩(l-42)原纤维制备物+mAb3C5, 20小时，37°C，
7) A(3(l-42)原纤维制备物+mAb 10F4， 20小时，37°C
8) A卩(l-42)原纤维制备物+mAblOF4, 20小时，37°C 图3 (b)显示体外抗体结合A(3-原纤维的光密度定量分析。
图4
图4显示不同浓度的抗体与阿尔茨海默病(AD)患者或老年APP 转基因小鼠新皮质横切片的结合情况。
图4(a)表示通过刚果红染色，在APP转基因小鼠系Tg2576和AD
，上清液 ，沉淀
上清液
沉淀 ，上清液 ，沉淀
12患者(RZ55)脑中，确认淀粉状蛋白沉积物在脑组织中为斑块，在脑血 管中为脑淀粉样蛋白血管病(CAA)。
图4(b)显示在AD患者(RZ16)中仅用6G1和市售抗体6E10产生 的实质A(3沉积(淀粉状蛋白斑)的强染色，而10F4和3C5则显示明显 较弱的染色。所有抗体都在0.7 [xg/mL的浓度下测定。
图4(c)表示TG2576小鼠中仅用6G1和市售抗体6E10产生.的实 质A卩沉积(淀粉状蛋白斑)的强染色，而10F4和3C5则显示明显较弱 的染色。所有抗体都在0.7吗/mL的浓度下测定。
图4(d)-图4(g)显示采用成像分析对组织学图像中AP斑块染色的 定量分析。从斑块的灰度值减去背景组织的灰度值计算出光密度值 (0% =未染色)。(图4(d)显示Tg2576小鼠中0.7吗/mL抗体的结合情 况。图4(e)显示APP/L小鼠中0.07-0.7吗/mL抗体的结合情况。图4(f) 显示AD患者(RZ55)中0.7 pg/mL抗体的结合情况，图4(g)显示AD患 者(RZ16)中0.07-0.7 pg/mL抗体的结合情况。对市售抗体6E10 (starts) 和4G8(圆圈)以及抗体6G1、 10F4和3C5(对于对照，l个星号/圓圈 p<0.05， 2个星号/圆圈:p<0.01, 3个星号/圆圈:pO.OOl; ANOVA 后的事后Bonferroni t检验pO.001)的染色之间的差异进行了统计学评 价(图4(d)和(e))。图4(e)和图4(g)中,显示抗体10F4和3C5的染色总 比市售抗体6E10和4G8的明显较弱(ANOVA pO.OO 1后的事后t检验 p<0.05)。
图4(h)显示仅用6G1和市售抗体6E10产生血管A卩沉积物(箭头) 强染色，而用8F5或8C5染色则弱得多。所有抗体都在0.7 jag/mL的 浓度下测定。Tg2576小鼠中出现性质上类似的情形(本文未显示)。
图5 (a)、图5 (c)、图5 (e)和图5 (g)显示由单克隆抗体6E10、 10F4、 3C5和8F5从阿尔茨海默病患者CSF中免疫沉淀的A(3(l-40)和 A卩(l-42)肽的量。4个阿尔茨海默病CSF样品的结果见下((a)-编号为0504009的阿尔茨海默病患者；(c)=编号为30027的阿尔茨海默病 患者；(e):编号为30026的阿尔茨海默病患者；(g)=编号为26748015 的阿尔茨海默病患者)。
图5 (b)显示与由抗体6E10免疫沉淀的Ap肽的量相比，由抗体 10F4、 3C5和8F5从阿尔茨海默病患者CSF中免疫沉淀的A卩(l-40) 和A(3(l-42)肽的相对量，单位为百分比。将由mAb 6E10抗体免疫沉 淀的A卩肽的总量设为100%。 4个阿尔茨海默病CSF样品的结果见下 ((b)-编号为0504009的阿尔茨海默病患者；(d)-编号为30027的阿尔 茨海默病患者；(f)4扁号为30026的阿尔茨海默病患者；(h)=编号为 26748015的阿尔茨海默病患者)。
图5 (i)表示用于图5(a)-5(i)分析的阿尔茨海默病患者CSF材料的 详情。
图6
图6 (a)表示编码本文称为"3C5"的单克隆抗体的可变重链的 DNA序列(SEQ ID NO:l)。
图6 (b)表示编码本文称为"3C5"的单克隆抗体的可变轻链的 DNA序列(SEQ ID NO:2)。
图6 (c)表示编码本文称为"10F4"的单克隆抗体的可变重链的 DNA序列(SEQ ID NO:3)。
图6 (d)表示编码本文称为"10F4"的单克隆抗体的可变轻链的 DNA序列(SEQ ID NO:4)。
图7
图7 (a)表示编码本文称为"3C5"的单克隆抗体的可变重链的氨基 酸序列(SEQ ID NO:5)。
图7 (b)表示编码本文称为"3C5"的单克隆抗体的可变轻链的氨基 酸序列(SEQ ID NO:6)。
14图7 (c)表示编码本文称为"10F4"的单克隆抗体的可变重链的氨 基酸序列(SEQ ID N0:7)。
图7 (d)表示编码本文称为"10F4"的单克隆抗体的可变轻链的氨 基酸序列(SEQ ID NO:8)。(互补决定区(CDR)在各所述序列中用下划线 标出)。
发明概述
本发明包括针对AP球聚体(A卩globulomer)的抗体，它在免疫疗 法中改善患者的认知行为，与此同时仅与脑内Ap肽总量中的一小部 分反应。该性质防止了对大脑A卩平衡产生实质性千扰，并引起较少 的副作用。(例如在使用聚集原纤维状态的A(3肽(ELAN Corporation Plc， South San Francisco, CA， USA和Dublin, UK)进行主动免疫或 使用AN-1792 (聚集原纤维状态的Ap(l-42)肽)进行主动免疫的研究 中，观察到在治疗上引起争议的脑体积缩小。此外，在该临床试验中， 观察到脑膜脑炎形式的严重副作用。)
具体地讲，本发明通过提供对A(3球聚体具有高亲和力的A卩球 聚体抗体，解决了上述的副作用问题。这些抗体能够识别其它形式的 A卩肽，特别是单体、原纤维和sAPPa。此外，本发明的抗体可通过 仅结合非CSF的淀粉状蛋白(3，从而鉴别脑脊液(CSF)的淀粉状蛋白p。 另外，与已知抗体(即6E10)相比，本发明的抗体(例如10F4和3C5) 较少与AP斑块和血管A(3结合。
具体地讲，本发明包括对A|3( 1 -42)球聚体的亲和力比对至少 一种 选自以下的淀粉状P蛋白的亲和力高的分离抗体a)脑脊液(CSF)中存 在的A卩(l-42)肽，和b) CSF中存在的A卩(l-40)肽。
本发明还包括对A(3(l-42)球聚体的结合亲和力比对至少一种选 自以下的淀粉状卩蛋白的结合亲和力高的分离抗体a) A卩(l-42)单体， b) A(3(l-40)单体，c) A(3(l-42)原纤维，和d)可溶性淀粉状前体蛋白a (soluble amyloid precursor protein-alpha, sAPPa)。比起CSF中存在的淀粉状卩蛋白，该抗体结合非CSF中存在的淀粉状(3蛋白的亲和力较高。 上述抗体可以是例如鼠抗体、单克隆抗体、重組抗体、人抗体和 /或人源化抗体。此外，本发明抗体的任一种或多种可与至少一个表位 结合，该表位与单克隆抗体10F4(获自标注为美国典型培养物保藏中 心保藏号PTA-7808的杂交瘤)或单克隆抗体3C5 (获自标注为美国典 型培养物保藏中心保藏号PTA-7406的杂交瘤)结合的一个或多个表位 相同。
另夕卜，本发明包括；包含SEQIDN0:5的分离抗体、包含SEQID NO:6的分离抗体以及同时包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的分离抗体。
此外，本发明包括包含SEQIDNO:7的分离抗体、包含SEQ ID NO:8的分离抗体以及同时包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的分离抗体。
本发明的上述抗体可包含至少一个选自以下的氨基酸序列a)单 克隆抗体(10F4)(获自标注为美国典型培养物保藏中心保藏号 PTA-7808的杂交瘤)的重链CDR3的氨基酸序列和轻链CDR3的氨基 酸序列，以及b)单克隆抗体(3C5)(获自标注为美国典型培养物保藏中 心保藏号PTA-7406的杂交瘤)的重链CDR3的氨基酸序列和轻链 CDR3的氨基酸序列。
此外，本发明的上述抗体可包含至少一个选自以下的氨基酸序 列a)单克隆抗体(10F4)(获自标注为美国典型培养物保藏中心保藏号 PTA-7808的杂交瘤)的重链CDR2的氨基酸序列和轻链CDR2的氨基 酸序列，以及b)单克隆抗体(3C5)(获自标注为美国典型培养物保藏中 心保藏号PTA-7406的杂交瘤)的重链CDR2的氨基酸序列和轻链 CDR2的氨基酸序列。
同样，本发明的抗体可包含至少一个选自以下的氨基酸序列a) 单克隆抗体(10F4)(获自标注为美国典型培养物保藏中心保藏号 PTA-7808的杂交瘤)的重链CDR1的氨基酸序列和轻链CDR1的氨基
16酸序列，以及b)单克隆抗体(3C5)(获自标注为美国典型培养物保藏中 心保藏号PTA-7406的杂交瘤)的重链CDR1的氨基酸序列和轻链 CDR1的氨基酸序列。
另外，本发明还包括包含至少一个选自以下氨基酸序列的CDR 的分离抗体a) SHYAWN ; b) YIDYSGSTRYLPSLKS ; C) GSGYFYGMDY ; d) HASQNINVWLS ; e) KASNLHT ; f) QQGQSYPYT ; g) NYL正；h) VINPGSGDTNYNENFKG ; i) GVITTGFDY; j) RASGNIHNYLA; k) NAKTLAD和1) QHFWSSPRT。
另外，本发明包括标注为美国典型培养物保藏中心保藏号 PTA-7808的杂交瘤以及由标注为美国典型培养物保藏中心保藏号 PTA-7808的杂交瘤获得或产生的单克隆抗体(10F4)。
本发明还包括标注为美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7406 的杂交瘤以及由标注为美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7406的 杂交瘤获得或产生的单克隆抗体(3C5)。
此外，本发明包括编码上述抗体的分离的核酸分子。该分子的核 苷酸序列可包含至少一个选自以下的序列SEQ ID NO:l、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。本发明还包括包含所述分离的 核酸分子的载体以及包含所述载体的宿主细胞。
另外，本发明包括制备抗体的方法，该方法包括将上述宿主细胞 在适于产生上述任一种抗体的条件下在培养基中培养一段时间。按照 该方法制备的抗体也包括在本发明的范围内。
本发明还包括包含上述任一种或多种抗体的组合物。该组合物还 包含药学上可接受的载体。
此外，本发明包括包含由至少 一个选自以下的核苷酸序列编码的 氨基酸序列的单克隆抗体SEQ ID NO:l 、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4。该抗体可选自由标注为美国典型培养物保藏中心保 藏号PTA-7406的杂交瘤产生的单克隆抗体和由标注为美国典型培养 物保藏中心保藏号PTA-7808的杂交瘤产生的单克隆抗体。该抗体还可包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
本发明还包括用于治疗或预防需要这种治疗或预防的患者的淀 粉样变性(amyloidosis)的方法。该方法包括以足以实现治疗或预防的 量给予患者一种或多种上述抗体(通过被动免疫)。淀粉样变性可为例 如阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性。
本发明还包括与患有淀粉样变性的患者脑中的淀粉状|3蛋白的至 少一个表位结合的分离抗体。该抗体可通过例如ATCC保藏号选自 PTA-7406和PTA-7808的杂交瘤产生。
本发明还包括在疑似患有阿尔茨海默病的患者中诊断阿尔茨海 默病的方法。该方法包括以下步骤从患者体内分离出生物样品(例如 CSF样品或脑组织样品)；使该生物样品在足以形成抗原/抗体复合物 的条件下与一种或多种上述抗体接触一段时间；检测样品中抗原/抗体 复合物的存在情况，复合物的存在表明在患者中诊断出阿尔茨海默 病。复合物的抗原可以为例如球聚体。
另外，本发明包括在疑似患有阿尔茨海默病的患者中诊断阿尔茨 海默病的另一种方法。该方法包括以下步骤从患者体内分离生物样 品；在足以形成抗体/抗原复合物条件下使生物样品与抗原接触一段时 间；在足以使缀合物与结合抗体结合的条件下，将缀合物加到所得抗 体/抗原复合物一段时间(其中所述缀合物包含连有能够产生可检测信 号的信号产生化合物的本发明的分离抗体)；通过^r测由信号产生化合 物产生的信号，来检测可能存在于生物样品中的抗体的存在情况，该 信号表明在患者中诊断出阿尔茨海默病。用于该测定法的抗原可以为 例如^求聚体。
此外，本发明包括在疑似患有阿尔茨海默病的患者中诊断阿尔茨 海默病的其它方法。该方法包括以下步骤从患者体内分离生物样品； 在足以形成抗抗体/抗体复合物的条件下，使生物样品与抗抗体(其中 所述抗抗体对一种或多种本发明抗体具有特异性)接触一段时间，该复合物含有存在于生物样品中的抗体；在足以使缀合物与结合抗体结合 的条件下，将缀合物加到所得抗抗体/抗体复合物一段时间(其中所述 缀合物包含结合能够产生可检测信号的信号产生化合物的抗原)；检测 由信号产生化合物产生的信号，该信号表明在患者中诊断出阿尔茨海 默病。
另外，本发明包括包含一种或多种本发明抗体和药学上可接受的 佐剂的疫苗。
此外，本发明包括鉴定化合物的方法，所述化合物适于使预测将 发生阿尔茨海默病的患者主动免疫。该方法包括以下步骤在足以使 一种或多种化合物与一种或多种抗体结合的条件下，将一种或多种目 标化合物暴露于一种或多种本发明抗体一段时间；然后鉴定出与一种 或多种抗体结合的那些化合物，所鉴定出的化合物可用于使预测将发 生阿尔茨海默病患者主动免疫。
本发明还包括诊断盒，该诊断盒包括一种或多种本发明的抗体以 及包含连有信号产生化合物的抗体的缀合物，其中缀合物的抗体不同 于诊断盒内的一种或多种抗体。诊断盒中还可包括包装说明书，它描 述了进行测定所采用的步骤以及诊断盒的组分。
本发明还包括另一种诊断盒，该诊断盒包括针对一种或多种本发 明抗体的抗抗体和包含连有信号产生化合物的抗原的缀合物。该抗原 可为例如球聚体。此外，还可包括包装说明书，它描述了进行测定所 采用的步骤以及诊断盒的组分。
发明详述
如实施例1中所述，由用截短的球聚体Ap(12-42)进行免疫设计 出本发明的抗体。具体地讲，针对截短的(12-42)球聚体产生了单克隆 抗体3C5和10F4 (与针对A卩(l-42)球聚体制备的单克隆抗体8F5和 8C5形成对比)。与Barghom等所述方法(Barghorn等，J. Neurochem， 95， 834-847)和实施例3第6项中所述的方法(该项中(12-42)球聚体通
19l-42球聚体制备)相比，该Ap(12-42) 球聚体由AP 12-42肽直接制备。这两种A(3(12-42)球聚体变体在其最 终的聚集模式上有所不同。由Ap(12-42)肽制备的一种只具有中间球 聚体形式(如WO2004/067561中所述的"寡聚体A"),由预先存在的 A卩(l-42)球聚体制备的另一种则是成熟的球聚体(如WO2004/067561 中所述的"寡聚体B")。
本发明的目的是提供针对AP球聚体的抗体，所述抗体在免疫疗 法中改善患者的认知行为，与此同时仅与脑内AP肽总量中的一小部 分反应。预期这可防止对大脑Ap平衡产生实质性干扰，并引起较少 的副作用(例如如上所述，在使用聚集原纤维状态的Ap肽进行主动免 疫的研究中(用AN1792的ELAN实验)，观察到在治疗上引起争议的 脑体积缩小。另外，在这个试验中，还观察到脑膜脑炎形式的严重副 作用。本发明通过提供对A(3球聚体具有高亲和力的球聚体特异性抗 体解决了这个问题。这些抗体能够分辨出其它形式的Aj3肽，特别是 单体和原纤维。此外，这些抗体不与大脑脊液中的淀粉状蛋白P结合 (或者相对于市售抗体(例如6E10) (Signet目录号9320),以较低亲和 力结合)。因此，本发明涉及对A(3球聚体具有结合亲和力的抗体。
本文术语"AP(X-Y)，，是指人淀粉状P蛋白的氨基酸位置X到氨基 酸位置Y (包括X和Y)的氨基酸序列，具体是指氨基酸序列 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IAT (相当于氨基酸位置l-43)的氨基酸位置X到氨基酸位置Y的氨基酸序 列或其天然存在的任何变体，特别是具有至少一个选自以下突变的氨 基酸序列A2T、 H6R、 D7N、 A21G ("Flemish")、 E22G ("Arctic")、 E22Q ("Dutch") 、 E22K ("Italian") 、 D23N ("Iowa，，)、 A42T和A42V, 其中编号与AP肽的启始顺序相对应，包括位置X和位置Y在内或具 有最多3个另外的氨基酸取代的序列，任何取代无一可妨碍球聚体形 成，优选自氨基酸12或编号更高的X起到氨基酸42或编号更低的Y 止的部分没有另外的氨基酸取代，更优选自氨基酸20或编号更高的X
20起到氨基酸42或编号更低的Y止的部分没有另外的氨基酸取代，最 优选自氨基酸20或编号更高的X起到氨基酸40或编号更低的Y止的 部分没有另外的氨基酸取代，本文"另外的"氨基酸取代是指不是天然 存在的与规范序列的任何偏差。
本文术语"A(3(l-42)"是指自人淀粉状(3蛋白氨基酸位置1到氨基 酸位置42 (包括1和42)的氨基酸序列，具体是指氨基酸序列 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA 或其天然存在的任何变体，特别是具有至少一个选自以下突变的氨基 酸序列A2T、 H6R、 D7N、 A21G ("Flemish") 、 E22G ("Arctic") 、 E22Q ("Dutch")、 E22K ("Italian"), D23N ("Iowa，，)、 A42T和A42V,其中编 号与A卩肽的启始顺序相对应，包括1和42两者在内，或者具有最多 3个另外氨基酸取代的序列，任何取代无一可妨碍球聚体形成，优选 自氨基酸20到氨基酸42的部分没有另外的氨基酸取代。同样，本文 术语"Ap(l-40)"是指人淀粉状P蛋白自氨基酸位置1到氨基酸位置40 (包括1和40)的氨基酸序列，具体是指氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV或其天然存在的任何 变体，特别是具有至少一个选自以下突变的氨基酸序列A2T、 H6R、 D7N、 A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic")、 E22Q ("Dutch")、 E22K ("Italian"),和D23N ("Iowa"),其中编号与A(3肽的启始顺序相对应， 包括1和40两者在内，或者具有最多3个另外的氨基酸取代的序列， 任何取代无一可妨碍球聚体形成，优选自氨基酸20到氨基酸40的部 分没有另外的氨基S臾取代。
本文术语"Ap(12-42)"是指人淀粉状卩蛋白自氨基酸位置12到氨 基酸位置42 (包括12和42)的氨基酸序列，具体是指氨基酸序列 VHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA或其天然存在的任 何变体，特别是具有至少一个选自以下突变的氨基酸序列A21G ("Flemish")、 E22G ("Arctic")、 E22Q ("Dutch")、 E22K ("Italian") 、 D23N ("Iowa")、 A42T和A42V，其中数值与A卩肽的始末位置相对应，包括12和42两者在内，或者具有最多3个另外的氨基酸取代的序列， 无任何取代可妨碍球聚体形成，优选自氨基酸20到氨基酸42的部分 没有氨基酸取代。
本文术语"A卩(20-42)"是指人淀粉状卩蛋白自氨基酸位置20到氨 基酸位置42同时包括20和42的氨基酸序列，特别是氨基酸序列F
具有至少一个选自以下的突变A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic")、 E22Q ("Dutch")、 E22K ("Italian"), D23N ("Iowa，，)、 A42T和A42V, 其中编号与A(3肽的启始顺序相对应，包括20和42两者在内，或者 具有最多3个另外的氨基酸取代的序列，任何取代无一可妨碍球聚体 形成，优选没有任何另外的氨基酸取代。
本文术语"AP(X-Y)球聚体"即(A(3(X-Y)球状寡聚体(globular oligomer))是指如上定义的球状非共价締合的可溶性A(3(X-Y)肽，具有 均质性和独特的物理性质。 一方面，AP(X-Y)球聚体是稳定的非原纤 维状寡聚装配的AP(X-Y)肽，它通过与阴离子洗涤剂一起温育获得。 与单体和原纤维相比，这些球聚体的特征是明确的亚基装配数(例如 WO2004/067561中所述的早期装配形式，n=4-6，"寡聚体A"，后期装 配形式，n=12-14，"寡聚体B")。球聚体具有三维球形结构("熔球(molten globule)",参见Barghorn等，2005， JNeurochem, 95, 834-847)。它 们进一步用下列一个或多个特征表征
-N端氨基酸X-23具有无选择性蛋白酶(promiscuous protease)(例 如嗜热菌蛋白酶或内切蛋白酶GluC)的可切割性，产生截短形式的球 聚体；
-C端氨基酸24-Y具有无选择性蛋白酶和抗体的不可及性；
-截短形式的这些球聚体维持所述球聚体的三维核心结构，该结
构具有其球聚体构象中的核心表位Ap(20-Y)的更好的可接近性。
按照本发明，特别是为了评价本发明抗体的结合亲和力，本文术
语"AP(X-Y)球聚体"具体是指通过例如下述实施例I中所述方法获得
22的产物(另见WO 04/067561)。该方法可用来获得A卩(l-42)球聚体、 A卩(12-42)球聚体和Ap(20-42)球聚体。优选球聚体对神经元细胞具有 亲和力。优选球聚体还具有神经调制作用。按照本发明的另一个方面， 球聚体由11-16个Ap(X-Y)肽组成，最优选由12-14个A(3(X-Y)肽组成。
按照本发明的另 一个方面，本文术语"A(3(X-Y)球聚体"是指基本 由AP(X-Y)亚基组成的球聚体，其中.如果12个亚基中的平均至少11 个为AP(X-Y)型则是优选的，如果10%以下的球聚体包含任何非 A卩(X-Y)肽则是更优选的，如果非A)3(X-Y)肽的含量低于检测阈值则 是最优选的。更准确地讲，本文术语"A卩(l-42)球聚体"是指基本由如 上定义的A卩(l-42)单元组成的球聚体；本文术语"Ap(12-42)球聚体"是 指基本由如上定义的Ap(12-42)单元组成的球聚体；本文术语 "A卩(20-42)球聚体"是指基本由如上定义的A(3(20-42)单元组成的球聚 体。
本文所用术语"交联AP(X-Y)球聚体"是指通过球聚体组成单元的 交联、优选化学交联、更优选乙醛交联、最优选戊二醛交联由如上所 述的A(3(X-Y)球聚体获得的分子。在本发明的另一个方面，交联球聚 体基本为球聚体，其中各单元通过共价键至少部分连接，而不仅是通 过非共价相互作用聚集在一起。对于本发明的目的，交联A卩(l-42)球 聚体特别为交联A(3(l-42)寡聚体。
本文所用术语"A卩(X-Y)球聚体衍生物"具体是指通过共价连接有 利于检测的基团而被标记的球聚体，所述基团优选荧光团，例如异硫 氰酸荧光素、藻红蛋白、维多利亚水母(Aequorea victoria)荧光蛋白、 Dictyosoma荧光蛋白或其任何组合或焚光活性衍生物；发色团；化学 发光团(chemoluminophore),例如萤光素酶，优选北美萤火虫(Photinus pyralis)萤光素酶、费氏弧菌(Vibrio fischeri)萤光素酶或任何组合或其 化学发光活性衍生物；酶活性基团，例如诸如辣根过氧化物酶等过氧 化物酶或其任何酶活性衍生物；电子致密基团，例如诸如含金基团等
23的含重金属基团；半抗原，例如苯酚衍生的半抗原；强抗原结构，例如预测有抗原性的肽序列，例如通过Kolaskar和Tongaonkar算法预测有抗原性的肽序列；另一个分子的适配体；螯合基团，例如六组氨酰基；调节特异性蛋白之间进一步的相互作用的天然蛋白质结构或天然衍生的蛋白质结构，例如许多fos/jun对；磁性基团，例如铁磁基团；或放射性基团，例如包含'H、 "C、 32P、 353或1251或其任何组合的基团；或通过共价或非共价高亲和力相互作用标注(flag)的球聚体，优选与促进钝化、螯合、降解和/或沉淀的基团共价连接，优选用促进体内降解的基团标注，更优选用泛素标注，其中如果经标注的寡聚体在体内装配，则是特别优选的；或者是指通过上述任何组合经过修饰的球聚体。这类标记基团和标注基团以及用于使它们与蛋白质连接的方法是本领域已知的。可以在球聚体化(globulomerization)之前、期间或之后进行标记和/或标注。在本发明的另一个方面，球聚体衍生物是通过标记和/或标注反应由球聚体得到的分子。相应地，本文术语"Ap(X-Y)单体衍生物"具体是指如球聚体所述被标记或被标注的A(3单体。
本文术语"较大亲和力"是指相互作用的程度，其中作为 一方面的未结合抗体和未结合球聚体与作为另 一方面的抗体-球聚体复合物之间的平衡更偏向于抗体-球聚体复合物。同样，本文术语"较小亲和力"是指相互作用的程度，其中作为 一方面的未结合抗体与未结合球聚体与作为另 一方面的抗体-球聚体复合物之间的平衡更偏向于未结合抗体和未结合球聚体。术语"较大亲和力"与术语"较高亲和力"同义，术语"较小亲和力"与术语"较低亲和力"同义。
本文术语"AP(X-Y)单体"是指分离形式的A(3(X-Y)肽，优选基本上不参与和其它a卩肽的非共价相互作用的形式的a(3(x-y)肽。实际上，A(3(X-Y)单体通常以水溶液形式提供。在本发明一个特别优选的实施方案中，单体水溶液含有0.05%-0.2%、更优选约0.1%NH4OH。在本发明另一个特别优选的实施方案中，单体水溶液含有0.05%-0.2%、更优选约0.1% NaOH。当使用时(例如用于测定本发明抗体的结合亲和力)，适宜的是以适当的方式稀释所述溶液。此外，通
常适宜的是在制备溶液后2小时内，特别在1小时内，尤其在30分钟内使用所述溶液。
本文术语"原纤维"是指包含各个非共价締合的AP(X-Y)肽的集合体(assemblies)的分子结构，在电子显孩"竟下呈原纤维结构，它与刚果红结合，然后在偏振光下出现双折散，其X射线衍射图形为交叉卩结构(cross-j3structure)。在本发明的另一个方面，原纤维是通过这样的方法获得的分子结构，即包括在洗涤剂不存在时(例如在0.1 MHC1中)，合适的A(3肽自身诱导的聚合体的聚集，导致24个以上、优选100个以上单元的聚集体的形成。该方法是本领域众所周知的。Ap(X-Y)原纤维适宜以水溶液的形式使用。在本发明一个特别优选的实施方案中，通过以下方法制备原纤维水溶液将A(3肽溶于0.1。/。 NH4OH，用20mMNaH2PO4、 140 mM NaCl (pH 7.4)将其稀释成l:4后，重调节pH至7.4，将溶液在37。C下温育20小时后，按10000 g离心IO分钟，重新悬浮于20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)。
本文术语"Ap(X-Y)原纤维"是指基本由A(3(X-Y)亚基组成的原纤维，如果平均至少90%的亚基是Ap(X-Y)型，则是优选的，如果至少98%的亚基是AP(X-Y)型的，则是更优选的，如果非A(3(X-Y)肽的含量低于检测阈值，则是最优选的。
本发明还涉及抗体，所述抗体具有与所述单克隆抗体10F4和3C5中任一种的结合谱(binding profile)类似的结合语。具有类似于所述单克隆抗体中任一种的结合谱的抗体包括其结合的表位是与单克隆抗体10F4和3C5结合的表位相同的抗体。
本发明还涉及能够与至少一种、优选与所有选自10F4和3C5的抗体竟争的抗体。本文术语"竟争抗体"是指任何数目的靶向相同分子实体或者稳定但非共价连接的超分子实体(优选相同分子)的抗体，其中至少一种抗体能够特异性地降低另一种抗体的可测量结合，优选通过空间阻碍另外一种抗体接近其靶表位，或者通过诱导和/或稳定可降
25低靶标对另 一种抗体亲和力的靶实体构象，更优选通过结合紧密接近另 一种抗体的耙表位的表位、结合与另 一种抗体的靶表位重叠或与其相同的表位(最优选结合重叠或相同的表位，特别是结合相同的表位)，来直接阻断另一种抗体接近其靶表位。如果两个表位有部分共同的化学结构，优选其氨基酸序列，则被称为"重叠的"，如果其化学结构，优选其氨基酸序列相同，则被称为"相同的"。因此，本发明还涉
及其靶表位与选自10F4和3C5中的至少一种抗体的靶表位重叠、优选相同的抗体。具有类似于所述单克隆抗体10F4和3C5任一种的结合谱的抗体，因此还包括包含所述单克隆抗体任一种的至少 一部分抗原结合部分的抗体。优选，所述部分包含所述单克隆抗体任一种的至少一个互补决定区(CDR)。因此，按照本发明进一步的实施方案，本发明涉及分别包含单克隆抗体10F4或3C5的重链CDR3的氨基酸序列和/或轻链CDR3的氨基酸序列的抗体。这类抗体的具体实例包括还分别包含单克隆抗体10F4或3C5的重链CDR2的氨基酸序列和/或轻链CDR2的氨基酸序列的抗体。甚至更具体地讲，这类抗体包括还分别包含单克隆抗体10F4或3C5的重链CDR1的氨基酸序列和/或轻链CDR1的氨基酸序列的抗体。 一方面，本发明因此涉及包含重链的抗体，该重链中CDR3、 CDR2和/或CDR1结构域包含单克隆抗体10F4或3C5的重链CDR3、 CDR2和/或CDR1的氨基酸序列。又一方面，本发明因此涉及包含轻链的抗体，该轻链中CDR3、 CDR2和/或CDR1结构域分别包含单克隆抗体10F4或3C5的轻链CDR3、 CDR2和/或CDR1的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含至少两个可变区CDR组(CDR set)。更优选两个可变区CDR组，选自VH 10F4 CDR组和VL10F4 CDR组；VH 3C5 CDR组和VL 3C5 CDR组(参见图7a-7d)。
在另一个实施方案中，上文所公开的抗体还包含人接纳体构架(acceptor framework)。在一个优选的实施方案中，抗体为CDR移植抗体(CDR grafted antibody)。优选CDR移植抗体包含一个或多个上文所公开的CDR。优选CDR移植抗体包含人接纳体构架。
在一个优选的实施方案中，抗体是人源化抗体。优选人源化抗体包含一个或多个上文所公开的CDR。更优选人源化抗体包含三个或更多个上文所公开的CDR。最优选人源化抗体包含六个上文所公开的CDR。在一个具体的实施方案中，CDR被掺到人接纳体构架的人抗体可变区。4尤选人4元体可变区为人共有可变区(consensus human variabledomain)。更优选人接纳体构架在关键残基处包含至少 一个构架区氨基酸取代，其中关键残基选自邻接CDR的残基；糖基化位点残基；稀有残基；能够与CDR相互作用的残基；规范残基(canonical residue);重链可变区与轻链可变区之间的接触残基；Vernier区内的残基及Chothia定义的可变重链CDRl与Kabat定义的第一重链构架之间重叠区中的残基。优选人接纳体构架包含至少一个构架区氨基酸取代，其中构架的氨基酸序列与所述人接納体构架的序列有至少65%同 一性，并包含至少70个与所述人接纳体构架相同的氨基酸残基。又一方面，本发明涉及同时包含如上定义的重链和轻链的抗体。优选抗体包含至少一个如上所述的可变区。更优选抗体包含两个如上所述的可变区，其中所述两个可变区的氨基酸序列如图7中所示。
另 一方面，本发明的抗体包含选自IgGl 、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、IgA、 IgD、 IgE重链恒定区和人IgGl Ala234 Ala235突变型恒定区。该抗体特别包含人恒定区。优选包含IgGl重链恒定区的抗体。
在另一个实施方案中，抗体是糖基化的。优选糖基化模式为人糖基化模式或本文所公开的任一种真核细胞所产生的糖基化冲莫式，特别是CHO细胞。
本发明还涉及本发明抗体的抗原结合部分。这类抗原结合部分包括但不限于抗体的Fab片段、F(ab')2片段和单链Fv片段。此外，抗原结合部分为Fab'片段、Fv片段和二硫键连接的Fv片段。
本发明还提供编码任一种本文所公开的抗体的分离核酸。又一个实施方案提供包含本文所公开的分离核酸的载体。所迷载体可特别选
27自pcDNA、 pTT (Durocher等，7Vwc/e/c/ asearc/ 2002,第30巻，第 2期)、pTT3 (具有另外多克隆位点的pTT)、 pEFBOS (Mizushima, S. 和Nagata, S., (1990)他c/e/cac^^舰rcA第18巻，第17期)、pBV、 pJV和pBJ。
另一方面，宿主细胞用本文所公开的载体转染。优选宿主细胞为 原核细胞。更优选宿主细胞为大肠杆菌(E. coli)。在一个相关的实施方 案中，宿主细胞为真核细胞。优选真核细胞选自原生生物细胞、动物 细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选宿主细胞为哺乳动物细胞，包括 但不限于CHO和COS;或真菌细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);或昆虫细月包，例长口 Sf9 。
本发明另 一方面提供制备本发明抗体的方法，该方法包括在适于 产生抗体的条件下，将任一种本文所公开的宿主细胞或杂交瘤在培养 基中培养。另一个实施方案提供通过本文所公开的方法获得的抗体。 本发明抗体可通过已知方式获得。总共含有由几千亿个不同的抗体种 类组成的抗体库的B淋巴细胞，是哺乳动物免疫系统的组成部分。对 特定抗原的正常免疫应答意味着筛选出所述抗体库的一种或多种抗 体，该抗体与所述抗原特异性结合，免疫应答的成功至少部分归因于 所述抗体特异性识别(并最终消除)刺激性抗原并忽略所述抗体环境中 的其它分子的能力。特异性识别一种特定靶抗原的抗体的实用性带动
了单克隆抗体技术的发展。标准化杂交瘤技术目前可供产生对目标抗 原具有专一特异性的抗体。最近，已经开发出重组抗体技术，例如抗
体文库的体外筛选。这些技术同样使得能够制备出对目标抗原具有专 一特异性的抗体。
在本发明的方法中，目标抗原可供在体内或体外作用于抗体库。 按照一个实施方案，通过用所述抗原对动物进行体内免疫接种，使抗 原作用于所述抗体库。这种体内方法另还包括由动物淋巴细胞建立许 多杂交瘤，选出分泌与所述抗原特异性结合的抗体的特定杂交瘤。待 免疫的动物可为例如小鼠、大鼠、兔、雏鸡、骆驼(camelid)或绵羊，或者可为上述任一种动物的转基因形式，例如，具有人免疫球蛋白基 因的转基因小鼠，它在抗原刺激后产生人抗体。可以被免疫的其它类
型的动物包括患有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠，该小鼠用人外 周单核血细胞重建(嵌合hu-PBMC SCID小鼠)，或用淋巴细胞或其祖 细胞重建；以及用致死全身辐照处理后，用得自患有严重联合免疫缺 陷(SCID)的小鼠的骨髓细胞保护以抵抗辐射，接着移植了人功能性淋 巴细胞的小鼠("Trimera"系统)。待免疫的动物的另 一种类型是其编码 目标抗原的基因组内源基因被关闭(敲除)(例如通过同源重组)的动物 (例如小鼠)，使得在用抗原免疫后，所述动物将所述抗原识别为外源 抗原。对用该方法产生的多克隆或单克隆抗体进行表征，并采用已知 筛选方法(包括但不限于ELISA和斑点印迹技术)选出。
按照另一个实施方案，通过用所述抗原筛选重组抗体文库，使抗 原能够体外作用于抗体库。例如，可以在噬菌体表面或在酵母细胞表 面或在细菌细胞表面表达重组抗体文库。在多个实施方案中，重组抗 体文库例如是scFv文库或Fab文库。按照另一个实施方案，抗体文库 表达成RNA-蛋白融合物。
制备本发明抗体的另 一种方法包括体内和体外方法的组合。例 如，通过用所述抗原在体内使动物免疫后，用所述抗原体外筛选出由 所述动物的淋巴细胞制备的重组抗体文库或单一结构域抗体文库(例 如含有重链和/或轻链的抗体库)，使该抗原作用于抗体库。按照另一 种方法，通过用所述抗原对动物进行体内免疫接种后，使由所述动物 的淋巴细胞所产生的重组抗体文库或单一结构域文库进行亲和力成 熟，来使抗原作用于抗体库。按照另一种方法，通过用所述抗原对动 物进行体内免疫接种后，选出各个分泌目标抗体的抗体生成细胞，由 所述选出细胞获得重链和轻链可变区所对应的cDNA (例如通过 PCR)，在哺乳动物宿主细胞中体外表达所述重链和轻链可变区(这被 称为选择'淋巴纟田月包抗体法(selected lymphocyte antibody method)或 SLAM)，从而能够进一步选出并操纵所选出的抗体基因序列，使抗原
29作用于抗体库。另外，可通过以下的克隆表达来选出单克隆抗体通 过在哺乳动物细胞中表达重链和轻链的抗体基因，选出分泌具有所需 结合亲和力的抗体的哺乳动物细胞。
用于产生抗体的本发明方法可用来制备各种类型的抗体。这些包 括单克隆抗体，特别是重组抗体，尤其重要的是人抗体、嵌合抗体、 人源化抗体和CDR移植抗体及其抗原结合部分。
本发明还涉及能够产生(分泌)本发明单克隆抗体的杂交瘤。本发 明的杂交瘤包括选自PTA-7808和PTA-7406的美国典型培养物保藏中 心保藏号标注的杂交瘤和产生单克隆抗体10F4和3C5的杂交瘤。
值得注意的是，本发明的抗体还可与本文所述Ap球聚体以外的 A卩形式反应(例如结合)。这些抗原可以是或不是寡聚体抗原或球聚体 抗原。因此，与本发明的抗体结合的抗原包括任何包含与本发明抗体 具有反应性的球聚体表位的A|3形式。这类A(3形式包括截短和非截短 的A卩(X-Y)形式(其中X和Y如上定义)，例如A卩(20-42)、 A卩(20-40)、 A卩(12-42)、 A卩(12-40)、 A(3(l-42)和A(3(l-40)形式，条件是所述形式包 含球聚体表位。
本发明还涉及包含如上定义的本发明抗体或其抗原结合部分的 组合物。按照具体实施方案，所述组合物为包含本发明抗体或抗原结 合部分和药学上可接受的载体的药物组合物。如上定义的本发明抗体 或抗原结合部分优选能够体外和体内中和与之结合的A(3球聚体或其 衍生物的活性。因此，所述抗体或抗原结合部分可用来例如在含有所
按照一个实施方案，本发明涉及抑制所述球聚体或其衍生物活性 的方法，该方法包括使本发明抗体或其抗原结合部分作用于球聚体或 其衍生物，从而抑制所述球聚体或其衍生物的活性。例如可以体外抑 制所述活性。例如，为了抑制所述样品中所述球聚体或其衍生物的活 性，可将本发明抗体或抗原结合部分加到例如得自受治疗者或细胞培养物的样品的制备物中，该制备物含有或者疑似含有所述球聚体或其 衍生物。或者，可以在个体体内抑制球聚体或其衍生物的活性。因此， 本发明还涉及如上定义的抗体或抗原结合部分在制备用于治疗或预 防淀粉样变性、特别是选自阿尔茨海默病和唐氏综合征淀粉样变性的 淀粉样变性的药物组合物中的用途。因此，本发明所述用途的一个方 面是治疗或预防有需要的受治疗者的淀粉样变性、特别是阿尔茨海默 病或唐氏综合征淀粉样变性的方法，该方法包括给予受治疗者如上定 义的抗体或抗原结合部分。采用用于治疗并尤其是预防淀粉样变性， 特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征淀粉样变性的所述抗体或抗原结 合部分，特别用于被动免疫。因此，在预防或治疗有需要的受治疗者 的淀粉样变性、特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征淀粉样变性的方法 中，给予受治疗者抗体或抗原结合部分的 一个目的是针对淀粉样变 性、特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征淀粉样变性使受治疗者被动免 疫。
如上定义的本发明抗体或抗原结合部分优选能够在体外和体内
检测出与之结合的A卩球聚体或其衍生物。因此，所述抗体或抗原结 合部分可用于例如在含有所述球聚体或其衍生物的制备物中或者在 存在所述球聚体或其衍生物的个人或其它哺乳动物体内，；险测所述球 聚体或其衍生物。
按照一个实施方案，本发明涉及检测所述球聚体或其衍生物的方
生物，从而与所述球聚体或其衍生物结合(并进而优选形成包含抗体或 其抗原结合部分与球聚体或其衍生物的复合物)。例如可以体外检测球 聚体。例如，为了在所述制备物中检测出所述球聚体或其衍生物，可 将本发明的抗体或抗原结合部分加到制备物中，该制备物是例如得自 含有或疑似含有所述球聚体或其衍生物的受治疗者或细胞培养物的 样品。或者，可以在个体体内检测球聚体或其衍生物。因此，本发明 还涉及如上定义的抗体或抗原结合部分在制备用于诊断淀粉样变性、
31特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征淀粉样变性的组合物中的用途。本 发明所述用途的一个方面是诊断疑似患有淀粉样变性、特别是阿尔茨 海默病或唐氏综合征淀粉样变性的受治疗者患有淀粉样变性、特别是 阿尔茨海默病或唐氏综合征淀粉样变性的方法，该方法包括给予受治 疗者如上定义的抗体或抗原结合部分，检测包含抗体或抗原结合部分 与抗原的复合物的形成情况，复合物的存在表明受治疗者患有淀粉样 变性、特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征淀粉样变性。本发明所述用 途的第二方面是诊断疑似患有淀粉样变性、特别是阿尔茨海默病或唐
氏综合征淀粉样变性的受治疗者患有淀粉样变性，特别是阿尔茨海默 病或唐氏综合征淀粉样变性的方法，该方法包括从受治疗者体内采 样，使样品与抗体或抗原结合部分(如上定义)接触，检测包含抗体或 抗原结合部分与抗原的复合物的形成情况，复合物的存在表明受治疗 者患有淀粉样变性、特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征淀粉样变性。
例如ELISA、斑点印迹法或BIA核心分析(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden和Piscataway, NJ)。有关进一步描述可参见J6nsson， U.等(1993) Ann, Biol. Clin. 51:19-26; J6nsson，U.等(1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson， B.等(1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131;以及 Johnnson， B.等(1991) Anal. Biochem. 198:268-277。按照具体实施方案， 本文定义的亲和力是指进行斑点印迹法，并用光密度测定法对其进行 评价而得到的数值。按照本发明的具体实施方案，通过斑点印迹法测 定结合亲和力包括以下步骤将一定量的抗原(例如如上定义的 A(3(X-Y)球聚体、A(3(X-Y)单体或A(3(X-Y)原纤维)或者适宜时例如在 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)、 0.2 mg/mL BSA中适当稀释 至抗原浓度为例如訓pmol/(iL、 10pmol/pL、 1 pmol/|aL、 0.1 pmol/|_iL 和0.01 pmol/^L的稀释液点样到硝化纤维素膜，然后将该膜用牛奶封 闭以防止非特异性结合，洗涤后，与目标抗体接触，接着后者通过酶 缀合的第二抗体和比色反应进行检测；在规定抗体浓度下，抗体结合的量使得能够测定出亲和力大小。因此两个不同抗体对一个靶标的相 对亲和力，或者一个抗体对两个不同靶标的相对亲和力，在此定义为 在其他方面相同的斑点印迹条件下，用两种抗体-把标组合观察到的与 靶标结合的抗体相应量的关系。不^f象基于蛋白质印迹法的类似方法，
斑点印迹法可确定抗体对其天然构象的给定靶标的亲和力；不像 ELISA方法，斑点印迹法不受在不同的耙标和基质之间的亲和力差异 困扰，从而可对不同靶标之间进行更准确的比较。
本文所用术语"Kd"是指本领域已知特定的抗体-抗原相互作用的 解离常数。
本发明的抗体优选为分离抗体。"分离抗体"是指具有如上所述的
术语"基本不含"是指抗体制备物中至少95%的抗体、优选至少98%的 抗体、更优选至少99%的抗体具有所需要的结合亲和力。另外，分离 抗体可基本不含其它细胞物质和/或化学试剂。
本发明的分离抗体包括单克隆抗体。本文所用"单克隆抗体"是指 共同具有共同的重链和共同的轻链氨基酸序列的抗体分子、抗体的制 备物，与含有不同的氨基酸序列的抗体混合物的"多克隆"抗体制备物 形成对比。单克隆抗体可通过若干新型技术制备，如噬菌体、细菌、 酵母或核糖体展示，以及通过以来源于杂交瘤的抗体为例的经典方法 制备(例如通过杂交瘤技术制备的杂交瘤分泌的抗体，例如标准Kohler 和Milstein杂交瘤方法((1975) Nature 256:495-497)。因此，具有一致 序列的非来源于杂交瘤的抗体本文仍称为单克隆抗体，尽管它可通过 非经典的方法获得，术语"单克隆"不局限于来源于杂交瘤的抗体，而 是用于指来源于一个核酸克隆的所有抗体。因此，本发明的单克隆抗 体包括重组抗体。本文所用术语"重组"是指两段另外分开的序列通过 例如化学合成或通过遗传工程技术操纵各段分离的核酸而得到的任 何人工组合(combination)。具体地讲，术语"重组抗体"是指通过重组 方法产生、表达、制备或分离的抗体，例如利用转染至宿主细胞的重
33组表达载体进行表达的抗体；从重组组合型抗体文库分离的抗体；由 人免疫球蛋白基因所致转基因动物(例如小鼠)分离出的抗体(参见例 如Taylor, L. D.等(1992) M/c/. 20:6287-6295);或者其中将特
定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)与其它DNA序 列装配在一起，以任何其它方式产生、表达、制备或分离的抗体。重 组抗体包括例如嵌合抗体、CDR移植抗体和人源化抗体。本领域技术 人员清楚，在异源系统中表达来源于常规杂交瘤的单克隆抗体需要产 生重组抗体，即使所得抗体蛋白的氨基酸序列没有变化或者并无意改 变。
在本发明的一个具体的实施方案中，抗体是人源化抗体。按照多 个实施方案，抗体可包含全部由单个物种得到的氨基酸序列，例如人 抗体或小鼠抗体。按照其它实施方案，抗体可以是嵌合抗体或CDR 移植抗体或另 一形式的人源化抗体。
术语"抗体，，是指由四条多肽链，即两条重(H)链和两条轻(L)链组 成的免疫球蛋白分子。各链通常通过二硫键彼此连接。每条重链由所 述重链可变区(本文简写为HCVR或VH)和所述重链恒定区组成。重 链恒定区由3个结构域CH1、 CH2和CH3组成。每条轻链由所述轻 链可变区(本文简写为LCVR或VL)和所述轻链恒定区組成。轻链恒定 区由CL结构域组成。VH和VL区可被进一步分成超变区，超变区称 为互补决定区(CDR)，散布在称为构架区(FR)的保守区内。因此，每 个VH和VL区由3个CDR和4个FR组成，FR按照以下列顺序从N 端至C端排列FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。该 结构为本领域技术人员所熟知。
术语抗体的"抗原结合部分"(或简称"抗体部分")是指本发明抗体 的一个或多个片段，所述一个或多个片段仍具有如上定义的结合亲和 力。完全抗体的片段显示能够实现抗体的抗原结合功能。按照术语抗 体的"抗原结合部分"，结合片段的实例包括(i) Fab片段，即由VL、 VH、 CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab')2片段，即包含通过二硫键在绞链区彼此连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和 CHI结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的FL和VH区组成的Fv 片段；(v)由VH结构域组成或者由VH、 CH1、 CH2、 DH3，或由VH、 CH2、 CH3组成的dAb片段(Ward等(l989) iVa似re 341:544-546);以及 (vi)分离的互补决定区(CDR)。尽管Fv片段的两个结构域即VL和VH， 由不同的基因编码，但是它们还可使用合成接头(例如聚G4S氨基酸序 列)和重组方法进一步彼此连接，使之可制成单个蛋白链，其中VL和 VH区结合以形成单价分子(称为单链Fv (ScFv);参见例如Bird等(l988) Sc/e"ce 242:423-426; Huston等(1988)尸rac. A/a".爿cac/. 5W. OS^ 85:5879-5883)。术语抗体的"抗原结合部分"还意欲包含这类单链抗体。 本发明还包括其它形式的单链抗体例如"双抗体，，。双抗体是二价双特 异性抗体，其中VH和VL结构域表达成单条多肽链，但是采用很短 以致这两个结构域不能够在同一链上结合的接头，从而迫使所述结构 域与不同链上的互补结构域配对，并形成两个抗原结合位点(参见例如 Holliger， P.等(1993)尸rac. iVa". JcW. 90:6444-6448; Poljak，
R. J.等(1994) 5Vn/c似re 2:1121-1123)。免疫球蛋白恒定结构域是指重链 或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列为本领 域所知。
与另一种或多种蛋白质或肽通过共价连接或非共价締合所形成的较 大的免疫黏附分子(immunoadhesion molecule)的组成部分。与这类免 疫黏附分子有关的是使用链霉抗生素核心区以制备四聚scFv分子 (Kipriyanov, S. M.等(1995) 爿w"6od/es awt/ 坊6nV/omos
6:93-101)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C端多聚组氨酰基(例如 六组氨酰基)、标签以产生二价生物素化scFv分子(Kipriyanov, S. M. 等(1994)Mo/. /mww"o/. 31:1047-1058)。
术语"人抗体"是指其可变区和恒定区相当于或得自人种系的免 疫球蛋白序列的抗体，例如参见Kabat等(1991) Se《we"c^ 0/尸raW朋o//mwwwo/ogz'ca/T^ereW,第五片反,美国卫生和福利部(U.S. Department of Health and Human Services), NIH出版号91-3242。然而，本发明的人 抗体可以含有不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如 通过体外随机诱变或位点特异诱变或者通过体内体细胞突变而引入 的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。本发明的重组人抗体 具有可变区，并且还可含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的恒定区(参 见Kabat， E. A.等(1991) Segwewces o/尸ra^w o/ 7m騰wo/喂'ca/ /w&rns/，第五版，美国卫生和福利部，NIH出版号91-3242)。然而按 照具体的实施方案，对这类重组人抗体进行了体外诱变(或进行了体细 胞体内诱变，条件是所使用的动物是由于人Ig序列所致转基因)，因 此重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，虽然与人种系 的VH和VL序列相关或衍生自人种系的VH和VL，但不是在人体内 抗体种系库内天然存在的序列。按照具体的实施方案，该类型的重组 抗体是选择性诱变或回复突变或两者的结果。优选诱变导致对靶标的 亲和力更大，和/或与亲代抗体相比对非靶标结构的亲和力更小。
术语"嵌合抗体"是指含有得自 一个物种的重链和轻链可变区序 列以及得自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连 接的鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语"CDR移植抗体"是指包含得自 一个物种的重链和轻链可变 区序列^f旦其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另一物种 的CDR序列置换的抗体，例如具有鼠重链和轻链可变区的抗体，该 抗体中一个或多个鼠CDR(例如CDR3)被人CDR序列置换。
术语"人源化抗体"是指含有得自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、 雏鸡、骆驼、绵羊或山羊)重链和轻链可变区的序列，但该序列中至少 一部分的VH和/或VL序列已改变，使得更为"类似于人"的抗体，即 与人种系的可变序列更相似。人源化抗体的一个类型是CDR移植抗 体，其中人CDR序列被插入非人类VH和VL序列以置换相应的非人 类CDR序列。
36本文中术语"Kabat编号方式"、"Kabat定义"和"Kabat标记"互换 使用。这些本领域公认的术语，是指为比抗体重链和轻链可变区或其 抗原结合部分中的其它氨基酸残基更为可变(例如超变)的氨基酸残基 编号的系统(Kabat等(1971) 4w打.M^ca《190:382-391和Kabat， E. A.等(1991) Se《Me"cay 尸roZe/"5 7mmw"o/og7'ca/ /"femy" 第五版, 美国卫生和福利部，NIH出版号91-3242)。
本文所用术语"接纳体(acceptor)"和"接纳体抗体(acceptor antibody)"是指提供或编码一个或多个构架区的至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少98%或100%的氨基酸序列的抗体或核酸 序列。在一些实施方案中，术语"接纳体"是指提供或编码一个或多个 恒定区的抗体氨基酸序列或核酸序列。在又一个实施方案中，术语"接 纳体"是指提供或编码一个或多个构架区和一个或多个恒定区的抗体 氨基酸序列或核酸序列。在具体的实施方案中，术语"接纳体"是指提 供或编码一个或多个构架区的至少80%、优选至少85%、至少90%、 至少95%、至少98%或100%的氨基@吏序列的人抗体氨基酸序列或核 酸序列。按照这个实施方案，接纳体可含有至少l个、至少2个、至 少3个、至少4个、至少5个或至少10个不出现在人抗体一个或多 个特定位置上的氨基酸残基。接纳体构架区和/或接纳体恒定区可以例 如衍生自或得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能性抗体(例如本领 域众所周知的抗体、开发中的抗体或市售抗体)。
本文所用术语"CDR"是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链 和轻链的每一个可变区中有3个CDR，在每个可变区中#:标注为 CDR1、 CDR2和CDR3。本文所用术语"CDR组(CDR set)"是指存在于 能够结合抗原的单个可变区的为一组的3个CDR。这些CDR的确切 界限根据系统不同而界定不同。由Kabat描述的系统(Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest美国国立卫生研究院 (National Institutes of Health), Bethesda， MD (1987)和(1991))不仅提供 适用于抗体任何可变区的明确的残基编号系统，而且还提供界定3个CDR的准确的残基界线。这些CDR可称为Kabat CDR。 Chothia及同 事(Chothia和Lesk， J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)和Chothia等， Nature 342:877-883 (1989))发现Kabat CDR内的某些亚部分采用几乎 相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上有相当大的差异。这些 亚部分被称为LI 、 L2和L3或HI 、 H2和H3，其中"L，，和"H，，分别表 示轻链区和重链区。这些区可称为Chothia CDR，具有与Kabat CDR 重叠的界线。Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995))和MacCallum (J Mol Biol 262 (5):732-45(1996))披露了界定与Kabat CDR重叠的CDR的其 它界线。另外其它的CDR界线界定可能没有严格遵照上述系统之一， 但虽然如此却仍与Kabat CDR重叠，尽管根据特定残基或残基组或甚 至整个CDR不会严重影响抗原结合的预测或实验结果可以被缩短或 延长。本文所用方法可利用根据任何这类系统界定的CDR，尽管优选 的实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。本文所用术语"规范"残基是指按照Chothia等人的界定，界定特 定规范CDR结构的CDR或构架中的残基(Chothia等，J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia等，J. Mol. Biol. 227:799 (1992))。按照 Chothia等人，许多抗体CDR的关键部分具有几乎相同的肽骨架构象， 尽管在氨基酸序列水平上有很大的差异。各规范结构主要确定了形成 环的氨基酸残基邻接区段的一组肽主链扭角。本文所用术语"供体(donor)"和"供体抗体(donor antibody)"是指提 供一个或多个CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，供体抗体是 来自某物种的抗体，该抗体不同于从中获得或衍生构架区的抗体。在 人源化抗体的情况下，术语"供体抗体"是指提供一个或多个CDR的非 人抗体。本文所用术语"构架"或"构架序列"是指可变区减去CDR的剩余 序列。因为CDR序列的准确界定可以用不同的系统确定，因此构架 序列的含义相应可以有不同的解释。六个CDR (轻链的CDR-Ll、 CDR-L2和CDR-L3和重链的CDR-H1、 CDR-H2和CDR-H3)还将每38条链的轻链和重链上的构架区分成4个亚区(FR1 、 FR2、 FR3和FR4)， 其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，CDR3 位于FR3和FR4之间。当提及构架区时，如果未指定如FR1、 FR2、 FR3或FR4等具体亚区，则是表示单条天然存在的免疫球蛋白链可变 区内组合的FR。本文所用FR表示4个亚区之一，多个FR表示构成 构架区的4个亚区中的两个或更多个。人重链和轻链接纳体序列为本 领域所知。本文所用术语"种系抗体基因"或"基因片段"是指由非淋巴细胞所 编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴细胞还未经历导致特定免疫球蛋 白表达的基因重排和突变的成熟过程(参见例如Shapiro等，Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis等，Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001))。由本发明不同实施方案提供的优势之一出于这样发 现，即种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保存物种中个体的本质氨 基酸序列结构特征，因此当在该物种中使用时被视为非自身的可能性 更低。本文所用术语"关键"残基是指对抗体、特别是人源化抗体的结合 特异性和/或亲和力具有较大影响的可变区内的某些残基。关键残基包 括但不限于一个或多个以下的残基邻接CDR的残基、潜在的糖基 化位点(可为N-糖基化位点或O-糖基化位点)、稀有残基、能够与抗原 相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、规范残基、重链可 变区与轻链可变区之间的接触残基、Vernier区内的残基和在Chothia 定义的可变重链CDR1与Kabat定义的第一重《连构架之间重叠的区域 中的残基。本文所用术语"人源化抗体"具体地讲是指免疫专一性结合目标 抗原并包含基本为人抗体氨基酸序列的构架(FR)区和基本为非人抗体 氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体或其变体、衍生物、类似物或 片段。在CDR的情况下，本文所用术语"基本上"是指CDR的氨基酸 序列与非人抗体CDR氨基酸序列有至少80%、优选至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性。人源化抗体基本上包 含所有的至少一个、通常两个可变结构域(Fab、 Fab'、 F(ab')2、 FabC、 Fv)，其中所有或基本上所有CDR区相当于非人类免疫球蛋白(即供体 抗体)的CDR区，所有或基本上所有构架区是人免疫球蛋白共有序列 的构架区。优选人源化抗体还包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区 (Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。在一些实施方案中，人源化抗 体含有轻链和至少重链的可变结构域。该抗体还可包括重链的CH1 区、绞链区、CH2区、CH3区和CH4区。在一些实施方案中，人源 化抗体只含有人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体只含有人 源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体只含有人源化轻链可变结 构域和/或人源化重链。人源化抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白， 包括IgM、 IgG、 IgD、 IgA和IgE，以及任何亚类，包括但不限于IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4。人源化抗体的构架区和CDR区不需要与亲代序 列的完全一致，例如，供体抗体CDR或共有构架可通过取代、插入 和/或缺失至少一个氨基酸残基来诱变，使得在该位点的CDR或构架 残基不与供体抗体或共有构架完全一致。然而，在一个优选的实施方 案中，这类突变并不广泛。通常至少80%、优选至少85%、更优选至 少90%、最优选至少95Q/。的人源化抗体残基可与亲代FR和CDR序列 的相一致。本文所用术语"共有构架("consensus framework)"是指共有 免疫球蛋白序列中的构架区。本文所用术语"共有免疫球蛋白序列 (consensus immunoglobulin sequence)"是指在才目关免疫J求蛋白序歹寸家 族中，由出现最频繁的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如 Winnaker, Winnaker， From Genes to Clones, Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的各个 位置由该家族中在该位置上出现最频繁的氨基酸占据。如果两个氨基 酸出现频率相等，则任一个都包括在共有序列中。本文所用"Vernier"区是指调整CDR结构并微调以配合抗原的一 小组构架区残基，参见Foote和Winter (1992， J. Mol. Biol.224:487-499)。 Vernier区残基形成位于CDR之下的层，可对CDR的 结构和抗体的亲和力产生影响。术语"表位"包括能够特异性结合免疫球蛋白的任何多肽决定簇 (polypeptide determinants在某些实施方案中，表位决定簇包括化学活 性表面成群的分子，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在 某些实施方案中，可具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。 表位是抗体结合抗原的区域。在某些实施方案中，在蛋白质和/或大分 子的复杂混合物中，当抗体优先识别其靶抗原时，则该抗体被称为与 抗原特异性结合。本文所提及的术语"多核苷酸"是指两个或更多个核苷酸的聚合 形式，核苷酸或为核糖核苷酸，或为脱氧核苷酸，或为任一种核苷酸 类型的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA,但优选为双链 DNA。本文所用术语"分离多核苷酸"可指多核苷酸(例如基因组、cDNA 或合成源(syntheticorigin)或其任何组合的多核苷酸)，由于其来源，"分 离多核苷酸"不与随"分离多核苷酸"一起在天然中存在的多核苷酸的 所有或部分締合；可与在天然情况下不连接的多核苷酸有效连接；或者在天然情况下不作为较大序列的组成部分存在。本文所用术语"载体"是指能够转运与之连接的另一核酸的核酸 分子。 一种载体类型为"质粒"，它是指其中可以连接另外DNA区段 的环状双链DNA。另一种载体类型是病毒载体，其中另外的DNA区 段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞 中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载 体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时可以整 合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组一起复制。另外，某些 载体能够指导与之有效连接的基因表达。这类载体在本文称为"重组表 达载体"(或简单称为"表达载体，，)。 一般而言，表达载体通常以质粒形 式应用于重组DNA技术中。在本说明书中，"质粒"和"载体"可互换使载体形式。然而，本发明还包括其它形式的 发挥相同功能作用的表达栽体，例如病毒载体(例如复制缺陷型反转录 病毒、腺病毒和腺伴随病毒载体)。术语"有效连接"是指并列(juxtaposition),其中各组分处于允许它 们按其既定方式发挥功能的关系。与编码序列"有效连接"的调控序列 以这样方式连接，致使在与调控序列相适合的条件下实现编码序列的 表达。"有效连接"的序列包括与目标序列邻接的表达调控序列和起反 式作用或在远距离调控目标基因的表达调控序列。本文所用术语"表达 调控序列"是指实现其所连接的编码序列的表达和加工所必需的多核 苦酸序列。表达调控序列包括合适的转录起始序列、终止序列、启动 子序列和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸 化信号；使胞质mRNA稳定的序歹ll;提高翻译效率的序列(例如Kozak 共有序列)；提高蛋白质稳定性的序列；当需要时增加蛋白质分泌的序 列。这类调控序列的性质随宿主生物的不同而不同；在原核生物中， 这类调控序列一般包括启动子、核糖体结合4立点和转录终止序列；在 真核生物中，这类调控序列一般包括启动子和转录终止序列。术语"调 控序列，，包括其存在对于表达和加工是必需的组分，并且还可包括其存 在是有利的其它组分，例如前导序列和融合陪伴序列(ftision partner sequence) o,本文定义的"转化"是指使外源DNA进入宿主细胞的任何方法。 可在天然或人工条件下，采用本领域众所周少、口的各种方法进行转化。 转化可借助将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞中的任何已知 方法。转化方法一艮据待转化宿主细胞来选择，可包括但不限于病毒感 染、电穿孔、脂转染和粒子攻击。这类"转化的"细胞包括稳定转化的 细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的 组成部分进行复制。它们还包括在有限时间内瞬时表达插入DNA或 RNA的细月包。本文所用术语"重组宿主细胞"(或简称"宿主细胞")是指被导入外42源DNA的细胞。应当了解的是，这类术语不仅是指具体的受治疗者 的细胞，而且还指这类细胞的子代。因为由突变或环境影响所致可能 在随后的子代中出现某些修饰，因此实际上这类子代可能与亲本细胞 不同，但是仍包括在本文所用术语"宿主细胞"的范围内。优选宿主细 胞包括选自任一生物界的原核细胞和真核细胞。优选的真核细胞包括 原生生物细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞。最优选宿主细胞包 括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、 HEK 293 和COS;昆虫细胞系Sf9和真菌细胞酿酒酵母。
标准技术可应用重组DNA、寡核苷酸合成及组织培养与转化(例 如电穿孔，脂转染)中。可按照生产商的说明书或者按照本领域普遍通 用的方法实施酶促反应和纯化技术。 一般可按照本领域众所周知的常 规方法，并且按照所引用的各种普通参考文献和较为专业的参考文献 以及本说明书所论述的方法实施现有技术和方法。参见例如Sambrook 等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989))。
本文已知和本文所用的"转基因生物"是指具有含有转基因的细 胞的生物，其中导入生物(或生物的前身(ancestor))的转基因表达该生 物不会天然表达的多肽。"转基因"是一种DNA构建体，它稳定和有 效地整合到细胞基因组，由此发育出转基因生物，指导在转基因生物 的 一种或多种细胞类型或组织中表达所编码的基因产物。
制备本发明抗体的方法见下文。体内方法、体外方法或两者的组 合之间的区别也见下文。
体内方法
根据所需的抗体类型，可使用不同的宿主动物进行体内免疫。可 以使用自身表达内源形式的目标抗原的宿主。或者，可使用使内源形 式的目标抗原缺失的宿主。例如，研究显示，通过在相应的内源基因 中进行同源重组而使某些特定内源蛋白缺失的小鼠(例如敲除小鼠)对用来免疫接种小鼠的蛋白质产生体液应答，从而能够用来产生抗该蛋
白质的高亲和力的单克隆抗体(参见例如Roes， J.等(1995)/ /mmimo/. M"Aods 183:231-237; Lunn， M. P.等(2000)/, A^wrac/ em, 75:404-412)。
多种非人类的哺乳动物是产生抗体的合适宿主，以便产生本发明 的非人抗体。它们包括例如小鼠、大鼠、雏鸡、骆驼、兔、绵羊和山 羊(及其敲除形式)，尽管优先选择小鼠以产生杂交瘤。此外，可使用 表达人抗体库的非人类宿主动物以产生基本上是针对人抗原的人抗 体，该抗体具有双重特异性。这种非人类动物包括携带人免疫球蛋白 转基因(嵌合hu-PBMC SCID小鼠)和人/小鼠辐照嵌合体(irradiation chimera)的转基因动物(例如小鼠)，下面将有更详细的描述。
按照一个实施方案，被免疫的动物为非人类哺乳动物，优选小鼠， 其为通itA免疫球蛋白基因所产生的转基因小鼠，因而所述非人类哺 乳动物在抗原刺激时产生人抗体。通常将具有人种系构型的免疫球蛋 白重链和轻链的转基因导入发生了改变使得它们的内源重链和轻链 基因座失活的这类动物中。如果这类动物用抗原(例如人抗原)刺激， 便产生来源于人免疫球蛋白序列的抗体(人抗体)。可通过标准化杂交 瘤技术，由这类动物的淋巴细胞产生人单克隆抗体。有关具有人免疫 球蛋白的转基因小鼠及其在制备人抗体中的应用的更多描述，可参见 例如美国专利号5，939，598、 WO 96/33735、 WO 96/34096、 WO 98/24893 和WO 99/53049 (Abgenix Inc.)和美国专利号5,545,806、美国专利号 5,569,825、美国专利号5,625,126、美国专利号5,633,425、美国专利 号5,661,016、美国专利号5,770,429、美国专利号5,814,318、美国专 利号5,877,397和WO 99/45962 (Ge叩harm Inc.);另可参见MacQuitty, J丄和Kay， R. M. (1992) &&"ce 257:1188; Taylor, L. D.等(1992) M/c/e/c 爿"A 20:6287-6295; Lonberg, N.等(1994) iV^"^ 368:856-859; Lonberg，N.和Huszar, D. (1995) M Aev. /mmi/wo/. 13:65-93; Harding, F. A.和Lonberg, N. (1995) Aw". K764:536-546; Fishwild, D. M.等(1996) M^w"说o&c/mo/ogy 14:845-851; Mendez, M. J.等(1997)A/a&re Gewe"cs 15:146-156; Green, L. L.牙口 Jakobovits, A. (1998);乂五xp.
188:483-495; Green, L. L. (1999) / /wmw"o/. MeAoA 231:11-23; Yang, X. D.等(1999) 丄e^oc所o/. 66:401-410; Gallo, M. L.等(2000) / /mmimo/. 30:534-540。
按照另一个实施方案，被免疫的动物可为患有严重联合免疫缺陷 (SCID)的小鼠，该小鼠用人外周单核血细胞或淋巴细胞或其祖细胞重 建。已经证实这类被称为嵌合hu-PBMCSCID小鼠的小鼠在响应抗原 刺激时产生人免疫球蛋白。有关这些小鼠及其产生抗体的应用的更多 描述，可参见例如Leader, K. A.等(1992) /mm簡o/ogy 76:229-234; Bombil， F.等(1996)/mmw"o&o/. 195:360-375; Murphy， W丄等(1996) iSe/w'". /wmtmo/. 8:233-241; Herz， U.等(1997)/"A J/r/ .爿〃ergy 7mwnmo/. 113:150-152; Albert, S. E.等(1997)丄/wmwwo/. 159:1393-1403; Nguyen, H.等(1997) Mzcro&o/. /附wwzo/. 41:901-907; Arai, K.等(1998) /^wwwo/. Af"/zoA 217:79-85; Yoshinari，K.和Ami, K. (1998) Z/j^nWoma 17:41-45; Hutchins, W. A.等(1999)/^6nV/owa 18:121-129; Murphy, W丄 等(1999) C"w. /画,/. 90:22-27; Smithson， S. L.等(1999) Mo/. /wwwwo/. 36:113-124 ; Chamat, S.等(1999) /w/e". Ifeeas&y 180:268-277;以及Heard, C.等(1999) Mo/ec. 5:35-45。
按照另 一个实施方案，被免疫的动物是用致死剂量的全身辐照处 理，然后用患有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠骨髓细胞保护以抵抗 辐照，接着移植了人功能性淋巴细胞的小鼠。可使用此类型的嵌合体 (称为Trimem系统)以产生人单克隆抗体，即通过用目标抗原使所述小 鼠免疫，然后通过标准化杂交瘤技术产生单克隆抗体。有关这些小鼠 及其产生抗体的应用的更多描述，可参见例如Eren, R.等(1998) /mmimo/ogK 93:154-161; Reisner， Y和Dagan， S. (1998) 7Ve"心 '说otec/mo/. 16:242-246; Ilan， E.等(1999)//印ato/ogy 29:553-562;以及 Bocher， W.O.等(1999)/mm柳o/ogy 96:634-641。
可通过标准化技术，例如最初由Kohler和Milstein披露的杂交瘤
45技术(1975, A/a/w" 256:495-497)，从体内产生的抗体生成细胞开始， 以产生单克隆抗体(另见Brown等(1981) / /Awm/"o/127:539-46; Brown 等(1980)J历o/CAew 255:4980-83; Yeh等(1976) iWJS76:2927-31;以 及Yeh等(1982)/W./ Owcw29:269-75)。制备单克隆抗体杂交瘤的技 术是众所周知的(一4殳参见R. H争Kenneth, A/o"oc/o""/」"^ ocfes: ^ 7Vevv Z)/weww'o/2 /" 5z.o/og7'ca/ Jwa/7jes, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) / Mo/.， 54:387-402; M. L. Gefter等(1977) 5bm加'c Ce〃 Ge"",， 3:231-36)。简 单地讲，无限增殖化细胞系(通常为骨髓瘤)与用本发明的Ap球聚体或
外周血淋巴细胞)融合，对所得杂交瘤细胞的培养物上清液进行筛选， 以鉴定出产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。任何用于淋巴细胞和无 限增殖化细胞系融合的多种众所周知的方案都可用于此目的(另见G. Galfre等(1977)A^wre 266:550-52; Gefter等，5"ow加'c Ce〃 ,引 用处同上；Lerner， 7a/e丄5Zo/. Afct/.,引用处同上；Kenneth, 7V/o"oc/o"a/ 爿"Wo^M,引用处同上)。另外，技术人员要了解的是，这类方法有 各种同样有益的变化。通常无限增殖化细胞系(例如骨髓瘤细胞系)与 淋巴细胞来源于相同的哺乳动物物种。例如，可以通过使得自用本发 明免疫原性制备物免疫的小鼠淋巴细胞与无限增殖化小鼠细胞系融 合来建立鼠杂交瘤。优选的无限增殖化细胞系是对含有次黄嘌呤、氨 基蝶呤和胸苷的培养基(HAT培养基)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。在没 有融合配偶体时，多个骨髓瘤细胞系的任一种可用作融合配偶体，例 如P3-NSl/l-Ag4-l， P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Ag14骨髓瘤系。这些 骨髓瘤细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC), Manassas, Virginia。通常使用聚乙二醇(PEG)，使HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞与 小鼠脾细胞融合。然后使用HAT培养基，选出融合所得的杂交瘤细 胞，从而杀死未融合和无产物产出的融合骨髓瘤细胞(几天后，未融合 的脾细胞因为没有转化而死亡)。通过根据这类抗体对杂交瘤培养物上清液进行筛选，鉴定出产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞，例如采 用斑点印迹测定法以选出具有如上定义的结合亲和力的抗体。单克隆
抗体10F4和3C5均采用上述体内方法产生，这类抗体获自如本文定 义的杂交瘤。
同样，所述杂交瘤可用作编码轻链和/或重链核酸的来源，以便重 组产生本发明的抗体，更多详情见下文。
体外方法
作为通过免疫和筛选以产生本发明抗体的替代方法，可通过筛选 重组组合的免疫球蛋白文库来鉴定和分离本发明的抗体，从而分离出 具有所需结合亲和力的免疫球蛋白文库成员。用于产生和筛选展示文 库的试剂盒是市售的(例如Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号 27-9400-01;以及Stratagene SurfZAP⑧噬菌体展示试剂盒，目录号 240612)。在许多实施方案中，展示文库是scFv文库或Fab文库。已 大量记载用于筛了选重组抗体文库的噬菌体展示技术。对于产生和筛 选抗体展示文库，使用起来特别有利的方法和化合物的实例可参见例 如McCafferty等，WO 92/01047、 US 5,969,108和EP 589 877 (具体描 述了 scFv展示);Ladner等,美国专利号5,223,409、美国专利号 5,403,484、美国专利号5,571,698、美国专利号5,837,500和EP 436 597 (例如描述了 pill融合物，);Dower等WO 91/17271、美国专利号 5,427,908、美国专利号5,580,717和EP 527 839 (具体描述了 Fab展示)； Winter等，国际公布号WO 92/20791和EP 368,684 (具体描述了用于 可变免疫球蛋白结构域序列的克隆)；Griffiths等，美国专利号 5,885,793和EP 589 877 (具体描述了使用重组文库分离人抗体与人抗 原)；Garrard等，WO 92/09690 (具体描述了噬菌体表达技术)；Knappik 等，WO 97/08320 (描述了人重组抗体文库HuCal); Salfeld等，WO 97/29131 (描述了抗人抗原的重组人抗体的产生(人肿瘤坏死因子a)及 重组抗体的体外亲和力成熟)以及Salfeld等，美国临时专利申请号60/126，603和在此基础上的专利申请(同样描述了针对人抗原(人白介素-12)的重组人抗体的产生及重组抗体的体外亲和力成熟)。
有关重组抗体文库筛选的进一 步描述可参见学术出版物，例如Fuchs等(1991)所o/rec/mo/ogy 9:1370匿1372; Hay等(1992) //ww ^w幼oc///;^^omfiw 3:81醫85; Huse等(1989) S"e"ce 246:1275-1281; Griffiths等(1993)五M50 / 12:725-734 ; Hawkins等(1992) / Mo/说o/226:889-896; Clarkson等(1991) A/a/we 352:624-628; Gram等(1992)/WAS 89:3576-3580; Garrard等(1991)祝o/Tec/mo/ogy 9:1373-1377;Hoogenboom等(1991) 7Vmc A&s 19:4133-4137; Barbas等(1991)/WylS 88:7978-7982; McCafferty等iVa,we (1990) 348:552-554;以及Knappik等(2000) Mo/. Ao/. 296:57-86。
作为使用噬菌体展示系统的替代方法，重组抗体文库可在酵母细胞表面或细菌细胞表面表达。WO 99/36569披露了在酵母细胞表面表达的文库的制备和筛选方法。WO 98/49286更详尽地描述了在细菌细胞表面表达的文库的制备和筛选方法。在所有体外方法中，富含具有所需性质的重组抗体的筛选方法构成本发明方法的完整部分，该方法一般被称为"淘选"，并且通常采取亲和柱层析的形式，靶标结构连接在该柱的基质上。然后优选通过标准化斑点印迹测定法，对有希望的候选分子进行个别鉴定，以确定其绝对亲和力和/或相对亲和力。
一旦对组合文库的目标抗体进行了鉴定和充分地表征，便可通过标准化分子生物学技术分离出编码所述抗体轻链和重链的DNA序列，例如通过对在文库筛选期间分离出的展示包(display package)(例如噬菌体)的DNA进行PCR扩增。本领域普通技术人员了解可用来制备PCR引物的抗体轻链和重链基因的核苷酸序列。多种这类的序列可参见如H口Kabat， E. A.等(1991) Se《wewces o/ /Vo&//is o/ /附/m/wo/og/ca//"tems,，第五版，美国卫生和福利部，NIH出版号91-3242和人种系VBASE序列数据库。
可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链的基因，来
48体，用一个或多个重组表达载体转染宿主细胞，所述载体携带编码所述抗体的免疫球蛋白
轻链和重链的DNA片段，从而在宿主细胞中表达轻链和重链，并优选它们被分泌到培养所述宿主细胞的培养基内。可从该培养基中分离出抗体。应用标准化重组DNA方法以获得抗体重链和轻链的基因，将所述基因插入重组表达载体中，将所述载体导入宿主细胞。这类方法可参见例如Sambrook、Fritsch和Maniatis (主编)，A/o/ecw/ar C7om,wgv爿丄aZ orato/j Ma肌a/,第二版，Cold Spring Harbor, N. Y., (1989),Ausubel, F. M.等(主编)CM/Tewf尸ratoco/s Mo/ecw/ar 5!'o/ogy， GreenePublishing Associates, (1989)和Boss等，US 4，816，397。
一旦获得编码目标抗体VH和VL区段的DNA片段，便可应用例如标准化重组DNA技术进一步操纵所述DNA片段，以使可变区基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。这些操纵包括将编码VL的DNA片段或编码VH的DNA片段与编码另 一蛋白质的另一DNA片段有效连接，例如抗体恒定区或柔性接头。术语"有效连接，，在本文的含义应理解为2个DNA片段以这样的方式连接，即由所述2个DNA片段编码的氨基酸序列保留在读框内。可通过将编码VH区的DNA与另一个编码重链恒定区(CH1、 CH2和CH3)的DNA分子有效连接，将编码VH区的分离DNA转化为全长重链的基因。人重链恒定区基因的序列是众所周知的(参见例如Kabat， E. A.等(1991)5"e《wewces o/ZVo/e/ws o//m wwo/og7'ca//"/emst 第五片反,美国卫生和福利部，NIH出版号91-3242),可通过标准化PCR扩增获得淘选所述区的DNA片段。重链恒定区可以是得自IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、IgM、 IgA、 IgE或IgD的恒定区，优先选择得自IgG的恒定区，特别是得自IgGl或lgG4的恒定区。为了获得重链Fab片段的基因，可将编码VH的DNA与仅编码重链恒定区CHI的另一个DNA分子有效连接。可通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另 一个DNA分子有效连接，将编码VL区的分离DNA转化成全长轻链的基因(和Fab轻链的基因)。人轻链恒定区基因的序列是众所周知的(参见Kabat,E. A.等(1991) Se《we/ ces o/TVotoTw o/7mwMwo/og7'cfl//",ems/， 第五版,美国卫生和福利部，NIH出版号91-3242)，可通过标准化PCR扩增获得DNA片4史淘选所述区(DNA fragment spanning said region)。轻链恒
定区可以是K区或X区，优选为K恒定区。
为了产生scFv基因，可将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头(例如氨基酉饼列(Gly4-Ser)3)的另 一片段有效连接，以使VH和VL序列表达成连续的单链蛋白，其中通过所述柔性接头VL和VH区彼此连接在一起(参见Bird等(198S) 5We"ce 242:423-426; Huston等(1988)尸rac. A/a".爿cm/. 85:5879-5883; McCafferty等，TVa似w
(1990) 348:552-554)。
可通过上述方法，将如上所述的具有结合亲和力的单结构域VH和VL从单结构域文库中分离出来。具有所需结合亲和力的二 VH单结构域链(含或不含CH1)或二 VL链或一 VH链和一 VL链的一对，可按照本文所述用作本发明的抗体。
为了表达本发明的重组抗体或抗体部分，可将编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体，以便使基因与合适的转录和翻译调控序列有效连接。在这种情况下，术语"有效连接"应理解为是指抗体基因在载体中以这样的方式连接，以便使载体内的转录和翻译调控序列实现既定的调节所述抗体基因转录和翻译的功能。适当选择表达载体和表达调控序列，以便与所使用的表达宿主细胞相适合。可将抗体轻链的基因和抗体重链的基因插入单独的载体中，或者将两种基因插入同一表达载体，这是常用的情况。通过标准化方法，将抗体基因插入表达载体(例如通过将抗体基因片段和载体上的互补限制切割位点连接，或者如果不存在限制切割位点，则通过平端连接)。在插入轻链和重链序列之前，表达载体可能已携带了抗体恒定区的序列。例如，一种方法是，通过将VH和VL序列插入已具有分别编码重链和轻链恒定区的表达载体中，使VH和VL序列转化为全长抗体基因，从而
50使载体内的VH区段与一个或多个CH区段有效连接，同时使载体内的VL区段与CL区段有效连接。
又或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将所述抗体链的基因克隆至载体，从而使信号肽在读框中与抗体链基因的N端连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(例如来自非免疫球蛋白的信号肽)。除抗体链基因以外，本发明的表达载体可具有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。
术语"调节序列"是指包括启动子、增强子和控制抗体链基因的转录或翻译的其它表达调节元件(例如聚腺苷酸化信号)。这种调节序列可参见例J(口 Goeddel; 五xpr&s57'ow rec/mo/ogy.' Zw
五"27mo/ogy 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)。 4支术人员要了解的是，包括选择调节序列的表达载体的设计可取决于例如待转化宿主细胞的选择、所需蛋白质表达的强度等因素。用于在哺乳动物宿主
蛋白质表达的病毒元件，例如来源于以下病毒的启动子和/或增强子巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿病毒40 (SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。有关病毒调节元件及其序列的进一步描述可参见例如Stinski的美国专利号5，168，062、 BeU等人的美国专利号4，510，245和Schaffher等人的美国专利号4,968,615。
除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可具有其它序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有利于选出已导入载体的宿主细胞(参见例如Axel等人的美国专利号4,399,216、 4,634,665和5,179,017)。例如，常用的选择标记基因为已插入载体的宿主细胞提供细胞毒药物(例如G418、潮霉素或曱氨蝶呤)抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因(用于用曱氨蝶呤筛选/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418筛选)。对于轻链和重链的表达，可通过标准化技术，使编码所述重链和 轻链的一个或多个表达载体转染至宿主细胞。术语"转染"的各种形式
包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的各种技术，例如 电穿孔、磷酸钩沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上可以在原核 或真核宿主细胞内表达本发明的抗体，但优选在真核细胞内、特别是 在哺乳动物宿主细胞内表达抗体，因为在这类真核细胞内，特别是哺 乳动物细胞内，正确折叠及装配和分泌具有免疫活性抗体的概率都比 原核细胞的高。据报道，对于高产量活性抗体的生产，抗体基因的原 核表达是无效的(Boss, M. A.和Wood， CR. (1985) //wm/"o/ogy 7bc/a;; 6:12-13)。
用于表达本发明重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括CHO 细胞(包括dhff CHO细胞，参见Urlaub和Cheasin， (1980)尸rac. A^//. 」cat/.5W. 77:4216-4220，该细胞与DHFR选择标记一起使用，参 见例如R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mo/.说o/. 159:601-621)、NS0 骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载 体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞直到在所述宿主细胞 内表达抗体，或者优选抗体被分泌到宿主细胞生长的培养基内，来产 生抗体。然后可通过应用标准化蛋白质纯化方法，从培养基中分离出 抗体。同样可使用宿主细胞以产生完整抗体的部分，例如Fab片段或 scFv分子。本发明当然也包括上述方法的变通方法。例如，可能需要 用编码本发明抗体轻链或重链中的任一个(但非两者)的DNA转染宿 主细胞。如果存在不需要用于结合目标抗原的轻链，或者存在不需要 用于结合靶抗原的重链，则可以通过重组DNA技术，部分或完全除 去编码该条轻链或该条重《连或者两条链的DNA。由如此截短的DNA 分子表达的分子同样也包括在本发明的抗体中。另外，可以通过标准 化化学方法，通过将本发明抗体与第二抗体交联来产生双功能抗体， 其中 一条重链和一条轻链为本发明的抗体，另 一重链和另 一轻链则对 不同于目标抗原的抗原具有特异性。在用于重组表达本发明抗体或其抗原结合部分的一个优选系统 中，通过磷酸钩介导的转染，将同时编码抗体重链和抗体轻链的重组
表达载体导入dhff CHO细胞。在重组表达载体内，抗体重链和轻链 的基因在所有情况下都与调节CMV增强子/AdMLP启动子元件有效 连接，以便实现所述基因的强转录。重组表达载体还携带DHFR基因， 它可以用来通过应用曱氨蝶呤筛选/扩增，选出转染有载体的dhfr-CHO细胞。对所选出的转化宿主细胞进行培养，使抗体重链和轻链得 以表达，并从培养基中分离出完整抗体。应用标准化分子生物学技术 来制备重组表达载体，以转染宿主细胞，筛选转化子，培养所述宿主 细胞，并从培养基中获得抗体。因此，本发明涉及合成本发明重组抗 体的方法，该方法通过将本发明的宿主细胞在合适的培养基中培养直 到合成出本发明的重组抗体。该方法还包括从所述培养基中分离出所 述重组抗体。
作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代方法，可以采用本 领域技术工作人员已知的其它方法筛选大型组合文库以鉴定出本发 明的抗体。基本上可以采用任何这样的表达系统，即其中核酸与由其 编码的抗体之间建立了紧密的物理连接，而且可通过它编码的抗体性 质，来筛选合适的核酸序列。在一类替代表达系统中，重组抗体文库 以RNA-蛋白融合物的形式表达，参见Szostak和Roberts的WO 98/31700,以及Roberts, R. W.和Szostak, J. W. (1997)尸rac. A/fl".爿cat/.
[75^ 94:12297-12302。在该系统中，3'端携带噪罗霉素(一种肽基接 纳体抗生素)的合成mRNA在体外翻译后，产生了 mRNA与由之编码 的肽或蛋白质的共价融合物。因此，多种mRNA(例如组合文库)复杂 混合物中的特定mRNA可根据所编码的肽或蛋白质(例如抗体或其部 分的肽或蛋白质)的性质(例如所述抗体或其所述部分与A(3( 12-42)球 聚体或其衍生物的结合)而得以集中。编码抗体或其部分的核酸序列以 及通过筛选所述文库获得的核酸序列，可按上述方式(例如在哺乳动物 宿主细胞内)通过重组方式进行表达，或者另外可通过对mRNA-肽融合物进行更多轮的筛选，将突变引入最初选出的序列，或者按上述方 式采用重组抗体的体外亲和力成熟的其它方法，对其进行进一步的亲 和力成熟。
体内方法和体外方法的组合
这样的方法，其中先使Ap(12-42)球聚体或其衍生物在宿主动物体内 作用于抗体库以刺激Ap(12-42)球聚体或衍生物-结合抗体的产生，然 后借助一种或多种体外技术实现进一步的抗体筛选和/或抗体成熟(即 最优化)。按照一个实施方案，这类联合方法可包括首先用所述 A卩(12-42)球聚体或其衍生物使非人类动物(例如小鼠、大鼠、兔、雏 鸡、骆驼、绵羊或山羊或其转基因形式或嵌合小鼠)免疫以刺激响应抗 原的抗体，然后通过使用因所述Ap(12-42)球聚体或衍生物的作用而 在体内受刺激的淋巴细胞的免疫球蛋白序列，制备和筛选噬菌体展示 抗体文库。该联合方法的第一步可按上述方式结合体内方法进行，而 该方法的第二步可按上述方式结合体外方法进行。使非人类动物超免 疫随后体外筛选由所述受刺激淋巴细胞制备的噬菌体展示文库的优 选方法包括BioSite Inc.披露的方法，参见例如WO 98/47343、 WO 91/17271、 US 5,427,908和美国专利号5,580,717。
按照另一个实施方案，联合方法包括首先用本发明的A|3(12-42) 球聚体或其衍生物使非人类动物(例如小鼠、大鼠、兔、雏鸡、骆驼、 绵羊、山羊或敲除和/或其转基因形式或嵌合小鼠)免疫以刺激响应所 述A(3(12-42)球聚体或其衍生物的抗体，通过筛选杂交瘤(例如由免疫 动物制备)选出产生具有所需特异性的抗体的淋巴细胞。由选出的克隆 分离出来的抗体或单结构域抗体的基因(通过标准化克隆方法，例如逆 转录酶-聚合酶链式反应)，并进行体外亲和力成熟，从而改进一个或 多个选出抗体的结合性质。该方法的第 一步可按上式方式结合体内方 法进行，而该方法第二步可按上述方式结合体外方法，特别是通过用体外亲和力成熟方法进行，例如参见WO 97/29131和WO 00/56772。 在又一个联合方法中，通过使用本领域技术人员已知的作为筛选 淋巴细胞抗体方法(SLAM)的方法，由各个分离的淋巴细胞产生重组抗 体，可参见US 5,627,052、 WO 92/02551和Babcock， J. S.等(1996)尸rac. Mz" v4cad. 93:7843-7848。在该方法中，首先用A(3(12-42)球
聚体或其衍生物在体内使非人类动物(例如小鼠、大鼠、兔、雏鸡、骆 驼、绵羊、山羊或其转基因形式或嵌合小鼠)免疫以刺激针对所述寡聚 体或衍生物的免疫应答，然后通过用抗原特异性溶血斑测定法选出分 泌目标抗体的各个细胞。为此，可使用接头(例如生物素)使球聚体或
其衍生物或结构相关的目标分子与绵羊红细胞偶联，从而可通过采用
溶血斑测定法，鉴定具有适当特异性的分泌抗体的各个细胞。在鉴定
出分泌目标抗体的细胞后，通过反转录酶PCR从细胞中获得轻链和重
链可变区的cDNA，然后，可使所述可变区可与合适的免疫球蛋白恒
定区(例如人恒定区)联合在哺乳动物宿主细胞(例如COS或CHO细胞)
内表达。然后，可对转染有得自体内选出的淋巴细胞所扩增的免疫球
蛋白序列的宿主细胞作进一步的体外分析及体外筛选，例如通过扩增
(spread out)转染细胞以分离出表达具有结合亲和力的抗体的细胞。此
外还可对扩增的免疫球蛋白序列进行体外操纵。
可通过进行基本上如上所述的斑点印迹法选出本文定义的具有
所需的亲和力的抗体。简单地讲，将抗原与固体基质连接，优选按系 列稀释点样到硝化纤维素膜上。然后使固定化抗原与目标抗体接触
后，通过酶缀合的第二抗体和比色反应对后者进行检测；在规定的抗 体和抗原浓度下，抗体结合的量使得能够测定出亲和力大小。因此两 个不同抗体对一个靶标的相对亲和力，或者一个抗体对两个不同靶标 的相对亲和力，在此定义为在其他方面相同的斑点印迹条件下，用两 种抗体-扭标组合观察到的与靶标结合的抗体相应量的关系。与单克隆 抗体10F4或3C5结合相同表位的抗体可按领域已知方式获得。
与如上所述抗体可进行竟争同理，如果靶结构中的至少一个能够特异性降低另 一个结构的可测量结合，优选通过提供重叠表位或相同 表位，更优选为相同表位，则本文把这些不同的靶结构称为"竟争"特
定的抗体。凭借抗体对这类靶结构的相对亲和力，可将对靶实体(target entities)的竟争用于直接筛选抗体。因此相对亲和力可通过用竟争实验 来直接测定，其中使可分辨形式的竟争实体(例如作了不同标记的竟争 结构)与目标抗体接触，由与抗体结合的这些实体的相对量推导出的抗
体对这些实体中的每一个的相对亲和力。可通过将需要对其亲和力较 大的实体与固体基质支持体连接，并将适当量的、优选摩尔浓度过量
的需要对其亲和力较小的竟争实体加入介质中，利用这类竟争直接富 集对靶实体具有所需相对亲和力的抗体。因此，展现所需相对亲和力
的抗体比其它抗体往往与基质的结合更坚固，并可在洗去不太需要的
形式后获得，例如通过在低盐浓度下洗涤后，使用高盐浓度使其与靶
标可逆地分离来收集被结合的抗体。若有需要，可进行若干轮富集。
在本发明的一个具体的实施方案中，其中抗体的基因型与该抗体物理
连接，例如，在杂交瘤或展示抗原的噬菌体或酵母细胞的集合体中，
可拯救相应的基因型。
在本发明的另一个实施方案中，使用改进的斑点印迹法，其中固 定化抗原与用于抗体结合的溶解实体(solved entity)竟争，以便可以从 结合固定化抗原的百分比中推导出抗体的相对亲和力。可以采用常规 技术，例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，从完整抗体产生抗体部分， 例如Fab和F(ab')2片^R。另外，可应用标准化重组DNA 4支术获得抗 体、抗体部分和免疫黏附分子。
本发明还涉及包含本发明抗体和任选药学上合适的载体的药物 (药物组合物)。本发明的药物组合物还含有至少一种另外的治疗药， 例如一种或多种用于治疗可用本发明抗体緩解的疾病的另外的治疗 药。例如，如果本发明的抗体与本发明的球聚体结合，则药物组合物 可另含有一种或多种另外的用于治疗其中所述球聚体的活性是重要 的疾病的治疗药。药学上合适的载体包括任何溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和吸收延緩剂等，只要它们是生 理上相容的。药学上可接受的载体包括例如水、盐水、磷酸緩冲盐溶 液、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。在许多情况下，优先选用等渗 剂，例如糖、甘露醇或山梨醇等多元醇或还有氯化钠。药学上合适的 载体此外还含有相对少量的延长抗体半寿期或增加功效的辅助物质， 例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或緩沖剂。该药物组合物可适于例如胃
肠外给药。此时，抗体优选制备成注射溶液剂，其中抗体含量为0.1-250 mg/mL。可以将注射溶液剂制成液体或冻干形式，剂型为遂石玻璃瓶 剂或小瓶剂、安瓿剂或加载注射剂(filled syringe)。緩冲剂可含有L-组氨酸(1-50 mM，优选5-10 mM), pH为5.0-7.0,优选6.0。更多合 适的緩冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾緩冲 剂。可以使用氯化钠以调节溶液的张力至0-300 mM的浓度(对于液体 剂型优选150 mM)。冻干剂型还可包括冷冻保护剂，例如蔗糖(例如 0-10%,优选0.5-1.0%)。其它合适的冷冻保护剂为海藻糖和乳糖。冻 干剂型还可包括填充剂，例如甘露醇(例如1-10%，优选2-4%)。液体 剂型和冻干剂型两者中均可使用稳定剂，例如L-曱碌u氨酸(例如51 -50 mM，优选5-10mM)。其它合适的填充剂为甘氨酸和精氨酸。还可使 用表面活性剂，例如聚山梨酯80 (例如0-0.05%，优选0.005-0.01%)。 其它表面活性剂为聚山梨酯20和BRIJ表面活性剂。
本发明的组合物可具有多种形式。包括液体剂型、半固体剂型和 固体剂型，例如液体溶液剂(例如注射溶液剂和不溶性溶液剂)、分散 剂或混悬剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于 既定给药的类型和治疗应用。通常优先选择注射溶液剂或不溶性溶液 剂形式的组合物，例如与用于人类被动免疫的其它抗体相似的组合 物。优选的给药途径为胃肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内或肌内)。 按照一个优选的实施方案，抗体以静脉内输注或静脉内注射给予。按 照另一个优选的实施方案，抗体经肌内或皮下注射给予。在制备和保 存条件下，治疗组合物通常必须是无菌和稳定的。组合物可配成溶液剂、微乳剂、分散剂、脂质体或适于高浓度活性物质的有序结构。可 通过将活性化合物(例如抗体)按需要的量掺入合适的溶剂中，需要时 与上述成分中的一种或成分组合一起掺入后，使所述溶液过滤除菌， 来制备无菌可注射溶液剂。 一般将活性化合物掺入含有基础分散介质 的无菌溶媒中，适当时掺入所需成分，来制备分散剂。在用于制备无 菌可注射溶液剂的充菌冻干粉情况下，优选的制备方法是真空干燥和 喷雾干燥，该方法产生活性成分粉末，适当时产生得自之前经过滤除 菌溶液中的其它所需成分的粉末。可通过采用例如包衣材料(例如卵磷 脂)，在分散剂的情况下通过保持所需的粒径或者通过使用表面活性 剂，来维持溶液恰当的流动性。可通过另外向组合物中掺入延緩吸收 的成分(例如一硬脂酸盐和明胶)，来延长注射组合物的吸收。
可通过本领域技术人员已知的多种方法给予本发明的抗体，尽管 对于许多治疗应用，优选的给药类型为皮下注射、静脉内注射或输注。 技术人员要了解的是，给药途径和/或类型取决于所需要的结果。按照 具体的实施方案，活性化合物可与保护化合物免于快速释放的载体一 起制备，例如緩释制剂或控释制剂，包括植入剂、透皮硬膏剂和微胶 嚢化释药系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯 乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂
的制备方法为本领域:技术人员所熟知；参见例如5kstoZ"W Qw加〃ec/ 7 e/醋e i>wg De/Zve/jJ. R. Robinson主编,Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
按照具体的实施方案，本发明的抗体可口服给予，例如溶于惰性 稀释剂或可代谢食用载体中。抗体(以及如有需要的其它成分)还可包 封在硬质或软质明胶胶嚢中、压制成片剂或者直接加到食物中。对于 口服治疗给药，抗体可与赋形剂相混合，并以口服片剂、口含片剂、 胶嚢剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂等的形式使用。如果打算通过胃肠外 途径以外的途径给予本发明的抗体，则有必要从防止抗体钝化的材料 中选出包衣材料。本发明还涉及在患有其中涉及淀粉状P蛋白以及其中所述本发明 球聚体的活性是特别重要的疾病的个体体内抑制本发明球聚体活性 的方法。所述方法包括给予个体至少一种本发明的抗体以抑制该抗体 与之结合的球聚体的活性。所述个体优选为人类。对于个人的治疗目 的，可给予本发明的抗体。另外，对于兽医目的或在特定疾病动物模 型的拒架内，可以将本发明抗体给予非人类哺乳动物。这类动物模型 可用于评价本发明抗体的治疗功效(例如测定剂量和给药时程)。
其中本发明球聚体起作用的疾病特别包括在其发生和/或发展中 涉及本发明球聚体的疾病。这类疾病是其中本发明的球聚体明显是或 者推测是造成所述疾病病理的原因，或者是促成所述疾病发生和/或发 展的因素。因此，本文包括其中抑制本发明球聚体的活性可减轻/减緩 该疾病的症状和/或发展的这些疾病。这类疾病可通过例如患有特定疾 病的个体的生物体液中本发明球聚体浓度的升高(例如在血清、血浆、
CSF、尿液等中的浓度升高)得以证实。这可通过例如利用本发明的抗 体来检测。本发明的球聚体特别是在涉及神经变性成分、认知缺陷、 神经毒成分和炎症成分的多种疾病的相关病理中起重要作用。
在本发明的另 一个方面，可以治疗或预防的疾病包括与淀粉样变 性有关的疾病。本文术语"淀粉样变性"是指以体内各种组织中特定蛋 白质的异常折叠、成群、聚集和/或积累为特征的多种疾病(淀粉状蛋 白、纤维状蛋白质及其前体)。在阿尔茨海默病和唐氏综合征中，神经 组织受到影响，在脑淀粉样蛋白血管病(CAA)中，血管受到影响。本 发明药物组合物可包括"治疗有效量"或"预防有效量"的本发明抗体或 抗体部分。"治疗有效量"是指在达到所需治疗结果所必需的一段时间 内的有效剂量。治疗有效量的抗体或抗体部分可由本领域技术人员确 定，并可以随例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或抗 体部分在个体内诱导所需应答的能力等因素而变化。治疗有效量还是 其中治疗有益作用胜于任何抗体或抗体部分毒害作用的量。"预防有效 量"是指在达到所需预防结果所必需的一段时间内的有效剂量。由于一般在疾病较早期前或在较早期时使用预防剂量，因此预防有效量将会 小于治疗有效量。
另外，本发明包括预防或治疗需要这种预防或治疗的患者的阿尔 茨海默病的其它方法。该方法包括按足以实现预防或治疗的量给予患 者上述疫苗的步骤。
此外，本发明包括鉴定化合物的方法，所述化合物适于使预测将
发生淀粉样变性(例如阿尔茨海默病)的患者主动免疫。该方法包括 l)在足以使一种或多种化合物与一种或多种抗体结合的条件下，将一 种或多种目标化合物暴露于一种或多种上述抗体中一段时间；2)鉴定 与一种或多种抗体结合的化合物，所鉴定出的化合物将用于使预测将 发生淀粉样变性(例如阿尔茨海默病)的患者主动免疫。
在抗体诊断应用的框架内，特异性球聚体的定性或定量测定特别 用来诊断与疾病相关的淀粉状蛋白(3形式。在这种情况下，特异性是 指能够有足够敏感度检测特定球聚体或其衍生物或其混合物的可能 性。本发明抗体的检测阈值浓度适宜小于10ng/mL样品，优选小于l ng/mL样品，特别优选小于IOO pg/mL样品，这意味着每mL样品最 小的球聚体浓度，表明了在任何情况下可通过本发明的抗体检测出同 样适宜的较低浓度。该检测按免疫学方法进行。大体上通过其中使用 抗体的任何分析或诊断实验方法进行，包括凝集技术和沉淀技术、免 疫测定法、免疫组织化学法和免疫印迹技术，例如蛋白质印迹法或优 选斑点印迹法。本发明还包括体内方法，例如成像方法。
应用免疫测定法是有利的。竟争性免疫测定法，即其中抗原和标 记抗原(示踪物)竟争结合抗体的测定法；夹心免疫测定法，即其中特 异性抗体与抗原的结合情况用通常经标记的第二抗体检测的测定法，
这两种方法都是适用的。这些测定法或可以是匀相的，即无需分成固 相和液相，或者可以是多相的，例如将结合的标记与未结合的标记分 开(例如通过固相结合的抗体)。根据标记和测定方法，各种多相和均 相免疫测定方式可分成各具体的类别，例如RIA (放射免疫测定法)、ELISA (酶联免疫吸附测定法)、FIA (荧光免疫测定法)、LIA (发光免 疫测定法)、TRFIA (时间分辨FIA)、 IMAC (免疫活化作用 (immunoactivation)) 、 EMIT (酶倍增免疫观'J定(enzyme-multiplied immune test))、 TIA (比浊免疫测定法)、I-PCR (免疫PCR)。
对于本发明球聚体的定量测定而言，优先选择竟争性免疫测定 法，其中规定量的用作示踪物的标记球聚体衍生物与样品球聚体(含有 未知量的未标记的球聚体)竟争，以定量测定与所使用的抗体的结合情 况。可以通过标准曲线由所置换的示踪物的量测定抗原的量，也就是 球聚体的量。
在可用于这些目的的标记中，酶被证实是有利的。例如，可以采 用基于过氧化物酶，特别是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和P-D-半乳 糖苷酶的系统。例如，特异性底物对于这些酶而言是可利用的，特异 性底物的转化可以用光度计监测。合适的底物系统是以用于以下酶的 下列底物为基础对于碱性磷酸酶为磷酸对硝基苯酯(p-NPP)、 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NPT)、固红/萘酚-AS-TS磷酸；对于 过氧化物酶为2，2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯 二胺(OPT)、 3,3，,5,5，-四曱基联苯胺(TMB)、邻联茴香胺、5-氨基水杨 酸、3-二曱氨基苯曱酸(DMAB)和3-曱基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH);对 于(3-D-半乳糖苷酶为邻硝基苯基-P-D-半乳糖苷(o-NPG)、对硝基苯基 -卩-D-半乳糖苷和4-曱基伞形酰基苯基(methylumbelliphenyl)-P-D-半乳 糖苷(MUG)。在许多情况下，这些底物系统是市售即用的形式，例如 还可含有其它试剂(例如合适緩冲剂等)的片剂形式。所用示踪物可以
是标记的球聚体。在这个意义上，可通过标记待测定的球聚体并将其 用作示踪物，来测定特定的球聚体。可按本领域已知方式使用于制备 示踪物的球聚体与标记偶联。可类似地参考以上对本发明球聚体衍生 化的说明。另外，许多经适当修饰用于与蛋白质缀合的标记是可利用 的，例如缀合生物素的酶、缀合抗生物素蛋白的酶、缀合extravidin 的酶或缀合链霉抗生素的酶、被马来酰亚胺活化的酶等。这些标记可
61直接与寡聚体反应，或者如有需要，与适当衍生化球聚体反应，得到 示踪物。例如，如果使用链霉抗生素-过氧化物酶缀合物，则这首先需 要使球聚体生物素化。这适用于相应的相反顺序。为此，合适的方法 也为技术人员所知。
如果选择多相免疫测定方式，则可通过将抗原-抗体复合物与支 持体结合来分离，例如通过与所述支持体偶联的抗独特型抗体，例如
针对兔IgG的抗体。合适的支持体，特别是用合适抗体包被的微量滴 定板是已知的，部分是市售的。
本发明还涉及含有如上所述至少一种抗体和其它组分的免疫测 定盒(immunoassay sets)。所述盒一般是包装单元的形式，是用于进行 本发明球聚体测定的工具(means)的组合。为了尽可能使处理简化，所 述工具优选以基本上即用的形式提供。有利的组合(arrangement)以诊 断合的形式供免疫测定之用。诊断合一般包括多个容器以分别放置各 组分。所有组分均可以即用稀释液、作为用于稀释的浓缩物或作为用 于溶解或混悬的干物质或冷冻干燥物提供；可将各个组分或所有组分 冷冻或保存在室温下直到使用。血清优选骤激冰冻(例如在-20。C下)， 因而在这些情况下，临用前，免疫测定优选需保持在冰冻温度以下。 提供给免疫测定法的其它組分决定于所述免疫测定法的类型。标准蛋 白质、示踪物(可能需要，或可能不需要)和对照血清一般与抗血清一 起提供。此外，还包括优选抗体包被的微量滴定板、緩冲液(例如用于 测定、用于洗涤或用于底物转化的緩沖液)以及酶底物本身。
实施室和医院免疫测定法的普通原理以及作为辅助物(auxiliaries) 的抗体的制备和4吏用可参见例如Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow, E.和Lane, D.主编,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY， 1988)。
本发明还包括在疑似患有淀粉样变性的患者中诊断淀粉样变性 (例如阿尔茨海默病)的方法。该方法包括以下步骤l)由患者体内分 离出生物样品；2)在足以形成抗原/抗体复合物的条件下，使生物样品与至少一种上迷抗体接触一段时间；和3)检测所述样品中抗原/抗体复 合物的存在情况，复合物的存在表明在患者中诊断出淀粉样变性(例如 阿尔茨海默病)。该抗原可以是例如球聚体或其部分或片段，所述部分 或片段具有与完整球聚体相同的功能性质(例如结合活性)。
此外，本发明包括在疑似患有淀粉样变性的患者中诊断淀粉样变 性(例如阿尔茨海默病)的另一种方法。该方法包括以下步骤l)由患 者体内分离出生物样品；2)在足以形成抗体/抗原复合物条件下，使 生物样品与抗原接触一段时间；3)在足以使缀合物与结合抗体结合的 条件下，将缀合物加到所得抗体/抗原复合物中一段时间，其中缀合 物包含与能够产生可检测信号的信号产生化合物连接的上述抗体中 的一种抗体；和4)通过检测由信号产生化合物产生的信号，来检测 可能存在于生物样品中的抗体，该信号表明在患者中诊断出淀粉样 变性(例如阿尔茨海默病)。该抗原可以是球聚体或其部分或片段，所 述部分或片段具有与完整球聚体相同的功能性质(例如结合活性)。 本发明包括在疑似患有淀粉样变性(例如阿尔茨海默病)的患者中 诊断淀粉样变性(例如阿尔茨海默病)的另一种方法。该方法包括以下 步骤l)由所述患者体内分析出生物样品；2)在足以形成抗抗体/抗体 复合物的条件下，使生物样品与抗抗体(其中所述抗抗体对上述抗体中 的一种抗体有特异性)接触一段时间，含有抗体的复合物存在于生物样 品中；2)在足以使缀合物与结合抗体结合的条件下，将缀合物加到所 得到的抗抗体/抗体复合物中 一段时间，其中缀合物包含与能够产生可 检测信号的信号产生化合物结合的抗原；和3)检测由信号产生化合物 产生的信号，该信号表明在患者中诊断出淀粉样变性(例如阿尔茨海默 病)。
本发明还包括诊断盒，所述诊断盒包括a)至少一种上述抗体， b)包含连接信号产生化合物的抗体的缀合物，其中缀合物中的抗体与 分离抗体不同。
本发明还包括诊断盒，所述诊断盒包括a)针对上述抗体之一的抗抗体，b)包含连接信号产生化合物的抗原的缀合物。该抗原可为球 聚体或其片段或部分，所述片段或部分具有与球聚体相同的功能特征
(例如结合活性)。
在本发明的一个诊断实施方案中，本发明的抗体或其部分被包被 在固相(或存在于液相)中。然后使试验样品或生物样品(例如全血、脑 脊液、血清等)与固相接触。如果样品中存在抗原(例如球聚体)，则该 抗原与固相上的抗体结合，然后通过直接或间接方法检测。直接方法 包括仅检测复合物本身的存在情况，继而检测抗原的存在。间接方法 中，将缀合物加到结合抗原中。缀合物包含第二抗体，第二抗体与连 接至信号产生化合物或标记的结合抗原结合。如果第二抗体与结合抗 原结合，则信号产生化合物产生可测量的信号。因此该信号表明试验 样品中存在抗原。用于诊断用免疫测定法的固相的实例是多孔材料和 无孔材料、乳胶颗粒、磁粉、微粒(参见美国专利号5,705,330)、微珠、 滤膜、微量滴定孔和塑料管。如有需要，根据所需测定形式的性能特 征确定固相材料的选择和对缀合物中存在的抗原或抗体进行标记的 方法。
如上所述，缀合物(或指示试剂)可包含连接信号产生化合物或标 记的抗体(或许为抗抗体，这取决于测定法)。此信号产生化合物或"标 记"本身是可检测的，或者可与 一种或多种其他化合物反应产生可检测 产物。信号产生化合物的实例包括色原、放射性同位素(例如1251、 1311、 32P、 3H、 35S和14C)、化学发光化合物(例如吖啶锁离子)、粒 子(可见粒子或荧光粒子)、核酸、螯合剂或催化剂例如酶(例如碱性磷 酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、(3-半乳糖香酶和核糖核酸酶)。 在使用酶的情况下(例如石威性磷酸酶或辣4艮过氧化物酶)，加入显色底 物、荧光底物或发光底物导致产生可检测信号。还可使用其它检测系 统，例如时间分辨焚光、内反射荧光、扩增(例如聚合酶链式反应)和 拉曼光谱。可用上述免疫测定法测定的生物体液的实例包括血浆、全 血、干全血、血清、脑脊液或组织和细胞的水萃取物或组织和细胞的有机-水萃取物。
本发明还包括;险测试^r样品中存在抗体的方法。该方法包括以下 步骤(a)在足以形成抗抗体/抗体复合物的时间和条件下，使疑似含有 抗体的试验样品与对患者样品中的抗体有特异性的抗抗体反应，其中 抗抗体是与患者样品中的抗体结合的本发明抗体；(b)将缀合物加到所 得抗抗体/抗体复合物中，该缀合物包含连有能够产生可检出测号的信 号产生化合物的抗原(它与抗抗体结合)；和(d)通过检测由信号产生化 合物产生的信号，来检测可能存在于试验样品中的抗体的存在情况。 可使用包含针对抗抗体的抗体的对照或校准物。
诊断盒也包括在本发明的范围内。更准确地讲，本发明包括诊断 盒，该诊断盒用于在疑似患有阿尔茨海默病或其它以认知受损为特征 的疾病的患者中测定抗原(例如球聚体)的存在情况。具体地说，用于 测定试验样品中抗原存在情况的诊断盒包含a)本文定义的抗体或其 部分；和b)包含连有能够产生可检测信号的信号产生化合物的第二抗 体(对抗原有特异性)的缀合物。诊断盒还装有对照或校准物以及包装 说明书，所述对照或校准物包括与抗原结合的试剂，所述包装说明书 描述了进行测定的方法。
本发明还包括用于检测试验样品中的抗体的诊断盒。诊断盒可装 有a)对目标抗体有特异性的抗抗体(例如本发明抗抗体中的一种)，和 b)如上定义的抗原或其部分。包含与抗原结合的试剂的对照或校准物 也包括在内。更准确地讲，诊断盒可包含a)对抗体有特异性的抗抗体 (例如本发明抗抗体中的一种)，和b)包含连有能够产生可检测信号的 信号产生化合物的抗原(例如球聚体)的缀合物。此外，诊断盒还包含 对照或校准物以及包装说明书，所述对照或校准物包含与抗原结合的 试剂，说明书描述了诊断盒的组分及如何使用的方法。诊断盒还可装 有容器，例如小瓶、瓶子或条带(strip)，每个容器中装有预设置的固相， 其它容器装有相应的缀合物。这些诊断盒也可装有进行测定所需要的 其它试剂的小瓶或容器，例如洗涤、处理和指示试剂。
65应当注意的是，本发明不仅仅包括上述全长抗体，而且还包括其
部分或其片段，例如其Fab部分。另外，本发明包括在例如结合特异 性、结构等方面与本发明抗体性质相同的任何抗体。
本发明的优势
通过用Ap(12-42)球聚体(如实施例I中所述)免疫，可获得不同的 单克隆抗体，它们对不同的A(3(l-42)寡聚体和Ap(X-42)寡聚体的耐受 性或识别程度有所不同，正如如上所述的竟争性斑点印迹法所测定的 一样。这可供针对A|3寡聚体的抗体的研发之用，该抗体在认知改善 作用、对其它AP形式所需的特异性与最小副作用特征之间具有最佳 关联性。对于用于被动免疫中的单克隆抗体也是如此。这类免疫(主动 和被动免疫)的特异性策略的优势是不会引起针对A{3单体、聚集原纤 维状态的AP肽或sAPPa的免疫应答。该优势表现在下列几个方面
1) 在不溶性A卩斑块的形式中，聚集原纤维状态下的A卩肽占阿 尔茨海默病脑整个A(3肽库(pool)的主要部分。通过使抗A(3抗体与这 些斑块反应，引起Ap斑块溶解而大量释放出Ap被认为是有害的。A卩 的这种大量释放随后可穿过血脑屏障，进入血流，并可能增加微出血 的风险。另外，在上述ELAN临床实验中，由于6%的病例发生脑膜 脑炎，因此需要取消用原纤维A卩肽形式免疫的这种极端策略的临床 试验。
2) 针对单体A(3肽形式的免疫应答不是所需的，因为研究显示， 该形式可发挥认知改善作用。
3) 针对sAPPa的免疫应答也不是所需的。另外，sAPPa同样显 示出发挥认知改善作用。
4) 要避免针对血管CAA形式的A卩肽的反应，以避免不良的微 出血副作用(即与针对N端的肽的抗体相比，针对A(3中部而且还不与 以CAA形式聚集的A卩肽结合的抗体引起微出血较轻微，参见上文)。
5) 相对于病理生理上相关的AP种类，与AP寡聚体起特异性反应的抗体具有较高的生物利用度，由于它们不与例如原纤维状A卩或 单体A卩结合，所以对这些形式的A卩不存在治疗效果。
再者，应当注意的是，本发明的抗体(特别是10F4和3C5)不检出 (detect)脑脊液中的淀粉状蛋白(3 (或与市售抗体如6E10 (Signet目录 号9320)相比结合亲和力较低)。因此，由于CSF中淀粉状蛋白的更 新率高，所以比起结合体内(例如脑和CSF)所有淀粉状蛋白卩的抗体， 不结合CSF中的淀粉状蛋白卩的抗体防止了抗体的浪费，并建立了一 个更有效和更有选择性的系统。此外，本发明抗体的这个性质使得能 够减少抗体的给予量(对于被动免疫而言)，降低副作用的风险(因为剂 量较低，所以使抗体限于靶标上)，提高了功效，也提高了治疗指数。 此外，微出血的风险也得到降低。另外，由于抗体不检出原纤维状形 式的淀粉状蛋白(3,所以与这类复合物形成有关的风险也降低。 保藏材料信息
2006年2月28日，根据布达佩斯条约(Bud叩estTreaty)条款，将 产生单克隆抗体3C5的杂交瘤(ML45-3C5.5C10)保存在美国典型培养 物保藏中心，10801 University Boulevard, Manassas ， Virginia 20110 ， 并指定为ATCC保藏号PTA-7406。 2006年8月16日，根据布达佩斯 条约条款，将产生单克隆抗体10F4的杂交瘤(ML43-10F4.3H8)保存在 美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110，并指定为ATCC保藏号PTA-7808。
可利用下列非限制性实施例对本发明进行说明。
实施例I
用于免疫的ABQ2-42)球聚体的制备
将A卩(12-42)合成肽(AnaSpec Inc.;批号40443)按40 mg/mL悬浮 于100% (体积/体积)的U，l,3,3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)中(5 mg在125 jaL HFIP中)，在37。C振荡下温育1小时以便完全溶解。HFIP起氢键断键 剂(hydrogen-bond breaker)的作用，并用来消除A(3肽中预先存在的结
67构不均一性。以10000 g离心10分钟后，HFIP溶解Ap(12-42)的上清 液用6.1 mL磷酸緩冲盐溶液(PBS) (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4))稀释后，加入625 pL 2% (重量/体积)十二烷基硫酸钠(SDS) (水溶液)(终浓度为0.2% (重量/体积)SDS)，在37。C下温育3小时。再 一次加入625 2% (重量/体积)十二烷基石克酸钠(SDS)(水溶液)(终浓 度为04% (重量/体积)SDS)，再次在37°C下温育3小时。该溶液用7 mL 水稀释，在37。C下温育16小时。以3000 g离心10分钟后，上清液 进一步用15 mL PBS (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4))稀释 后，经超滤浓缩(截留5kD)至0.65mL，用20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl、0.05。/。(重量/体积)SDS(pH7.4)在室温下透析16小时，以10000 g离心10分钟，回收包含A(3(12-42)球聚体的上清液。将样品等分后 保存在-80'C下备用。
实施例II 单克隆抗体3C5和10F4的制备
用50吗含实施例I中所述的A(3(12-42)球聚体的CFA (Sigma)对 Balb/c小鼠进行皮下免疫，按一个月的间隔加强免疫两次。收集脾脏， 通过PEG方法，将脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞按5:1比率融合。 以2xl()S细胞/mL， 200mL/孔，将融合细胞接种到96孔板的重氮丝氨 酸/次黄。票呤筛选培养基中。使细胞生长形成明显的集落，通过直接 ELISA测定，分析上清液的A卩寡聚体反应性。通过有限稀释对分泌 抗AP寡聚体抗体的杂交瘤进行亚克隆，直到抗体表达趋于稳定。
实施例III
抗AB球聚体抗体选择性的斑点印迹谱
为了表征抗AP球聚体单克隆抗体的选择性，研究了它们对不同 A卩形式的识别。为此，制备了补充有0.2 mg/mL BSA的含100 pmol/(iL-0.01 pmol/^L各种A卩形式的PBS系列稀释液。将各样品1 (aL点样到硝化纤维素膜上。为了检测，使用了相应的抗体(0.2吗/mL)。 使用过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG和染色试剂BM Blue POD底物 (Roche)，进行了免疫染色。
用于斑点印迹的AB标准
1. A(3(l-42)单体，0.1%NH4OH
将1 mg A卩(l-42) (Bachem Inc.,目录号H-1368)溶于0.5 mL 0.1% NH4OH/H20 (新鲜配制)(=2 mg/mL)后，在室温下立即振荡30秒钟， 得到澄清溶液。将该样品保存在-20。C下备用。
2. A卩(l陽40)单体，0.1%NH4OH
将1 mg A卩(l-40) (Bachem Inc.,目录号H-1368)溶于0.5 mL 0.1% NH4OH/H20 (新鲜配制)(=2 mg/mL)后，在室温下立即振荡30秒钟， 得到澄清溶液。将该样品保存在-20。C下备用。
3. A卩(l-42)单体，0.1%NaOH
将2.5 mg A卩(l-42) (Bachem Inc.,目录号H-1368)溶于0.5 mL 0.1% NaOH/H20 (新鲜配制)(=5 mg/mL)后，在室温下立即振荡30秒 钟，得到澄清溶液。将该样品保存在-20。C下备用。
4. AJ3(1墨40)单体、0.1%NaOH
将2.5 mg A(3(l-40) (Bachem Inc.，目录号H-1368)溶于0.5 mL 0.1%NaOH/ H20 (新鲜配制)(=5 mg/mL)后，在室温下立即振荡30秒 钟，得到澄清溶液。将该样品保存在-20。C下备用。
5. A卩(l-42)球聚体
将A(3(1陽42)合成肽(H-1368， Bachem， Bubendorf， Switzerland) 以6 mg/mL悬浮于100% 1,1,1，3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)中，在37。C下 振荡温育1.5小时至完全溶解。HFIP起氢4建断4建剂的作用，并用来消除Ap肽中预先存在的结构不均一性。用SpeedVac蒸发除去HFIP， 将AP( 1 -42)以5 mM的浓度重新悬浮于二曱亚砜中，超声处理20秒钟。 将HFIP预处理的A卩(1-42)在磷酸緩沖盐溶液(PBS) (20 mM NaH2P04、 140mMNaCl， pH 7.4)中稀释至400 )iM，加入1/10 (体积)2%十二烷 基硫酸钠(SDS)(水溶液)(终浓度为0.2% SDS)。在37。C下温育6小时 产生16/20-kDaA卩(l-42)球聚体中间体(球状寡聚体的短小形式)。通过 用3份体积的水进一步稀释并在37。C下温育18小时，来产生 38/48-kDaA卩(l-42)球聚体。在以3000 g离心20分钟后，样品经超滤 浓缩(截留30-kDa)，用5 mM NaH2P04、 35 mM NaCl (pH 7.4)透析， 以10000 g离心10分钟，回收含有38/48-kDa A卩(l-42)球聚体的上清 液。作为透析的替代方法，可用9倍(体积/体积)过量冰冷的曱醇/乙酸 溶液(33%甲醇，4%乙酸)使38/48-kDa A卩(l-42)球聚体在4。C下沉淀1 小时。然后沉淀出38/48-kDa A卩(l-42)球聚体(16200 g， IO分钟)，重 新悬浮于5mMNaH2P04、 35 mM NaCl (pH 7.4)，调节pH至7.4。
6. A卩(12陽42)球聚体
将2 mL按照实施例3.5 (见上文)制备的A卩(l-42)球聚体制备物与 38 mL緩冲液(5 mM磷酸钠、35 mM氯化钠(pH 7.4))和150 pl 1 mg/mL GluC内切蛋白酶(Roche)的水溶液混合。将反应混合物在室温下搅拌6 小时，随后再次加入150 nL 1 mg/mL GluC内切蛋白酶(Roche)的水溶 液。将反应混合物在室温下再搅拌16小时后，加入8 5 MDIFP (二 异丙基氟磷酸)溶液。用15mL30kDaCentriprep管使反应混合物浓缩 至约1 mL。将浓缩物与9 mL緩冲液(5 mM磷酸钠、35 mM氯化钠(pH 7.4))混合后，再次浓缩至1 mL。在6。C下，浓缩物用1 L緩冲液(5 mM 磷酸钠、35mMNaCl)在透析管中透析16小时。用1%浓度的SDS水 溶液调节透析液至SDS含量为0.1%。以10000 g离心10分钟收集样 品，弃去上清液。
707. A卩(20-42)球聚体
将按照实施例2.5 (见上文)制备的1.59 mL A卩(l-42)球聚体制备物 与38 mL緩沖液(50 mM MES/NaOH (pH 7.4))和200 |iL 1 mg/mL嗜热 菌蛋白酶溶液(Roche)的水溶液相混合。将反应混合物在室温下搅拌 20小时。然后加入80 pi 100 mM EDTA溶液(pH 7.4)，另外用400 |il 1% 浓度的SDS溶液调节混合物至SDS含量为0.01%。用15 mL 30 kDa Centriprep管使反应混合物浓缩至约1 mL。将浓缩物与9 mL緩冲液(50 mMMES/NaOH， 0.02 % SDS (pH 7.4))相混合，再次浓缩至1 mL。在 6。C下，浓缩物用1 L緩沖液(5mM磷酸钠、35 mMNaCl)在透析管中 透析16小时。透析液用2%浓度的SDS溶液调节至SDS含量为0.1%。 以10000 g离心10分钟收集样品，弃去上清液。
8. A卩(l-42)原纤维
将1 mg A(3(l-42) (Bachem Inc.目录号H-1368)溶于500 0.1% NH40H水溶液中(Eppendorff管)，将样品在室温下搅拌1分钟。该新 鲜配制的A(3(l-42)溶液100 |iL用300 |iL 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl(pH7.4)中和。用1% HC1调节pH至pH 7.4。将样品在37。C下温 育24小时后，离心(画0g， 10分钟)。弃去上清液，用400^iL20mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)经涡旋1分钟使原纤维沉淀重新悬 浮。
9. sAPPa
由Sigma供应(目录号S9564; 25 mM NaH2P04; 140 mM
NaCl; pH7.4)。 sAPPa用20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)、 0.2 mg/mL BSA稀释至0.1 mg/mL (= 1 pmol/pL)。
斑点印迹法的材料 A|3标准液
A卩抗原用20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4) + 0.2 mg/mLBSA系列稀释成
1) 100 pmol/|aL
2) 10 pmol/|-iL
3) 1 pmol/|aL
4) 0.1 pmol/(iL
5) 0.01 pmol/|iL
硝化纤维素
Trans-Blot转移基质(Transfer medium),纯硝化纤维素膜(0.45 —;BIO-RAD
抗小鼠-POD:
目录号715-035-150 (Jackson Immuno Research)
冲全测试剂
BM Blue POD底物，沉淀的(Roche)
牛血清白蛋白，(BSA):
目录号A-7888 (SIGMA)
封闭试剂
含5%低脂牛奶的TBS
緩沖液 TBS
25 mM Tris/HCl緩沖液(pH 7.5) + 150mMNaCl
TTBS
25 mM Tris/HCl-緩冲液(pH 7.5)+ 150mMNaCl
+ 0.05%吐温20 (Tween 20)
PBS + 0.2 mg/mL BSA
20 mM NaH2P04緩冲液(pH 7.4)
+ 140mM NaCl
+ 0.2 mg/mL BSA
抗体溶液I:
将0.2 ng/mL抗体用20 mL含1%低脂牛奶的TBS稀释
抗体溶液II:
1:5000稀释液
抗小鼠-POD/lQ/。低脂奶粉的TBS 斑点印迹法
1) 将1 ^L各个不同A卩标准液(5个系列稀释)点样到硝化纤维素 膜上，彼此距离约1 cm。
2) 在室温(RT)下，使AP标准液斑点在硝化纤维素膜上风干至少 10分钟(=斑点印迹法)。
3) 封闭
将斑点印迹与30 mL含5%低脂牛奶的TBS —起在室温下温育1.5 小时。
4) 洗涤
弃去封闭溶液，使斑点印迹与20 mL TTBS —起在室温下振荡温 育IO分钟。
5) 抗体溶液I:
弃去洗涤緩沖液，使斑点印迹与抗体溶液I一起在室温下温育2 小时。
736)洗涤
弃去抗体溶液I，使斑点印迹与20 mL TTBS —起在室温下振荡 温育IO分钟。
弃去洗涤溶液，使斑点印迹与20mLTTBS—起在室温下振荡温 育IO分钟。
弃去洗涤溶液，使斑点印迹与20 mL TBS —起在室温下振荡温育 IO分钟。
7) 抗体溶液II:
弃去洗涤緩冲液，使斑点印迹与抗体溶液II 一起在室温下温育过夜。
8) 洗涤
弃去抗体溶液II,使斑点印迹与20 mL TTBS —起在室温下振荡 温育IO分钟。
弃去洗涤溶液，使斑点印迹与20mLTTBS—起在室温下振荡温 育IO分钟。
弃去洗涤溶液，使斑点印迹与20mLTBS —起在室温下振荡温育 IO分钟。
9)显影
弃去洗涤溶液。斑点印迹用10mLBMBluePOD底物显影IO分 钟。用水充分洗涤斑点印迹以终止显影。应用斑点强度光密度分析 (GS800光密度计(BioRad)和软件包Quantity one, 4.5.0版(BioRad))进 行定量评价。只对相对密度大于用视力清晰分辩得出的上一级 A卩(20-42)球聚体斑点相对密度的20。/。的斑点进行评价。独立测定了每 个斑点印迹的该阈值。对于给定抗体，计算值表明识别A(3(l-42)球聚 体与各个A卩形式之间的关系。
通过用Ap(12-42)球聚体(按照实施例I中所述方法制备)使小鼠主动免疫，随后筛选融合的杂交瘤细胞，获得所测定的单克隆抗体(6E10 除外)。对各个A(3形式进行系列稀释，与各自的抗体一起温育以进行 免疫反应。
1. A卩(l醫42)单体，0.1%NH4OH
2. A卩(l-40)单体，0.1%NH4OH
3. A卩(l画42)单体，0.1%NaOH
4. A卩(l-40)单体，0.1%NaOH
5. A卩(l-42)球聚体
6. A卩(12-42)球聚体
7. A(3(20-42)球聚体
8. A卩(l-42)原纤维制备物
9. sAPPa (Sigma);(第一斑点1 pmol) 结果见图1。
根据对斑点印迹结果的分析，抗A卩球聚体mAb 10F4和抗A卩 球聚体mAb 3C5对于Ap-球聚体形式(例如Ap(l-42)球聚体、A(3( 12-42) 球聚体和A(3(20-42)球聚体)具有高亲和力。在一定程度上它们辨出其 它A卩形式(例如A卩单体)，但不显著识别A卩(l-42)原纤维或sAPPa。 抗体10F4和3C5因此可称作"抗A卩球聚体抗体"。
实施例IV
通过10F4和3C5检测阿尔茨海默病脑中的AB-球聚体表位 A:提取方法
试剂清单 3。/。SDS緩冲液
一 50 mM Tris/HCl、 150 mM NaCl、 0.5。/o曲通(Triton) X100, 1 mM EGTA、 3%SDS、 1%脱氧胆酸钠，pH7.4
完全蛋白酶承卩制剂混合物(Complete Protease Inhibitor Cocktail):
75—将1片完全抑制剂混合物(Complete Inhibitor Cocktail) (Roche Diagnostics GmbH;目录号1697498)溶于1 mL水；新鲜配制
PMSF溶液
—500mMPMSF/曱醇
3%SDS提取緩冲液
一将1/100完全抑制剂混合物溶液加到3% SDS緩冲液中 —将1/500 PMSF溶液加到3% SDS緩沖液中 一提取緩沖液临用前在室温下制备
抗体
—mAb 10F4 —mAb 3C5
—mAb 6E10 (Signet;目录号9320)
一mAblgG2b(对照抗体，针对合成半抗原产生，Dianova，克隆 NCG2B.01，目录号DLN-05812)
方法
在室温下，将0.2 g -80°。冷冻的人AD脑死后组织样品和年龄匹 配的对照脑组织样品加到1.8 mL新鲜配制的3% SDS提取緩沖液中。 立即将样品用玻璃罐(glass potter)在冰浴上勾浆化。将匀浆样品转移到 反应小瓶中，以10000 g离心5分钟。小心地收集上清液(=3% SDS-脑提取物)，反应小瓶在-8(TC下保存备用。
B:带有单克隆小鼠抗体Dynabead的活化
—小心地摇动Dynabead (Dynabead M-280绵羊抗小鼠IgG， Invitrogen;目录号112.02)的贮备悬液以防止起泡沫
—无菌条件下取出lmL，并转移至1.5mL反应小瓶中一 Dynabead用1 mL免疫沉淀(IP)-洗涤緩沖液(IP-洗涤緩沖液 PBS (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4》、0.1。/。BSA)洗涤3次5 分钟。在洗涤过程中，小心地弃去上清液，同时Dynabead被固定在 使用磁力分离器支架(magnetic separator stand, MSS)的反应小瓶的一
侧
—经洗涤的Dynabead与40吗A卩-抗体一起在1 mL PBS、 0.1% BSA中温育
—通过在4。C下振荡温育过夜进行活化
—活化的Dynabead用1 mL IP-洗涤緩冲液(PBS (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4))、 0.1Q/。BSA)洗涤30分钟4次(再用 MSS洗涤)
—将活化的Dynabead重新悬浮于1 mLPBS、 0.1%BSA、 0.02%
叠氮化钠中；涡旋后，短暂离心
—将抗体活化的Dynabead保存在4。C下备用
C:免疫沉淀(IP)
—25 3% SDS-脑提取物用975 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl、 0.05%吐温20 (pH 7.5)稀释(=1:40稀释液)。
—将下表中的25 各抗体活化的Dynabead与1 mL按1:40稀 释的3% SDS-脑提取物一起温育
■ 6E10-Dynabead
■ 3C5-Dynabead
■ 10F4-Dynabead
■ IgG2b-Dynabead
一在6。C下振荡温育过夜( 20小时)进行免疫沉淀 —Dynabead用MPS固定化 一小心取出上清液并弃去 —Dynabead ^口下进4亍'冼^条
■用500 |iL 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.5) + 0.1% BSA5分钟两次
■用5002 mM NaH2P04， 14 mM NaCl (pH 7.5) 3分钟一次 ■重要事项在最后一次弃去洗涤緩冲液后，将反应小瓶离心， 放回MSS上，小心吸出剩余的几滴液体
■将10 pL 50% CH3CN、 0.5% TFA/H20加到反应小瓶中，涡旋 ■将反应小瓶在室温下振荡温育10分钟
■ Dynabead用MSS固定化
■小心取出上清液—IP-洗脱液)，上清液中包含免疫沉淀洗脱出 的A卩种类
D:表面增强激光解吸电离质谱(SELDI-MS):
—将1 (iL IP-洗脱液点样到H4蛋白芯片阵列(Ciphergen;目录 号C573-0028)上。
一使样点在热培育箱板上干燥 一 CHCA溶液
■ 5 mg CHCA溶于150 |iL乙腈+ 150 1% TFA =母液；在
-2(TC下保存
■母液10 用20 乙腈和20 1% TFA稀释=CHCA工作
溶液
■将2pLCHCA工作溶液加到各样点上
—使各样点在热的培育箱板上干燥，通过SELDI-MS(表面增强 激光解吸电离质谱)进行了分析
■条件激光强度200;灵敏度6;质量范围800Da-10000Da; 位置20-80;收集5个
b分析定量测定各个Ap质量峰的MZ面积
E.免疫沉淀的AD-脑提取物的蛋白质印迹分析 SDS-PAGE:SDS-样品緩冲液 —0.3 g SDS
—4 mL 1 M Tris/HCl (pH 6.8) —8 mL甘油
_ 70 jiL 1%溴酚蓝的乙醇溶液 —加水至50 mL
电泳緩沖液 —7.5 g Tris 一36g甘氨酸 _ 2.5 g SDS —加水至2.5 L
SDS-PAGE凝胶系统
—18% Tris/甘氨酸凝胶(Invitrogen Inc.，目录号EC65055BOX) 将5 (iL IP-洗脱液加到13 nL样品緩沖液(300 [iL SDS-样品緩冲液 + 10 1 M Tris-溶液/H20 + 20 |iL 85%甘油)中。将所得18 样品点 样到180/。Tris/甘氨酸凝胶(Invitrogenlnc.,目录号EC65055BOX)上。 在20 mA恒流下进行SDS-PAGE。
蛋白质印迹法
电泳之后，使用半干印迹槽(Semi Dry Blotting chamber) (BioRad), 使凝胶在75 mA下经45分钟吸印到硝化纤维素膜(7.5 cm x 9 cm, 0.2 |im， BioRad)上。
印迹緩沖液 —6 g Tris 一28.1 g甘氨酸 一 500 mL曱醇
79—加水至2.5 L
蛋白质印迹免疫染色 > 材料
—抗Ap抗体6E10 (Signet;目录号9320)
—抗小鼠-POD(JacksonlmmunoResearch,目录号715-035-150)
一 4佥测试剂
■ Super Signal West Pico Substmt (Pierce,目录号34077) 一牛血清白蛋白(BSA， Serva，目录号11926)
一低脂牛奶(Lasana) 一封闭试剂
■ 2% BSA的PBST溶液 —TBS:
■ 25 mM Tris/HCl
■ 150 mM NaCl緩沖液(Puffer)， (pH 7.5) —TTBS:
■ 25 mM Tris/HCl
■ 150 mM NaCl緩沖液(Puffer) 國0.05%吐温20, pH7.5 一PBS:
■ 20 mM NaH2P04緩冲液
■ 140 mM NaCl緩沖液(pH 7.5) —PBST:
■ 20 mM NaH2P04緩沖液
■ 140 mM NaCl緩冲液 國0.05%吐温20， pH7.5
一抗体溶液I:
■ 1 pg/mL 6E10 = 1:1000溶于20 mL 3%低脂牛奶的TBS溶液 一抗体溶液II:
80■ 1:10000稀释的抗小鼠-POD,溶于20 mL 3。/。低脂牛奶的TBS
溶液 方法
1) 将蛋白质印迹在PBS中沸腾10分钟。
2) 封闭
—使蛋白质印迹在6。C下与50mL封闭试剂一起温育6小时。
3) 洗涤
—弃去封闭溶液，蛋白质印迹用50 mL TTBS在室温下洗涤10 分钟。
—弃去封闭溶液，蛋白质印迹用50 mL TBS在室温下洗涤10分钟。
4) 抗体溶液I:
_弃去洗涤溶液，使蛋白质印迹与抗体溶液I 一起在室温下温 育4小时。
5) 洗涤
—弃去封闭溶液，蛋白质印迹用50 mL TTBS在室温下洗涤10 分钟。
一弃去封闭溶液，蛋白质印迹用50mLTTBS在室温下洗涤10分钟。
—弃去封闭溶液，蛋白质印迹用50 mL TBS在室温下洗涤10 分钟。
6) 抗体溶液II:
一弃去洗涤溶液，蛋白质印迹与抗体溶液n—起在室温下温育 i小时。
7) 洗涤
—弃去封闭溶液，蛋白质印迹用50 mL TTBS在室温下洗涤10 分钟—弃去封闭溶液，蛋白质印迹用50 mL TTBS在室温下洗涤10分钟。
—弃去封闭溶液，蛋白质印迹用50 mL TBS在室温下洗涂10 分钟。
8)显影和定量分析 一弃去洗涤溶液。
—将2 mL Super Signal West Pico Substrate Enhancer和2 mL过
氧化物溶液相混合。
一将所得4 mL溶液加到蛋白质印迹中，使该印迹避光温育5分钟。
一采用化学发光成像系统(VersaDoc， BioRad)对印迹进行了分 析。在30秒钟、97.5秒钟、165秒钟、232.5秒钟和300秒钟测定时 间(acquisition time)拍才蟲了 5张照片。
—用软件包Quantity one, 4.5.0版(BioRad)，对照片上出现的A卩 蛋白条带的不饱和印迹(强度x mm)进行了分析。
结果见图2。我们认为本文所用3% (重量/体积)的提取方法提取 的是脑内总AP肽库的可溶性形式，因为緩冲液组成不足以使聚集的 原纤维状形式的A卩肽溶解。因此阿尔茨海默病脑提取物中与单克隆 抗体3C5和10F4结合的A卩肽是可溶性A3-肽。有研究认为这些可溶 性A卩种类是阿尔茨海默病相关种类，因为它们与该病严重性的关联 程度比AD脑内存在的Ap-斑块形式的原纤维状A卩的更高(Kuo等 1996， J.Biol. Chem. 271, 4077-4081; Lue等,1999, Am. J. Pathol. 155， 853-862)。因此，抗体10F4和3C5靶向该病相关A卩种类。另外，比 起总Af3-抗体6E10,单克隆抗体3C5和10F4仅与阿尔茨海默病脑提 取物中总的可溶性A(3库中的较少部分(subfraction)结合。剩余的A卩-形式显然不具有由3C5和10F4识别的A(3-球聚体表位。由于一般不 认为这些Ap形式是致神经病性的，所以有利的是，不用处理抗体攻 击这些A(3形式以降低副作用，并且不降低CNS循环中抗体的有效浓度。因此，可降低治疗抗体的剂量，就可得到较好的治疗指数。
实施例V
通过抗AB球聚体抗体识别AB(l-42)原纤维的SDS-PAGE显示的半定
量分析
A卩(l-42)原纤维制备物
将1 mg A卩(l陽42) (Bachem，目录号H-1368)溶于500 0.1% NH4OH/H20后，在环境温度下搅拌1分钟。按10000 g将样品离心5 分钟。收集上清液。按照Bradford方法(BIO-RAD Inc.实验方法)测定 上清液中的A卩(l-42)浓度。
将100 pL A卩(l隱42)/0.10/。 NH4OH与300 pL 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)相混合，用2% HC1调节pH为7.4。样品然后在37°C 下温育20小时。之后，样品以10000 g离心10分钟。弃去上清液， 将残基与400 pL 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)混合，通过 剧烈搅拌("涡旋")1分钟重新悬浮，并以10000 g离心10分钟。弃去 上清液，将残余物与400 (iL 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4) 混合，通过剧烈搅拌("涡旋")1分钟重新悬浮，以10000 g再次离心 IO分钟。弃去上清液。将残余物重新悬浮于380(iL20mMNaH2PO4、 140 mM NaCl (pH 7.4)后，剧烈搅拌("涡旋")。
结合抗Ap抗体与Ap(l-42)原纤维
40 A(3(l-42)原纤维制备物用160 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl、 0.05%吐温20 (pH 7.4)稀释，并在环境温度下搅拌5分钟，然 后使样品以10000g离心10分钟。弃去上清液，将残余物重新悬浮于 95 (iL20mMNaH2PO4、 140mMNaCl、 0.05%吐温20 (pH 7.4)中。通 过剧烈搅拌("涡旋")促使重新悬浮。将10 等分量的原纤维制备物与 下列成分各自相混合
a) 10 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)b) 10 0.5 (ig/|aL 3C5，溶于20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH
7.4)
c) 10 pL 0.5 (xg/VL 10F4，溶于20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH
7.4)
d) 10 0.5吗/[xL 6E10 (Signet目录号9320)，溶于20 mMNaH2P04、 140mMNaCl(pH7.4)
将样品在37。C下温育20小时后，以10000 g离心10分钟。收集上清液，与20 SDS-PAGE样品緩冲液混合。《吏残余物与50 (xL 20mM NaH2P04、 140 mM NaCl、 0.025%吐温20 (pH 7.4)混合，"涡旋"以便重新悬浮。接着，该样品以10000 g再离心10分钟。弃去上清液，残余物与20 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl、 0.025%吐温20 (pH7.4)以及20 SDS-PAGE样品緩冲液相混合。对于电泳，将样品加到4-20。/。Tris/甘氨酸凝胶上。
SDS-PAGE参数
SDS样品緩沖液0.3gSDS
4mL lMTris/HCl， pH 6. 88 mL甘油
1 mL含1%溴酚蓝的乙醇加水至50mL
4-20% Tris/甘氨酸凝胶(Invitrogen目录号EC6025BOX)
电泳缓沖液7.5gTris
36 g甘氨酸2.5gSDS加水至2.5 L
以20 mA恒《u进4亍电;永。
84凝胶染色考马斯蓝R250结果见图3。
不同的抗A卩抗体以及它们对A(3(l-42)原纤维的识别的半定量分
析
抗体、A卩(l-42)原纤维抗体重链、抗体轻链和Ap(l-42)单体的位置在凝胶旁边标明。由于Ap(l-42)原纤维的大小，它们不能进入SDS-PAGE凝胶，可见到在凝胶槽中。
1. 标记
2. A卩(l-42)原纤维制备物；对照
3. A卩(l-42)原纤维制备物；+mAb6E10; 20小时，37°C;上清液
4. A卩(l-42)原纤维制备物；+mAb6E10; 20小时，37°C;沉淀
5. A卩(l-42)原纤维制备物；十mAb3C5; 20小时，37°C;上清液
6. A卩(l-42)原纤维制备物；十mAb3C5; 20小时，37°C;沉淀
7. A卩(l-42)原纤维制备物；+mAblOF4; 20小时，37°C;上清液
8. A卩(l-42)原纤维制备物；十mAblOF4; 20小时，37°C;沉淀
通过测定离心后原纤维结合部分(沉淀部分)和上清液部分中的抗体重链的光密度(OD)值，经SDS-PAGE分析对原纤维型A卩的相对结合进行了评价。结合A(3原纤维的抗体可与Ap-原纤维共沉淀，因此存在于沉淀部分中，而非Ap-原纤维结合的(游离)抗体存在于上清液中。按照下式计算与Ap-原纤维结合的抗体的百分比
结合A(3-原纤维的抗体％ =
OD原纤维部分xlO()o/o/(OD 原纤维部分+ OD上清液部分)
结果见图3。在共沉淀实验中，与识别和结合AA1-17之间线性A卩-表位的市售抗体6E10 (Signet目录号9320)相比，A|3球聚体抗体3C5和10F4结合Ap(l-42)-原纤维的亲和力较低。这由以下证据证实，即在与A卩(l-42)原纤维一起温育后，在经过沉淀步骤后，3C5和10F4抗体主要保留在上清液中，没有因与A(3(l-42)原纤维结合而发生共沉淀。
在阿尔茨海默病脑内，A(3原纤维是总AP肽库的主要组分。这些原纤维通过用抗Ap-抗体攻击，由于释放高含量的A卩而不良副作用的风险升高，这继而可增加微出血的风险。在用A卩肽的原纤维状聚集体的主动免疫方法中观察到微出血风险升高(Bennett和Holtzman，2005， Neurology, 64, 10-12; OrgogozoJ, Neurology, 2003， 61,46-54;Schenk等，2004， Curr Opin Immunol， 16， 599-606)。
实施例VI
老年APP转基因小鼠和阿尔茨海默病患者脑膜血管中淀粉状蛋白斑块形式和淀粉状蛋白形式的原纤维状AB肽与抗体10F4和3C5特异
性反应的原位分析抗体10F4和3C5显示原纤维状A卩肽沉积物的染色减少，这表明其治疗作用是由结合可溶性球聚体形式的A卩肽而不是结合原纤维
状沉积形式的A(3肽来介导的。由于与原纤维状Ap肽结合的抗体可导致聚集体快速溶解，随后增加可溶性Ap的浓度，这又是被认为是有神经毒的，并可能导致微出血，因此优选作用于可溶性球聚体而不是单体的抗体疗法。
方法
对于这些实验，使用了若干脑材料样品得自2名AD患者(RZ16和RZ55)的皮质组织和得自19月龄Tg2576小鼠(APPSWE # 001349，Taconic， Hudson, NY, USA)或12月龄APP/L小鼠(ReMYND， Leuven，Belgium)的皮质组织。
这些小鼠过量表达带有家族性阿尔茨海默病突变的人APP，在11月龄左右时，在脑实质中形成(3-淀粉状蛋白沉积物，在18月龄左右时，在较大脑血管中形成(3-淀粉状蛋白沉积物。将动物深度麻醉，经贲门注入O.l M磷酸緩冲盐溶液(PBS)以沖洗血液。然后，开颅摘取大脑，纵向剖开。将一个脑半球经骤冷冷冻，另一个用4%低聚曱醛中浸泡固定。浸泡固定的脑半球用30%蔗糖的PBS溶液浸泡进行冷冻保护并装在水冻切片机中。将整个前脑切成40pm的横切片，收集到PBS中，用于随后的染色步骤。
从Brain-Net, Munich, Germany获得阿尔茨海默病患者的新皮质样品，为冷冻组织，在融化期间用4%低聚曱醛浸泡固定，接着像小鼠组织一样进行处理。
各切片采用下列方案用刚果红染色
材料
—淀粉状蛋白染色刚果红诊断盒(Sigma-Aldrich; HT-60),由NaCl醇溶液、NaOH溶液和刚果红溶液组成一染色杯
一显微镜载玻片SuperfrostPlus和盖玻片—乙醇、二曱苯、包埋基质
试剂
—NaOH按1:100用NaCl溶液稀释，得到碱性盐水一碱性盐水按1:100用刚果红溶液稀释，得到碱性刚果红溶液(用前15分钟以内制备，过滤)
一将切片铺于载玻片，使之干燥
一在染色杯中，将载玻片先在碱性盐水中温育30-40分钟，然后在碱性刚果红溶液中温育30-40分钟
一用新鲜乙醇漂洗三次，用二曱苯包埋
使用Zeiss Axioplan显微镜(Zeiss， Jena, Germany)先对染色进行拍照，然后进行定量评价。红色表示斑块形式的淀粉状蛋白沉积物和较大脑膜血管中的淀粉状蛋白沉积物。稍后，对抗体染色的评价集中在这些结构上。
按照下列方案，切片用含有0.07-0.7昭/ml相应抗体的溶液温育，以进行染色
材料
一 TBST洗涤溶液(Tris緩沖盐溶液与吐温20; 10x浓缩物；DakoCytomation S3306, DAKO， Hamburg, Germany) 1:10在Aquabidest.中)
—0.3%11202/曱醇
—驴血清(Serotec， Dusseldorf, Germany), 5%在TBST中，作为封闭血清
一单克隆小鼠抗球聚体抗体按给定浓度在TBST中稀释
—第二抗体生物素化驴抗小鼠抗体(Jacksonlmmuno/Dianova,
Hamburg, Germany; 715-065-150;按1:500在TBST中稀释)
—StreptABComplex (DakoCytomation K 0377， DAKO, Hamburg,
Germany)
一过氧化物酶底物诊断盒二氨基联苯胺(-DAB; SK-4100;Vector Laboratories, Burlingame， CA， USA)一 SuperFrost Plus显微镜载玻片和盖玻片—无二曱苯包埋基质(Medite, Burgdorf， Germany; X-traKitt)
方法
一将不固定的切片转移到水冷的0.3% H202中，温育30分钟
一在TBST緩沖液中洗涤5分钟
—与驴血清/TBST温育20分钟
—与第一抗体在室温下温育24小时
—在TBST緩冲液中洗涤5分钟
—与封闭血清温育20分钟
—在TBST緩冲液中洗涤5分钟—与第二抗体在环境温度下温育60分钟
—在TBST緩冲液中洗涤5分钟
—与StreptABComplex在环境温度下温育60分钟
—在TBST緩沖液中洗涤5分钟
—与DAB温育20分钟
一将切片铺于载玻片，使载玻片风干，用乙醇使载玻片脱水， 包埋载玻片
除了在显微镜下目视检查切片外，另外通过应用ImagePro5.0成 像分析系统，目测截取10个从组织学图像随机选出的斑块，测定其 平均灰度值，从而对淀粉状蛋白染色进行定量分析。从淀粉状蛋白斑 密度减去染色材料的平均背景密度，由灰色标度值计算得出光密度值 (0%—周围背景无斑块染色，100%—未转移(no tmnsmission)/最大染 色)。分别对抗体6E10/4G8和6G1之间，10F4和3C5之间进行了 ANOVA统计显著性检验。
结果
下面描述的所有抗体染色的材料被证实是亲刚果红的 (congophilic)淀粉状蛋白沉积物(图4 (a))。偏好球聚体的抗体10F4和 3C5染色的实质与脑膜亲刚果红的A卩肽沉积物在0.7 pg/mL的相同浓 度下，明显比抗体6G1和6E10的少(图4(b、 c、 h))。实质淀粉状蛋白 斑染色的定量分析显示所有抗体都与斑块结合(密度有统计显著性地 超出对照)，与抗体10F4和3C5的结合显著小于与参比抗体6E10的 结合(产生对A卩的N端序列的结合)，并小于或等于参比抗体4G8 (产 生对A卩的N端序列的结合)(图4 (d-g))。
抗体10F4和3C5与淀粉状蛋白沉积物的结合小于识别A卩单体 或AP序列组成部分的抗体的结合。用与原纤维状A卩肽结合的抗体治 疗可导致脑组织中淀粉状蛋白斑的快速溶解，随即增加可溶性A卩浓 度，这继而又被认为是有神经毒的，并可能导致微出血，和/或血管淀粉状蛋白的快速溶解，这也可能导致微出血。
的。、 。 7 、 、、 '''、 C、
实施例VII
与抗AB球聚体抗体10F4和3C5免疫沉淀后AD患者CSF中的内源
AB(l-42)和AB(l-40)水平
得自AD-脑CSF的A卩种类与Dynabead M-280绵羊抗小鼠IgG 的免疫沉淀(IP)
下列mAb用Dynabead M-280绵羊抗小鼠IgG固定化 —rnAb6E10 (Signet Inc.;目录号9320) —mAb 3C5 一 mAb 10F4 —mAb 8F5
Dynabead M-280绵羊抗小鼠IgG:
绵羊抗小鼠IgG (Invitrogen Inc.,目录号112.02)与磁性微珠 (Dynabead)共价结合。
用单克隆小鼠抗体活化的Dynabead
—将Dynabead的贮备悬液(Dynabead M-280绵羊抗小鼠IgG， Invitrogen; Prod. No. 112.02)小心地振荡以免起泡沫
—在无菌条件下取出lmL，并转移到1.5mL反应小瓶中
一 Dynabead用1 mL免疫沉淀(IP)-洗涂緩冲液(IP-洗涤緩沖液 PBS (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4))、 0.1% (重量/体积)BSA) 洗涤3次5分钟。
在洗涤过程中，小心地弃去上清液，而将Dynabead固定在使用 磁力分离器支架(MSS)上的反应小瓶一侧
—将经洗涤的Dynabead与40呢A卩-抗体/1 mL PBS、 0.1% (重量/体积)BSA —起温育，
—在4。C下振荡温育过夜进行活化
—活化Dynabead用1 mL IP-洗涤緩沖液(PBS (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4))、 0.1% (重量/体积)BSA)洗涤4次30分钟(再用 MSS洗涤)
—将活化Dynabead用1 mL PBS、 0.1% (重量/体积)BSA、 0.02% (重量/体积)叠氮化钠重新悬浮；涡旋后短暂离心 —将抗体活化的Dynabead保存在4。C下备用
CSF样品制备物
将得自阿尔茨海默病患者的400 iaL CSF加到4 完全蛋白酶抑 制剂混合物(Rochelnc.目录号1697498，将l片溶于lmL水)中，将 0.8 pL 500 mM PMSF溶于曱醇。10分钟后，加入1.6 mL 20 mM NaH2P04、 140mMNaCl、 0.05%吐温20 (pH 7.4) (PBST)。
得自人AD-CSF的A卩种类的免疫沉淀
将250 等分量的制成的CSF样品加到25 (iL抗A卩-Dynabead 悬液中
—在6。C下搅拌16小时以进行免疫沉淀。随后微珠用1 mL PBS/0.1% (重量/体积)BSA洗涤3次5分钟。最后用1 mL 10 mM Tris/HCL (pH 7.5)緩冲液洗涤一次3分钟。在洗涤过程中，小心地弃 去上清液，同时将Dynabead固定在使用磁力分离器支架(MSS)上的反 应小并瓦一侧
在最终洗涤步骤后，彻底除去残余上清液。
通过将25 |iL不含卩-巯基乙醇的样品緩冲液(0.36 M Bistris、 0.16 M iV-二(羟乙基)甘氨酸、1% SDS (重量/体积)、15% (重量/体积)蔗糖、 0.004% (重量/体积)溴酚蓝)力口到Eppendorff管中，在加热器上于95°C 加热5分钟，从Dynabead中除去Ap肽和各个抗体。冷却至室温后，将Dynabead固定在使用磁力分离器支架(MSS)的反应小瓶一侧，将上 清液转移到另 一只Eppendorff管(IP洗脱液)中。
依次用尿素-PAGE和蛋白质印迹法对A(3免疫沉淀物进行分析
按照文献方法，先后用8M尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳系统和蛋白 质印迹分析对A(31-40和Api-42种类进行了定量测定(前者参见H. W. Klafki等，Analytical Biochemistry 237， 24-29 (1996),后者参见J. Wiltfang等，J. of Neurochemistry 81， 481-496， 2002。在本实验方法 中只有两个小的变动
1) 调节积层胶的SDS浓度至0.25% (重量/体积)而不是0.1% (重 量/体积)。
2) 对于蛋白质印迹法，抗体1E8 (Senetek Drug Delivery Technologies Inc. St. Louis, MO, USA)用抗人淀粉状蛋白卩(N) (82E1) 小鼠IgGmAb(IBL，目录号10323)替换。
将15 |iL等分量的免疫沉淀样品IP洗脱液加到8 M尿素PAGE 上。以100V开始电泳(15分钟)，以60V持续电泳。当负载染料的蓝 色样品电泳前缘距凝胶末端尚有0.5 cm时，停止电泳。
蛋白质印迹方法
用7.5 cm x 9 cm硝化纤维0.45 (im (BioRad Inc.),在半干印迹槽 (BioRadInc.， 45分钟，75mA)中进行蛋白质印迹分析。
印迹緩冲液6gTris; 28.1g甘氨酸；500 mL甲醇；用水调至 2.5 L。
将硝化纤维印迹在PBS中于IO(TC煮沸10分钟。在室温下，通 过用50mL5。/。(重量/体积)BSA/BST处理1小时使印迹饱和，在用以 下緩冲液进行2次洗涤步骤后，除去流动相用50 mL TTBS (25 mM Tris/HCl、 150mMNaCl緩冲液、0.05%吐温20 (pH 7.5))，室温下10 分钟，接着用50mLTBS(25mMTris/HCl、 150 mM NaCl緩沖液(pH7.5))，室温下IO分钟。
对于进一步显色，从印迹上弃去最终的洗涤緩沖液，在6。C下， 加入15 mL抗体I溶液(0.2吗/mL 82E1 = 1:500/3% (重量/体积)脱脂奶 粉(LasanaInc.)的15 mLTBS溶液)达20小时。弃去緩沖液后，进行如 上所述的三次洗涤步骤。使印迹与抗体溶液II(抗小鼠-POD与15 mL 3% (重量/体积)脱脂奶粉的15mLTBS溶液的1:10000稀释液)在室温 下温育1小时。通过如上所述的三次洗涤步骤后弃去緩冲液。
弃去最后的洗涤緩冲液后，使2 mL Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrat Enhancer与2 mL过氧化物溶液混合。将 新配制的溶液倒入避光预温育5分钟的印迹上。使用VersaDoc Imaging 系统(BioRad)记录化学发光。
成像参数
曝光时间180秒钟
30秒钟、60秒钟、120秒钟和180秒钟后拍照。 从曝光时间180秒钟的照片得到结果。
与市售抗体6E10 (文献指出不论构象识别所有的A(3-形式)相比， 本发明的抗球聚体抗体10F4和3C5对阿尔茨海默病患者CSF中的 A卩(l-42)肽和A卩(l-40)肽具有较低的亲和力。CSF A(3肽形式更新率高 (Bateman等，Nature Medicine, 2006， 12 (7):856-61),因此与疾病相 关的A卩种类不同。因此，在阿尔茨海默病被动免疫治疗策略以降低 不良副作用风险的情况下，不应不靶向CSFAp-形式。值得注意的是， 在早期研究(Barghom等，J Neurochem. 2005; 95 (3): 834-847)中，抗 A卩-球聚体抗体8F5不识别并且不结合阿尔茨海默病患者CSF中的 A(3-肽。该项早期研究是使用夹心ELISA方法进行的。相比之下，当 使用上述免疫沉淀和尿素PAGE方法时，同一抗体8F5的确识别阿尔 茨海默病患者CSF中的A卩肽(参见图5)。因此，夹心ELISA方法产生了假阴性结果；因此，对于检测CSF中的A(3-肽，应当采用本文所 述免疫沉淀和尿素PAGE方法。
权利要求
1.一种分离抗体，所述抗体对Aβ(1-42)球聚体的亲和力比对选自以下的至少一种淀粉状β蛋白的亲和力更高脑脊液(CSF)中存在的Aβ(1-42)肽和b)CSF中存在的Aβ(1-40)肽。
2. —种分离抗体，所述抗体对Ap(l-42)球聚体的结合亲和力比对 选自以下的至少一种淀粉状(3蛋白的结合亲和力更高a) Ap(l-42)单 体，b) A(3(l-40)单体，c) A(3(l-42)原纤维和d)可溶性淀粉状蛋白前体 蛋白a(sAPPa)。
3. 权利要求2的分离抗体，其中与结合CSF中存在的淀粉状卩 蛋白的亲和力相比，所述抗体以更小的亲和力与非CSF中存在的淀粉 状J3蛋白结合。
4. 权利要求1或权利要求2的分离抗体，其中所述抗体是单克隆 抗体。
5. 权利要求4的分离抗体，其中所述抗体是重组抗体。
6. 权利要求1或权利要求2的分离抗体，其中所述抗体是人抗体 或人源化抗体。
7. 权利要求1或权利要求2的分离抗体，其中所述抗体作为单克 隆抗体结合至少一个表位，所述单克隆抗体选自可获自标注为美国 典型培养物保藏中心保藏号PTA-7808的杂交瘤的单克隆抗体10F4和 可获自标注为美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7406的杂交瘤的 单克隆抗体3C5。
8. —种分离抗体，所述抗体包含SEQIDNO:5。
9. 一种分离抗体，所述抗体包含SEQIDNO:6。
10. 权利要求的分离抗体9，所述抗体还包含SEQIDNO:5。
11. 一种分离抗体，所述抗体包含SEQIDNO:7。
12. —种分离抗体，所述抗体包含SEQIDNO:8。
13. 权利要求12的分离抗体，所述抗体还包含SEQIDNO:7。
14. 权利要求1或权利要求2的分离抗体，其中所述抗体包含至 少一个选自以下的氨基酸序列a)单克隆抗体(10F4)的重链CDR3的 氨基酸序列和轻链CDR3的氨基酸序列，所述单克隆抗体可获自标注 为美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7808的杂交瘤，和b)单克隆 抗体(3C5)的重链CDR3的氨基酸序列和轻链CDR3的氨基酸序列，所 述单克隆抗体可获自标注为美国典型培养物保藏中心保藏号 PTA-7406的杂交瘤。
15. 权利要求1或权利要求2的分离抗体，其中所述抗体包含至 少一个选自以下的氨基酸序列a)单克隆抗体(10F4)的重链CDR2的 氨基酸序列和轻链CDR2的氨基酸序列，所述单克隆抗体可获自标注 为美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7808的杂交瘤，和b)单克隆 抗体(3C5)的重链CDR2的氨基酸序列和轻链CDR2的氨基酸序列，所 述单克隆抗体可获自标注为美国典型培养物保藏中心保藏号 PTA-7406的杂交瘤。
16. 权利要求1或权利要求2的分离抗体，其中所述抗体包含至 少一个选自以下的氨基酸序列a)单克隆抗体(10F4)的重链CDR1的 氨基酸序列和轻链CDR1的氨基酸序列，所述单克隆抗体可获自标注 为美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7808的杂交瘤，和b)单克隆 抗体(3C5)的重链CDR1的氨基酸序列和轻链CDR1的氨基酸序列，所 述单克隆抗体可获自标注为美国典型培养物保藏中心保藏号 PTA-7406的杂交瘤。
17. —种分离抗体，所述分离抗体包含至少一个选自以下氨基酸 序歹'l的CDR : a) SHYA額；b) YIDYSGSTRYLPSLKS ; C) GSGYFYGMDY ; d) HASQ画VWLS ; e) KASNLHT ; f) QQGQSYPYT ; g) NYLIE ; h) V證GSGDTNYNENFKG ; i) GVITTGFDY; j) RASGNIHNYLA; k) NAKTLAD和1) QHFWSSPRT。
18. —种杂交瘤，所述杂交瘤被标注为美国典型培养物保藏中心 保藏号PTA-7808。
19. 单克隆抗体(10F4),所述单克隆抗体可获自标注为美国典型 培养物保藏中心保藏号PTA-7808的杂交瘤。
20. —种杂交瘤，所述杂交瘤被标注为美国典型培养物保藏中心 保藏号PTA-7406。
21. 单克隆抗体(3C5)，所述单克隆抗体可获自标注为美国典型培 养物保藏中心保藏号PTA-7406的杂交瘤。
22. —种分离核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1或权利要 求2的抗体。
23. 权利要求22的分离核酸分子，其中所述分子的核苷酸序列包 含至少一个选自以下的序列SEQIDN0:1、 SEQ ID N0:2、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
24. —种载体，所述载体包含权利要求23的所述分离核酸分子。
25. —种宿主细胞，所述细胞包含权利要求24的所述载体。
26. —种制备抗体的方法，该方法包括将权利要求25的所述宿主 细胞在适于产生所述抗体的条件下在培养基中培养一段时间。
27. —种分离抗体，所述抗体用权利要求26的所述方法制备。
28. —种组合物，所述组合物包含权利要求1的所述抗体和权利 要求2的所述抗体或其组合。
29. 权利要求28的组合物，其中所述組合物是药物组合物，并且 还包含药学上可接受的载体。
30. —种单克隆抗体，所述抗体包含由至少一个选自以下的核苷 酸序列编码的氨基酸序列SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3 和SEQ ID NO:4。
31. 权利要求30的分离抗体，其中所述抗体选自以下的单克隆抗 体由标注为美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-7406的杂交瘤产 生的单克隆抗体及由标注为美国典型培养物保藏中心保藏号 PTA-7808的杂交瘤产生的单克隆抗体。
32. 权利要求30的分离抗体，其中所述抗体包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:5、 SEQIDNO:6、 SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
33. —种用于治疗或预防需要所述治疗或预防的患者的淀粉样变 性的方法，该方法包括以足以实现所述治疗或预防的量给予所述患者 权利要求1或权利要求2所述的抗体。
34. 权利要求33的方法，其中所述淀粉样变性是阿尔茨海默病或 唐氏综合征淀粉样变性。
35. —种分离抗体，所述抗体与患有淀粉样变性的患者脑内的淀 粉状P蛋白的至少一个表位结合。
36. 权利要求35的分离抗体，其中所述抗体由具有选自 PTA-7406和PTA-7808的ATCC保藏号的杂交瘤产生。
37. —种在疑似患有阿尔茨海默病的患者中诊断该病的方法，该 方法包括以下步骤a. 从所述患者体内分离出生物样品；b. 在足以形成抗原/抗体复合物的条件下，使所述生物样品与权 利要求1或权利要求2的所述分离抗体接触一段时间；c. 检测所述样品中所述抗原/抗体复合物的存在情况，所述复合 物存在表明在所述患者中诊断出阿尔茨海默病。
38. 权利要求37的方法，其中所述抗原是球聚体。
39. —种在疑似患有阿尔茨海默病的患者中诊断该病的方法，该 方法包括以下步骤a. 从所述患者体内分离出生物样品；b. 在足以形成抗体/抗原复合物条件下，使所述生物样品与抗原 接触一段时间；c. 在足以使缀合物与结合抗体结合的条件下，将所述缀合物加到 所得抗体/抗原复合物中一段时间，其中所述缀合物包含权利要求1或 权利要求2的所述分离抗体，所述分离抗体连有能够产生可^r测信号 的信号产生化合物；和d.通过检测所述信号产生化合物产生的信号，以检测可能存在于 所述生物样品中的抗体的存在情况，所述信号表明在所述患者中诊断 出阿尔茨海默病。
40. 权利要求28的方法，其中所述抗原是球聚体。
41. 一种在疑似患有阿尔茨海默病的患者中诊断该病的方法，该 方法包括以下步骤a. 从所述患者体内分离出生物样品；b. 在足以形成抗抗体/抗体复合物的条件下，使所述生物样品与 抗抗体接触一段时间，其中所述抗抗体对权利要求1或权利要求2的 所述抗体有特异性，所述复合物含有存在于所述生物样品中的抗体；c. 在足以使缀合物与结合抗体结合的条件下，将所述缀合物加到 所得到的抗抗体/抗体复合物中 一段时间，其中所述缀合物包含抗原， 所述抗原能够与产生可检测信号的信号产生化合物结合；和d. 检测由所述信号产生化合物产生的信号，所述信号表明在所述 患者中诊断出阿尔茨海默病。
42. —种疫苗，所述疫苗包含a)权利要求1的所述分离抗体、 权利要求2的所述分离抗体或其组合，和b)药学上可接受的佐剂。
43. —种鉴定化合物的方法，所述化合物适于使预测将发生阿尔 茨海默病的患者主动免疫，该方法包括以下步骤a) 在足以使所述一种或多种化合物与权利要求1或权利要求2 的所述分离抗体结合的条件下，将一种或多种目标化合物暴露于权利 要求1或权利要求2的所述分离抗体中 一段时间；和b) 鉴定出与权利要求1或权利要求2的所述分离抗体结合的化 合物，所述鉴定出的化合物可用于使预测将发生阿尔茨海默病的患者 主动免疫。
44. 一种诊断盒，所述诊断盒包括a)权利要求1或权利要求2所述的分离抗体，和b)包含连有信 号产生化合物的抗体的缀合物，其中所述缀合物的所述抗体不同于所述的分离抗体。
45. —种诊断盒，所述诊断盒包括a)抗权利要求1或权利要求2 的所述分离抗体的抗抗体，和b)包含连有信号产生化合物的抗原的缀 合物。
46. 权利要求46的诊断盒，其中所述抗原是球聚体。
全文摘要
本发明涉及可用于治疗和诊断阿尔茨海默病的单克隆抗体。具体地讲，本发明涉及称为10F4和3C5的单克隆抗体以及具有类似性质的其它单克隆抗体(例如鼠、人或人源化单克隆抗体)。
文档编号A61K39/395GK101652146SQ200780050665
公开日2010年2月17日 申请日期2007年11月29日 优先权日2006年11月30日
发明者A·R·施特里宾格, B·拉布科夫斯基, H·希伦, P·凯勒, S·巴霍恩, U·埃贝尔特 申请人:艾博特公司;艾博特股份有限两合公司