专利名称：从柠檬酸废菌丝体中提取分离壳聚糖的方法
技术领域：
本发明涉及从柠檬酸废菌丝体中提取分离壳聚糖的方法。
背景技术：
壳聚糖及其衍生物可被广泛用于医药、化妆品、食品、化工、农业、生物技术、高分子材料等许多领域。当前市场上出售的壳聚糖主要来自虾、蟹等的外壳，制备工艺成熟，已经工业化生产，但该工艺存在着原料产地及分散性、季节性、品质的差异性等许多固有的缺点，这些给甲壳素的提取带来了困难。在甲壳素和壳聚糖生产的原料来源上，人们忽视了另一重要途径，即微生物中的甲壳素和壳聚糖，其实在子囊菌纲、担子菌纲、藻类纲及半知菌纲等真菌细胞壁中的含量是十分可观的(甲壳素含量为菌体干重的20％～22％)。从菌丝体中提取的壳聚糖与用虾壳生产的壳聚糖相比非常接近，但其对金属离子(如Cu、Hg)的吸附能力远大于虾壳来源的壳聚糖，特别适用于含重金属离子较多的废水；且用菌丝壳聚糖制成的食品保鲜剂的抗菌(对乳酸菌、枯草菌等)能力比虾壳来源的壳聚糖高1～2倍。
柠檬酸工厂是生产柠檬酸的专业厂家，在柠檬酸生产过程中，有大量的副产物废菌体产生，这些废菌体中含有较大比例的甲壳素，如果这些废菌体被弃掉，不仅会造成资源的浪费，而且会带来严重的环境污染。从各种微生物的甲壳素和壳聚糖含量来看，黑曲霉的甲壳素含量较高，柠檬酸发酵所用的菌株为黑曲霉，在以薯干为原料的发酵过程中，每生产1吨柠檬酸可产生500kg左右的干滤渣，其中含160kg左右的干菌体，即在发酵液中菌丝体的含量为20g/L左右，黑曲霉菌丝体中壳聚糖按20％计，其壳聚糖产率可达到4.0g/L。我国是一个大规模的柠檬酸生产国，且生产厂家也相对集中，每年可产生近百万吨的废菌体，这些菌体的排放不仅会带来严重的环境污染，而且会造成壳聚糖生产原料的巨大浪费。
在国外，有关从真菌中提取甲壳素和壳聚糖的报道越来越多，但未见利用发酵工厂废菌体制备甲壳素和壳聚糖的文献报道。在国内，娄永江采用胶体磨处理柠檬酸工厂废渣，使菌丝体颗粒变细，水溶性物质最大限度地溶出，同时采用浓碱分段处理提取甲壳素和壳聚糖，所得产品的分子量为7.89×104，脱乙酰度为96.82％，壳聚糖相对干菌体的得率为3.35％；赵继伦等采用酸碱交替法脱柠檬酸发酵工厂废菌体的蛋白，然后利用浓碱液脱乙酰基制备壳聚糖；曹健等人研究采用电解法和间歇提取法提取柠檬酸发酵工厂废菌体中的甲壳素和壳聚糖。但这些研究所得产品的分子量低，提取收率低，提取过程会带来较多的环境污染物。
发明内容
本发明提供了一种从柠檬酸废菌丝体中提取分离壳聚糖的方法，该方法提取的壳聚糖分子量、提取收率较高，对环境带来的污染低。
产品的应用范围广，且该工艺与传统的酸碱水解提取法相比，提取过程产生较少的废水。
本发明提供的技术方案是从柠檬酸废菌丝体中提取分离壳聚糖的方法，将柠檬酸生产过程中的副产物废菌丝体在胶体磨中处理1～1.5小时，将用胶体磨处理过的菌丝体，按1克菌丝体2-5mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液的比例，置入0.2M pH6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中，加入枯草芽孢杆菌产生的中性蛋白酶，于50～55℃连续搅拌2～3小时，收集固形物，按1克固形物2-5mLTris-HCl缓冲溶液的比例，置入50mM pH6.0～8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，加入甲壳素脱乙酰酶，于50～55℃连续搅拌6～8小时，收集固形物，用10～30g/升醋酸溶液提取壳聚糖，用NaOH调pH7.5～8.0沉淀，离心分离得壳聚糖，沉淀物用去离子水及75～95％乙醇洗涤，离心分离干燥后即得壳聚糖。
上述枯草芽孢杆菌产生的中性蛋白酶的用量为废菌丝体的0.05～0.30wt％。
上述甲壳素脱乙酰酶为蓝色犁头霉(Absidia coerulae)产生的甲壳素脱乙酰酶，甲壳素脱乙酰酶的用量为每百克废菌丝体加入800～2000units。
本发明采用胶体磨破碎细胞及多种酶连续作用相结合来处理柠檬酸发酵工厂废菌体，使细胞膜中的物质释放出来、细胞壁中的蛋白质被降解去除、脱去细胞壁中甲壳素的N-乙酰基等，最后提取壳聚糖。该工艺所得产品的分子量、提取收率比传统的酸碱水解提取法高，且该工艺与传统的酸碱水解提取法相比，提取过程产生较少的废水，环境污染将大幅度的降低。
具体实施例方式
将新鲜的柠檬酸工厂废菌体(原料来自湖南银海石油化工有限公司。由于目前国内生产柠檬酸的厂家均采用黑曲霉为菌种，且工艺基本相似，因此不同厂家的废菌体组成相似，结果基本没有区别。)在胶体磨中反复处理1～1.5小时，然后，按1∶3(g/ml)的比例加入到0.2MpH6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4的缓冲溶液中，加入0.17％(g/g废菌丝体)枯草芽孢杆菌产生的中性蛋白酶脱蛋白，于12000转20分钟离心收集固形物，洗涤三次，按1∶3(g/ml)的比例加入到50mM pH6.0～8.5Tris-HCl的缓冲溶液中，加入1200units％(1unit/g废菌丝体，1unit是指每毫克酶每分钟催化六聚N-乙酰氨基葡萄糖产生1μmol乙酰基)的Absidia coerulae(蓝色犁头霉)产生的甲壳素脱乙酰酶进行脱乙酰基，于12000转20分钟离心收集固形物，水洗涤三次，用1～3％(g/ml)醋酸溶液提取壳聚糖，用NaOH调pH7.5～8.0沉淀，离心分离得壳聚糖，沉淀物用去离子水及75～95％(ml/ml)乙醇各洗涤三次，离心分离干燥后即得壳聚糖。
按照上述提取过程，原料中蛋白质的脱除率为58.9％，壳聚糖的提取率为50.0％，平均分子量为267.97kDa，产品中壳聚糖的含量为84.4％，脱乙酰度为73.6％，与化学提取法(蛋白质的脱除率为62.3％，壳聚糖的提取率为41.7％，平均分子量为84.04kDa，产品中壳聚糖的含量为82.7％，脱乙酰度为76.8％)相比，酶法提取所得产品的提取率、分子量、壳聚糖含量都比化学法提取高。
权利要求
1.从柠檬酸废菌丝体中提取分离壳聚糖的方法，其特征在于将柠檬酸生产过程中的副产物废菌丝体在胶体磨中处理1～1.5小时，将用胶体磨处理过的菌丝体，按1克菌丝体2-5mLNa2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液的比例，置入0.2M pH6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中，加入枯草芽孢杆菌产生的中性蛋白酶，于50～55℃连续搅拌2～3小时，收集固形物，按1克固形物2-5mLTris-HCl缓冲溶液的比例，置入50mM pH6.0～8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，加入甲壳素脱乙酰酶，于50～55℃连续搅拌6～8小时，收集固形物，用10～30g/升醋酸溶液提取壳聚糖，用NaOH调pH7.5～8.0沉淀，离心分离得壳聚糖，沉淀物用去离子水及75～95％乙醇洗涤，离心分离干燥后即得壳聚糖。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于枯草芽孢杆菌产生的中性蛋白酶的用量为废菌丝体的0.05～0.30wt％。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于甲壳素脱乙酰酶为蓝色犁头霉(Absidiacoerulae)产生的甲壳素脱乙酰酶，甲壳素脱乙酰酶的用量为每百克废菌丝体加入800～2000units。
全文摘要
从柠檬酸废菌丝体中提取分离壳聚糖的方法，将柠檬酸生产过程中的副产物废菌丝体在胶体磨中处理1～1.5小时，将用胶体磨处理过的菌丝体，置入0.2M pH6.0～8.0的Na
文档编号C08B37/08GK1629197SQ20041006098
公开日2005年6月22日 申请日期2004年10月19日 优先权日2004年10月19日
发明者杜予民, 蔡俊, 杨建红, 邱雁临 申请人:武汉大学